Способ получения иммобилизованных нуклеофильных соединений

 

Изобретение относится к способу иммобилизации биологически активных соединений , содержащих нуклеофильные группы - у-аминомасляной кислоты, глюкозы, альбумина бычьей, сыворотки, глюкозооксидазы и каталазы. Изобретение позволяет повысить стабильность полученных продуктов за счет Изобретение относится к способу иммобилизации биологически активных соединений , содержащих нуклеофильные группы, таких как у-аминомасляная кислота, глюкоза , альбумин бычьей сыворотки, глюкозооксидаза и каталаза. Цель изобретения - повышение стабильности целевых продуктов. Пример1.30г ксерогеля акрилекс Р-100 (сополимер акриламида и N.N -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 1200 мл 0,1 М фосфатного калиевого буфера (рН 8), того, что активизируют сополимер акриламида с N.N-метиленбисакриламидом путем добавления к суспензии сополимера в фосфатном буфере с рН 8 раствора п-бензохинона в водном диоксане при концентрации n-бензохинона в реакционной смеси 50 ммоль/л и реакционную смесь выдерживают при 50°С в течение 24 ч. Полученный гель промывают и подвергают взаимодействию с нуклеофильным соединением - у-аминомасляной кислотой, глюкозой, альбумином бычьей сыворотки, глюкозооксидазой или каталазой. Взаимодействие проводят путем добавления к гелю активированного сополимера раствора нуклеофильного соединения в буферной смеси с рН 3-9 и концентрацией у-аминомасляной кислоты и глюкозы 0,01 моль/л, а остальных соединений - 20 мг/мл. Смесь выдерживают при 4°С в течение 24 ч при конечной концентрации у-аминомасляной кислоты и глюкозы 2,5 ммоль/л, а остальных нуклеофильных соединений - 5 мг/мл, 1 табл. после чего к полученной суспензии добавляют 0,25 моль n-бензохинона в 20%-ном растворе диоксана (300 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50°С. Концентрация п-бензохинона в смеси равна 50 ммоль/л. Набухший гель отделяют и последовательно промывают 3 л 20%-ного раствора диоксана и 10 л дистиллированной воды. Отмытый гель лиофилизируют. В результате получают 24,3 г активированного носителя. П р и м е р 2. 0,1 г ксерогеля акрилекс Р-100 (сополимер акиламида и N.N -метиО о о ел fc со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3636515/05 (22) 23.08.83 (31) 2719/82 (32) 24.08.82 (33) HU (46) 07.11.91. Бюл, № 41 (71) Реанал Финомведьсердьяр (HU) (72) Жужанна Антал, Ева Беллер, Ласло Борошш, Иван Дароци, Миклош Кальман, Имре Шюте и Бела Сайани (HU) (53) 678.745(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 530886, кл. С 12 N 11/08, 1975. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОФИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к способу иммобилизации биологически активных соединений, содержащих нуклеофильные группы— у-аминомасляной кислоты, глюкозы, альбумина бычьей сыворотки, глюкозооксидазы и катал азы. Изобретение позволяет повысить стабильность полученных продуктов за счет

Изобретение относится к способу иммобилизации биологически активных соединений, содержащих нуклеофильные группы, таких как у-аминомасляная кислота, глюкоза, альбумин бычьей сыворотки, глюкозоокси- даза и каталаза.

Цель изобретения — повышение стабильности целевых продуктов.

Пример 1, 30 г ксерогеля акрилекс

Р-100 (сополимер акриламида и N,N -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 1200 мл

0,1 M фосфатного калиевого буфера (рН 8), »!Ж 1690544 А3 (я)ю С 08 F 220/56, С 12 N 11/08 того, что активизируют сополимер акриламида с N,N-метиленбисакриламидом путем добавления к суспензии сополимера в фосфатном буфере с рН 8 раствора п-бензохинона в водном диоксане при концентрации и-бензохинона в реакционной смеси

50 ммоль/л и реакционную смесь выдерживают при 50 С в течение 24 ч. Полученный гель промывают и подвергают взаимодействию с нуклеофильным соединением — у-аминомасляной кислотой, глюкозой, альбумином бычьей сыворотки, глюкозооксидазой или каталазой. Взаимодействие проводят путем добавления к гелю активированного сополимера раствора нуклеофильного соединения в буферной смеси с рН 3-9 и концентрацией y аминомасляной кислоты и глюкозы 0,01 моль/л, а остальных соединений — 20 мг/мл. Смесьвыдерживают при 4 С в течение 24 ч при конечной концентрации

1 -аминомасляной кислоты и глюкозы

2,5 ммоль/л, а остальных нуклеофильных соединений — 5 мг/мл. 1 табл. после чего к полученной суспензии добавляют 0,25 моль и-бензохинона в 20 -ном растворе диоксана (300 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С. Концентрация и-бензохинона в смеси равна 50 ммоль/л. Набух- () ший гель отделяют и последовательно промывают 3 л 20 -ного раствора диоксана и 10 л дистиллированной воды. Отмытый гель лиофилизируют. В результате получают 24,3 г активированного носителя.

Пример 2, 0,1 г ксерогеля акрилекс

P-100 (сополимер акиламида и N,N -метиI

1690544 лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1 M буфера (рН 8), после чего к полученной суспенэии добавляют раствор 0,25 моль ибензохинона в 20 -ном растворе диоксана (i,G мл) (концентрация и-бензохинона 50 ммоль/л) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С. Набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20ф,-ного раствора диоксана в 70 мп дистиллированной воды.

Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл 0,01-малярного раствора аминомасляной кислоты. Для растворения уаминомасляной кислдты используют

0,1-молярный раствор калийнатрийфосфатного буфера (рН 7,5). Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, гель отделяют, а несвязанную y"àìèíîìàñëÿíóþ кислоту удаляют путем промывки 0,1-молярным раствором натрийацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1,0 моль хлористого натрия и

0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8.5). Количество связанной у аминомасляной кислоты составляет 4,0 мкмоль, что соответствует 20ь от всего ее количества в реакционной смеси.

Пример 3. 0,1 г ксерогеля акрилекс

Р-100 (сополимер акриламида и N,N -метиl лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0).

После добавки к суспензии раствора 0,25 моль и-бензохинона в 20 ь-ном растворе диоксана (1,0 мл) ее оставляют стоять в течение 24 ч при 50"С, Затем набухший гель отделяют и последовательно промывают

70 мл 20 -ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды.

Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл). Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют

0,1-моля рн ый натрийформиатный буферный раствор (рН 3,0). Суспенэию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют и удаляют несвязанный альбумин сыворотки путем последовательной промывки 0,1-молярным раствором натрийацетатного буфера (рН 5,0), содержащего, 1,0 моль хлористого натрия и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8,5). Количество связанного альбумина бычьей сыворотки составляют 10 мг. Выход 25$ в расчете на добавляемый к реакционной смеси альбумин сыворотки.

Пример 4, 0,1 г ксерогеля акрилекс

Р-100 (сополимер акриламида и N,N -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего добавляют к полученной суспенэии раствор 0,25 моль и-бензохинона в 20 ном растворе диоксана (1,0 мл) и составляют ее состоять в течение 24 ч при 50 С, Затем набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20 -ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды, An.ивированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему

2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл), Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют 0,1-малярный калийнатрийфосфатн ый буфер (р Н 6,0), Суспензию выдерживают в течение 24 ч при

4 С, после чего гель отделяют, а несвязанный альбумин сыворотки удаляют путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером (рН 5,0), содержащим 1,0 моль хлористого натрия, и 0,1молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8,5). Количество связанного альбумина сыворотки составляет 4,5 мг, что соответствует 11,25 от всего его количества в реакционной смеси.

Пример 5. 0,1 г ксерогеля акрилекс

P-100 (сополимер акриламида и N,N -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной суспензии добавляют раствор 0,25 моль и-бенэохинона в 20 ном растворе диоксана (1,0 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С.

Набухший гель отделяют и последовательно промывают 70 мл 20 -ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды.

Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему

2,0 мл раствора альбумина бычьей сыворотки (20 мг/мл). Для растворения альбумина бычьей сыворотки используют 0,1-молярный буферный раствор карбоната и бикарбоната натрия (рН 9,0). Суспенэию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют и удаляют несвязанный альбумин сыворотки путем последовательной промывки его 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0 моль хлористого натрия (рН 5,0), и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия, Количество связанного альбумина бычьей сыворотки составляет 5,0 мг, что соответствует 12,57ь от общего его количества в реакционной смеси.

Пример 6, 0,1 r ксерогеля акрилекс

P-100 (сополимер акриламида и N,N -метилен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-молярного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной суспензии добавляют раствор 0,25 моль и-бенэохинона в 207(,1690544

25,реакционной смеси

55 ном растворе диоксана (1 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С. Набухший гель отделяют и промывают последовательно 70 мл 20 -ного раствора диоксана.и 70 мл дистиллированной воды.

Активированный гель отфильтровывают на вакуумной фильтре и добавляют к нему 2,0 мл раствора глюкозооксидазы (20 мг/мл). Для растворения глюкозооксидаэы используют 0,1-молярный калийнатрийфосфатный буфер (рН 7,5). Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, гель отделяют, а несвязанный блок удаляют путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0 моль хлористого натрия (рН 5,0), и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН 8,5).

Количество связанного с гелем белка составляет 4,5 мг. Активность полученного продукта равна 7,2 ед,/г ксерогеля. Одна единица активности соответствует тому количеству фермента, которое обеспечивает каталитическое окисление 1,0 мкмоль Р-Оглюкозы в минуту при рН 7,0 и температуре

25 С. Удельная активность связанного фермента составляет 8 от удельной активности растворенного фермента.

Пример 7. 0,1 г ксерогеля акрилекс

P-100 (сополимер акриламида и N,N -мети- лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-моляоного фосфатного буфера (рН 8,0), после чего к полученной суспензии добавляют раствор 0,25 моль и-бензохинона в 20 ном растворе диоксана (1,0 мл) и выдерживают ее в течение 24 ч при 50 С.

Набухший гель отделяют и промывают последовательно 70 мл 20 -ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды.

Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему 2,0 мл раствора каталазы (20 мг/мл).

Для растворения каталаэы используют 0,1малярный раствор калийнатрийфосфатного буфера (рН 7,5), Суспенэию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, гель отделяют и удаляют несвязанный белок путем последовательной промывки 0,1-молярным натрийацетатным буфером, содержащим 1,0 моль хлористого натрия (рН 5,0) и 0,1-молярным раствором бикарбоната натрия (рН

8,5).

Количество связанного белка составляет 5,3 мг, активность полученного продукта равна 2100 ед./г ксерогеля. Одна единица активности соответствует тому количеству фермента, которое катализирует разложение 1 мкмоль перекиси водорода в минуту при 25 С, Удельная активность связанного фермента составляет 2 от удельной активности раствора фермента, Пример 8. 0,1 r ксерогеля акрилекс

P-100 (сополимер акриламида и N,N -мети1 лен-бис-акриламида) суспендируют в 4,0 мл

0,1-моля рн ого фосфатн ого буфера (р Н 8,0). после чего к полученной суспенэии добавляют раствор 0.25 моль и-бензохинона в 20%ном растворе диоксана (1,0 мл) и выдерживают суспензию в течение 24 ч при 50 С.

Набухший гель отделяют и промывают последовательно 70 мл 207,-ного раствора диоксана и 70 мл дистиллированной воды, Активированный гель отфильтровывают на вакуумном фильтре и добавляют к нему

2,0 мл 0,01-молярного раствора глюкозы в

0,1-молярном растворе калийнатрийфосфатного буфера (рН 7,5). Суспензию выдерживают в течение 24 ч при 4 С, после чего гель отделяют и удаляют несвязанную глюкозу путем последовательной промывки содержащим 1 моль хлористого натрия

0,1-молярным натрийацетатным буфером (рН 5,0) и 0,1-молярным раствором бикарброната натрия (рН 8,5), Количество связанной глюкозы составляет 6 мкмоль, что соответствует 307 от всего ее количества в

Все данные по примерам 1-8 сведены в

30 таблицу.

Пример 9 (демонстрирует стабильность полученных продуктов). Колонку размером 1,5х10 см заполняют 0,5 r иммобилиэованного препарата фермента, 35 полученного согласно примеру 6, активность которого составляла 23 ед, Через колонку пропускают в условиях промышленного процесса при 25 С и со скоростью 12 мл/ч 0,25-молярный водный

40 раствор глюкозы. Количество продукта в вытекающем потоке оставалось неизменным в течение 51 дня (1224 ч). Это доказывает. что фиксированный препарат фермента сохраняет свою активность.

45 Применение перепарата инвертаэы, полученного известным способом, для процесса гидролиза показало, что активность препарата падает в течение 100 ч работы.

Формула изобретения

Способ получения иммобилиэованных нуклеофильных соединений, включающий

1 активацию сополимера акриламида с N,N метиленбис-акриламидом и его взаимодействие с нуклеофильным соединением с последующей промывкой целевого продукта для удаления низкомолекулярных примесей. о т л и ч à ющи и с я тем,,что, с целью повышения стабильности целевых продуктов, активацию проводят путем добавления

1690544 к суспензии сополимера в фосфатном буфере с рН 8 раствора и-бензохинона в водном диоксане, при концентрации п-бенэохинона в реакционной смеси 50 ммоль/л, и выдержки реакционной смеси при 50 С в течение 24 ч с последующей промывкой полученного геля, в качесвте нуклеофильных соединений используют у-аминомасляную кислоту, глюкозу, альбумин бычьей сыворотки, глюкоэооксидазу или каталаэу и взаимодействие осуществляют путем добавлеСтадия имиоомлизации

24

24

24

24

24

24

2,5 имоль/л

5 иг/ил

5 мг/мл

5 иг/ил

5 мгlмл

5 мг/мя

2,5 ммоль/л

О, 01 мол ь/л

20 ит/ил

20 иг/мл

2п иг/ил

20 иг/мл

20 ит/мл

0,01 моль/л

7,5

6

Ч

/,5

7 S

7>5

Составитель О, Рокачевская

Техред М,Моргентал Корректор M.Ìàêñèìèøèíåö

Редактор Н.Яцола

Заказ 3829 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государсгвенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, )К-35, Раушская наб., 4/5

Производстве)(нп-из/1лт .7)ьский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 1 8 50 24

2 8 50 24

3 8 50 24

4 Е 50 24

Е 50 24

8 Е 50 24

Е 50 24

8 Е 50 24

50 ния к гелю активированного сополимера раствора нуклеофильного соединения в буферной смеси с рН 3-9 и концентрацией г -ЭМИНОМЭСЛЯ НОЙ КИСЛОТЫ И ГЛЮКОЗЫ

5 0,01 моль/л, а остальных нуклеофильных соединений — 20 мгlмл и выдержки смеси при 4 С втечение 24ч при конечной концентрации у-аминомасляной кислоты и глюкозы

2,5 ммоль/л, а остальных соединений—

10 5 мгlмл.