Способ иммобилизации клеток микроорганизмов

 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам иммобилизации клеток микроорганизмов в частицы полимерного геля. Цель изобретения - упрощение способа повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток. В качестве гелеобразующего раствора используют водный раствор полимера класса N-виниламидов, а гранулы с иммобилизованными клетками получают при добавлении суспензии клеток в этом растворе к водно-солевому раствору, содержащему в качестве стабилизатора полимерной дисперсии танин , при температуре 29-40°С. Способ иммобилизации позволяет повысить ферментативную активность клеток (сорбитолдегидрогеназную - в 1,2-1,6 раза, гидроксилирующую - в 1,6 раза) при сохранении ее операционной стабильности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. Ё Qs 00 XI С СП

СОЮЗ (:ОП l< КИХ

СОЦИАЛИ(1И ll (:кИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s С 12 N 11/04, 11/08.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРНП ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4751232/13 (22) 23.10.89 (46) 30.10.91. Бюл. ¹ 40 (71) Институт биоорганической химии им.

M.M.ØåìÿêèHà, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт тонкой химической технологии им.

М, В,Ломоносова (72) М.B.Äoíoâà, Е.А.Марквичева, И.Ф.Кузькина, А,И,Кузнецов, Т,Г.Баклашева, К.А.Кощеенко, Ю,Э.Кирш, Т,М.Карапутадзе, Г.А.Симакова, И.А.Грицкова, В,П,Зубов и И,И.Пашкин (53) 577,15.07 (088.8) (56) Донова М.В., Борман Е.А., Кощеенко

К.А. и др. Окисление сорбита в сорбозу инкубированными в питательной среде иммобилизованными клетками Gluconobacter

oxydans, — Прикладная биохимия и микробиология, 1988, т. XXIV, вып. 3, с. 368 — 374.

Baklashova Т.G., Koshcheyenko К.А„

Skryabln G,K. Hydroxylation of indolyl-3acetic acId by immobilized mycelium of

A s p e r g l l l u s niger, — A p p i. M i c rob l o l

Biotechnol. 1984, v, 19, 4, р. 217-224.

Аксенов А.И„Кондратьев Н.В„Демидов Н,В, и др. Журнал общей химии, Т. 57, 1987, вып. 7, с. 1634 — 1637.

Кирш Ю.Э„Суев T,А., Карапутадзе Т.M. и др, Высокомолекулярные соединения. Т. А

21, 1979, № 12, с. 2734 — 2740, Поморцева Н.В., Красильникова Т,Н.

Химико-фармацевтический журнал, 1978, №

8, с. 88.

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам иммобилизации клето (микроорганизмов в частицы полимерного геля, и может быть использовано в пище ой, медицинской и. SU, 1687615 А1 (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК

МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам иммобилизации клеток микроорганизмов в частицы полимерного геля.

Цель изобретения — упрощение способа повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток. В качестве гелеобразующего раствора используют водный раствор полимера класса N-виниламидов, а гранулы с иммобилизованными клетками получают при добавлении суспензии клеток в этом растворе к водно-солевому раствору, содержащему в качестве стабилизатора полимерной дисперсии танин, при температуре 29-40 С. Способ иммобилизации позволяет повысить ферментативную активность клеток (сорбитолдегидрогеназную — e 1,2 — 1,6 раза. гидроксилирующую — в 1,6 раза) при сохранении ее операционной стабильности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. микробиологической промышленности для трансформации органических соединений и получения продуктов микробного синтеза, Максимальная сорбитолдегидрогеназная актк.вность Gluconobacter oxydan

1687615

R< — СН3; Rz — СЗНт, R) — C2H5, R2 — С2Н5, R1 C3H7, R2 СН3

Н2е Ñн 0

М С р ъ 1

Данные об использовании каких-либо полимеров класса N-виниламидов для получения иммобилизованных клеток при анализе данной и смежных областей техники не выявлены.

Синтез мономеров N-виниламидов алифатических карбоновых кислот описан, синтез полимеров и сополимеров также.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят стерильные растворы полимеров и стабилизатора дисперсии, клеточную суспензию смешивают с раствором полимера при комнатной температуре. Полученную смесь подают по каплям в подогретый до 29 — 40" С буферный или физиологический раствор, содержащий 0,5-1,0,ь танина, при перемешивании. При этом образуются гранулы геля с включенными в них клетками микроорганизмов. Полученные гранулы промывают физиологическим или буферным раствором для удаления избытка тани56,3 мМоль/мл гранул в 1 ч, при введении трансформации в присутствии 0,1 -ного дрожжевого экстракта операционная стабильность при этом составляет 14 сут, Гидроксилиоующая активность Aspergillus

niger 0,49 10 мМоль/мл гранул в 1 ч, стабильность 10 сут.

Цель изобретения — упрощение способа, повышение ферментативной активности иммобилизованных клеток.

Способ основан на том, что в качестве гелеобразующего раствора используют водный раствор полимера класса N-виниламидов с мол,м, 125.10 — 1 10, а гранулы б с иммобилизованными клетками получают при добавлении суспензии клеток в гелеобразующем растворе к водно-солевому раствору, содержащему в качестве стабилизатора танин, при 29 — 40"С.

Полученные гранулы промываютфиэиологическим или буферным раствором ат избытка стабилизатора и невключившихся клеток, переносят в среду и используют для трансформации.

В качестве полимера для получения иммобилиэованных клеток микроорганизмов используют полимеры из класса

N-виниламидов, конкретно поли-N-винилкапролактам (ПВК), а также сополимеры метилакрилата, метилметакрилата, винилацетата с ПВК и N-виниламидами следующего строения, 10

55 на и невключившихся клеток, переносят в среду и используют для трансформации.

С целью предотвращения слипания гранул в ходе многократных периодических трансформаций гранулы по завершении очередной трансформации промывают физиологическим или буферным раствором, содержащим танин в концентрации 0,05 Д, Все операции проводят (по возможности) в асептических условиях.

Для осуществления способа иммобилизации используют бактерии Gluconobacter

oxydans штамм ВНИВИ-6, окисляющие

0-сорбит в L-сорбозу и грибы Aspergillus

nIger ВКМ F-212, гидроксилирующие индолил-3-уксусную кислоту с получением 4, 5 и

6-оксипроизводных, Сорбитолдегидрогеназную активность оценивают по скорости накопления сорбоэы в культуральной жидкости. Концентрацию сорбозы определяют по методу определения редуцирующих сахаров и выражают в мМоль/мл гранул в 1 ч.

Гидроксилазную активность оценивают по скорости накопления продуктов реакции в культуральной жидкости и выражают в процентах концентрации исходного субстрата в единицу времени. Концентрацию продуктов реакции оценивают методом тонкослойной хроматографии.

Операционную стабильность ферментативной активности иммобилизованных клеток оценивают по продолжительности трансформаций, в которых снижение ферментативной активности не превышает 50-,ь от исходной, и выражают в сутках.

Пример 1. 10 мл суспензии клеток

Cluconobacter oxydans штамм ВН IBM-6, содержащей 114 мг клеток (по сухому веществу), выращенных до стадии замедления роста (в течение 16 — 18 ч) на среде, содержащей сорбит и дрожжевой экстракт, и отмытых от ростовой среды стерильным физиологическим раствором, смешивают с

10 мл гелеобраэующего раствора — 5,4; -ного стерильного водного раствора поли-N-винилкапролактама (ПВК) с мол.м. 900000 (конечная концентрация ПВК 2,7-",ь). Полученную суспензию с помощью шприца по каплям добавляют к 150 мл стерильного физиологического раствора, содержащего

0,5 танина, при 37 С. Образующиеся полимерные гранулы с иммобилизованными клетками промывают физиологическим раствором, переносят в трансформационную среду, содержащую 100 г/л сорбита и 0,1 дрожжевого экстракта (рН 5,5-5,8), И используют для трансформации D- сорбита в

1=со р бозу.

1687615

Процесс трансформации осуществляют в стандартных условиях в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл трансформационной среды и 20 мл гранул, при перемешивании на качалке со скоро- 5 стью 220 об/мин и при температуре 30 С.

По окончании трансформации (в среднем через 24 ч) гранулы отделяют, промывают физиологическим раствором, содержащим

0,05 % танина, и используют для проведения 10 последующих трансформаций.

Максимальная сорбитолдегидрогеназная активность 91 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

Пример 2. Способ осуществляют по 15 примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора для получения гранул используют сополимер N-винилкапролактама с N-винилацетатом (содержание N-винилацетата

15 мас. /), имеющий молекулярную массу 20

200000 при концентрации 7,2о (конечная концентрация 3,6 ). Полимерные гранулы получают, используя физиологический раствор, содержащий 0,7 танина, при 29ОС.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- 25 ная активность 83 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 14 сут.

Пример 3, Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора используют 10,8 -ный раствор 30 поли-N-винилкапролактама с мол.м. 1 10 .

Максимальная сорбитолдегидрогеназная активность 96 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

Пример 4, Способ осуществляют по 35 примеру 1, но в качестве гелеобразующего раствора используют 7,2 -ный водный раствор сополимера N-этил-N-виниламида масляной кислоты с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 10 мас. ), 40 имеющего мол,м, 350000. Полимерные гранулы получают, используя физиологический раствор, содержащий 1 танина, подогретый до 40 С.

Максимальная сорбитолдегидрогеназ- 45 ная активность 66 мМоль/мл гранул в 1 ч, стабильность 14 сут.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, но берут 10,8 -ный раствор сополимера N-метил-N-виниламида масля- 50 ной кислоты с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 15 мас. ) с мол,м. 250000, Полимерные гранулы получают, используя 0,01 М фосфатный буфер (рН 5,5), содержащий 0,7 танина, при 55

38 С.

Максимальная сорбитолдегидрогенаэная активность 74 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 14 сут.

Пример 6. Способ осуществляют по примеру 1, но берут 10,8 -ный раствор сополимера N-этил-N-виниламида пропионовой кислоты с метилакрилатом (содержание метилакрилата 13 мас. ) с мол.м. 300000.

Гранулы получают, используя физиологический раствор, подогретый до 39 С, Максимальная сорбитолдегидрогенаэная активность 68 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

Пример 7. Способ осуществляют по примеру 1, но используют 5,4 -ный раствор сополимера N-винилкапролактама с метилметакрилатом (содержание метилметакрилата 10 мас. ) с мол.м. 300000. Гранулы получают, добавляя по каплям полученную суспензию клеток в физиологический раствор, содержащий 0,7 танина, подогретый до 30 С.

Максимальная сорбитолдегидрогеназная активность 89 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут, Пример 8. Способ осуществляют по примеру 1, но гранулы получают при добавлении гелеобразующего раствора с клетками в 0,01 М фосфатный буфер (рН 5,8), содержащий 0,5 танина, при температуре

40oÑ.

Сорбитолдегидрогенаэная максимал ьная активность 94 мМоль/мл гранул в 1 ч, операционная стабильность 15 сут.

В табл,1 приведены результаты иммобилизации клеток 61исолоЬастег oxydans

ВНИВИ-6, Пример 9. Культуру Aspergil)us niger

ВКМ F-212 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Для получения споровой суспензии делают смыв с косяка 5 мл стерильной водопроводной воды (1 мл суспензии содержит 31,5 10 спор), 5 мл споровой суспенэии смешивают с

5 мл гелеобразующего раствора — 10,8 -но-. го водного раствора ПВК с мол.м. 9.10 .

Полученную суспенэию с помощью шприца по каплям добавляют к 75 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 5,5), содержащего 0,5 танина, при 37 С и слабом перемешивании.

Полученные гранулы выдерживают в этом растворе беэ перемешивания еще в течение

40 мин. Затем гранулы промывают стерильным физиологическим раствором, переносят в коническую колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл сусла

7 Г, и перемешивают на качалке со скоростью 200 об/мин при 28 С в течение 24 ч. За это время из включенных в гель спор развивается мицелий. Таким образом, полученный иимобилизованный мицелий (16 мг/мл геля) отделяют от ростовой среды мно1687615

Таблица 1 ли- Максимальная сс ми

Моль/мл гран час

91

83

96

66

74

68

89

П р и м е ч а н и е, Средняя продолжительность одной трансформации 22 — 24 ч, гократной декантациеи в асептических условиях, промывают стерильным физиологическим раствором и используют для трансформации, Последнюю проводят в конических колбах Эрленмейера объемом

750 мл 0,01 M фосфатного буфера (рН 5,5), куда помещают 20 мл гранул и 1,0 мл этанольного раствора индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), содержащего 50 мг ИУК. Колбы помещают на качалку (220 об/мин при

28 С). Контроль за ходом трансформации осуществляют методом качественной и количественной тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol LIV-254.

В описанных условиях гидроксилирование полностью проходит за 12 — 15 ч трансформации с образованием 55-60%

5-ОН-ИУК и 40 — 45% 4-ОН-ИУК. После проведения транформации гранулы, отделенные от трансформационной среды, и ромы вают стерильным ф,зиологическим раствором и используют для последующих трансформаций. Возможно проведение восьми последовательных трансформаций без снижения активности, Гидроксилирующая активность иммобилизованной системы сохраняется в течение 30 сут, что свидетельствует о стабилизации гидроксилирующей активности в процессе иммобилизации.

В табл,2 представлены сравнительные данные по гидроксилирующей активности и стабильности, полученные по предлагаемому и известному способам (результаты иммобилизации клеток Aspergillus niger ВКМ

F-212).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить ферментативную активность (сорбитолдегидрогеназную — в

1,2 — 1,6 раза, гидроксилирующую — в 1,6

5 раза) при сохранении ее операционной стабильности (14 — 15 сут — для сорбитолдегидрогеназной активности, 5 сут — для гидроксилирующей активности).

Формула изобретения

10 1, Способ иммобилизации клеток микроорганизмов, предусматривающий смешивание суспензии клеток с водным раствором полимера и гранулообразование, отличающийся тем, что, с целью

15 упрощения способа, повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток, используют водный раствор полимера из класса N-виниламидов с мол,м, 125000—

1000000 и концентрацией, обеспечивающей

20 2,7-54%-ное содержание его в смеси с суспензией клеток, а гранулообразование осуществляют добавлением по каплям полученной смеси в водно-солевой раствор, содержащий в качестве стабилизатора

25 0,5 — 1,0% танина, при 29 — 40 С, 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве водного раствора полимера из класса N-виниламидов используют водный раствор поли-N-винилкапролактама

30 или сополимера N-винилкапролактама с Nвинилацетатом, или сополимера N-этил-Nвиниламида масляной или пропионовой кислоты с метилметакрилатом, или сополимера N-винилкапролэктама с метилметак35 рилатом.

1687615

Таблица 2

Составитель С, Скородумова

Редактор М. Петрова Техред М.Моргентал Корректор В. Гирняк

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5