Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклонального антитела к фактору виллебранда системы свертывания крови человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения фактора Виллебранда (ФВ) с помощью специфических моноклональных антител. Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши - продуцента монАТ к ФВ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗХбЗАд 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных частично очищенным ФВ. МонАТ отбирают методом иммуноферментного анализа на том же антигене. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Штамм способен расти в виде асцитных опухолей в организме сингенных мышей. Класс монАТ Jg G1. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 317Д. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК е

pB i .," . т ;.,,;, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4752832/13 (22) 24.10.89 (46) 23.11.91. Бюл. N 43 (71) Научно-исследовательский институт онкологии им, проф. Н. Н. Петрова (72) В. С, Горностаев, А. Б. Олимпиева, А. О.

Данилов, 3. М. Чистякова, Д. Ф. Нягулов, Б.

Г. Торопова, В. Б. Окулов, П. В. Хролова и Л, П. Папаян (53) 578.085.23(088.8) (56) Meyer О., Zimmerman Т. S., Obert В, .Edlngton Т. S. Hybridoma antibodies to

human von Wlllebrand factor.l. Characterization of seven clones. Вг. J. Haematol.

1984, V, 57, р. 597-608. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ MOHOKROНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ ВИЛ Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунометрического определения фактора

Виллебранда с помощью специфических моноклональных антител (монАТ).

Цель изобретения — получение штамма гибридомы мыши — продуцента монАТ к ФВ.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под М

317Д. Авторское наименование 380Ф2.

Штамм получают следующим способом.

Мышей линии BaLb/с 1,5-2-месячного возраста иммунизируют дважды. одновременно внутрибрюшинно и подкожно по 6

ЕД на мышь с интервалом в 3 нед. Первая иммунизация антигеном в смеси с полным адьювантом Фрейнда, вторая без адьюванта. Через 72 ч после последней иммунизации проводят слияние 100х10 спленоцитов Ы, 1693046 А1 (я)ю С 12 N 5/20, С 12 P 21/08

ЛЕБРАНДА СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения фактора Виллебранда (ФВ) с помощью специфических моноклональных антител. Цель изобретения — получение штамма гибридомы мыши — продуцента монАТ к ФВ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы P3X63Ag 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных частично очищенным ФВ. МонАТ отбирают методом иммуноферментного анализа на том же антигене. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 107; сыворотки крупного рогатого скота. Штамм способен расти в виде асцитных опухолей в организме сингенных мышей. Класс монАТ Jg 61. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 317Д. иммунизированной мыши с 25х10 клеток мышиной миеломы x63Ag8.653.А, обрабатывая смесь клеток раствором полиэтиленгликоля (50 g,) с молекулярной массой 1000. Для выращивания гибридом используют фидерный слой из перитонеальных макрофагов мышей и среду Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ), содержащую 15 инактивированной нагреванием взрослых коров, 20 кондиционированной клетками х63.Ag8.653.À ростовой среды. В среду добавляют селективные добавки: гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Тестирование клонов-продуцентов проводят с помощью иммуноферментного анализа, В качестве сажаемого на твердую фазу антигена используют тот же аппарат, что был использованн для иммунизации. Первичный скрининг

1693046 билизируются введением внутрибрюшинно по 0,5 мл на мышь пристана или вазелинового масла эа неделю до прививки внутрибрюшинно каждой мыши 5,0х10 клеток.

Асцит образуется через 2-3 нед. в объеме

1,5-2,0 мл, Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах, постоянно выращиваемых без антибиотиков, показывает отсутствие бактерий, грибов, дрожжей и микоплазм, Клетки штамма 380Ф2 продуцируют в средуиммуноглобулины lgGI класса, Это показано в твердофаэном иммуноферментном

55 проводят прямым методом по схеме антиген — мышиные моноклональные антитела клонов-продуцентов — кроличий антимышиный иммунопероксидазный конъюгат.

Специфический скрининг проводят конку- 5 рентным иммуноферментным методом, используя коммерческую поликлональную кроличью антисыворотку к фактору УШ человека. В результате из 30 клонов положительных в первичном тексте отбирают 21 10 клон в специфическом конкурентном методе. Среди них для дальнейшей работы берут один клон, который дважды реклонируют методом предельных разведений на слое перитонеальных макрофагов мышей, 100% 15 полученных реклонов позитивны при тестировании на AT к фактору Виллебранда.

Один иэ полученных клонов (авторское название 380Ф2) реклонируют и эамораживают. 20

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Стандартными условиями культивирования штамма являются: температура 37 С, среда ДМЕМ или МЕМ с 10% инактивиро- 25 ванной сыворотки крупного рогатого скота, по 100 ЕД/MR пенициллина и стрептомицина, культивирование в герметично закрываемых флаконах Карреля или в чашках Петри ватмосферес5% СО ввоздухеи100%-ной 30 влажностью. Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или рыхлых агрегатов по 4-16 и более клеток, легко раэъединяющихся при встряхивании. Оптимальная посевная доза 0,5-1,0х10 клеток в 1 мл сре- 35

6 ды, Для поддержания культуры в пролиферирующем состоянии клетки рассевают. 2 раза в неделю с коэффициентом 1/8-1/10.

Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,0-1,2х10 40 кл/мл. Клетки в культуре выглядят прозрачными, округлыми, часть их прилипает к поверхности культуральных сосудов. Видовая принадлежность штамма подтверждается тем, что гибридные клетки прививаются мы- 45 шам линии BaLb/с. Для этого мыши сенсианализе с помощью серии моноспецифических кроличьих антисывороток к мышиным антителам классов lgG>, IgGza, !дбгв,!доз и

IgM. Специфичность антител оценивают в конкурентном иммуноферментном анализе с коммерческой сывороткой к фактору УШ

R:Ag и методом иммуногистохимического окрашивания эндотелиальных клеток пуповинной вены человека.

Криоконсервирование штамма проводят в среде следующего состава. %: среда

МЕМ или ДМЕМ 50; сыворотка крупного рогатого скота 40; диметилсульфоксид 10.

Замораживание осуществляют в следующем режиме: клетки в концентрации 1,05,0х10 кл/мл криосреды помещают на 24 ч

6 в ниэкотемпературный холодильнык (-70 C), после чего быстро переносят в жидкий азот.

Для размораживания ампулу из жидкого азота перекладывают в воду с температурой

40 С, через 5 мин клетки центрифугируют и помещают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 75-80% в тесте с трипановым синим.

Основанием для выделения гибридомного штамма 380Ф2 в качестве нового штамма является то, что клетки этого клона растут на среде с сывороткой крупного рогатого скота, что исключает использование дорогостоящей сыворотки эмбрионов коров, применяемой для культивирования близких штаммов.

Пример 1. Иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов пуповинной вены и кожи человека, Криостатные срезы пуповинной вены и кожи человека, фиксированные ацетоном и хлороформом в течение 10 мин, инкубируют при комнатной температуре с моноклональным антителом клона 380Ф2, затем последовательно с кроличьей антисывороткой к иммуноглобулинам мыши RAM (1:50) и PAPреагентом мыши (1:150). Время инкубации с моноклональными антителами 45 мин, далее по 30 мин и между этими процедурами — отмывки в трис-HCI буфере (10 мМ трис, 20

MM NaCI, рН 7.4) по 15 мин каждая. После последней промывки активность пероксидазы, входящей в состав PAP-реагента, выявляют инкубацией срезов в течение 5 мин в трис-HCI-буфере (50 MM трис. рН 7,6). содержащем 0,6 мгlмл диаминобензидина и 1 мкл/мл 33%-ного НгОг. Затем срезы отмывают в дистиллированной воде, окрашивают гемалауном Майера 5 мин, снова промывают в проточной воде и после обезвоживания заключают в бальзам. Для нейтраллизации эндогенной пероксидазы используют смесь глюкозы (10 мг/Mll) и глюкозоксидазы (0,75 ЕД/мл) на трис-Н С1-буфе1693046

Составитель Г.Игнатьева

Редактор О.Юрковецкая Техред М,Моргентал Корректор О. (ундрик

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР, 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ре (10 мМ трис, 20 мМ NaCI, pH 7,4), которая наносится одновременно с RAM. При микроскопии препаратов установлено, что клетки эндотелия пуповинной вены и сосудов кожи имеют диффузное окрашивание цитоплазмы коричневого цвета. При этом на контрольных срезах (обработка RAM u

PAP-реагентом) окрашивание отсутствует.

Пример 2. Использование моноклональных антител для определения уровня фактора Виллебранда в крови здоровых доноров и больных.

Лунки в планшетах заполняют раствором кроличьих поликлональных антител к фактору Виллебранда в разведении 1:2000 на фосфатно-солевом буфере А (0,14 мМ

NaCI, 0,2 MM КО, 8 мМ NazHzPOa, 1,5 мМ

КН2Р04. рН 7,2), инкубацию проводят в течение ночи при 4 С. Далее последовательно наносят человеческую плазму(1:100), мышиные моноклональные антитела к фактору

Виллебранда (культуральная жидкость в разведении 1:1), козий антимышиный коньюгат в разведении 1:2000, Все разведения производят на фосфатно-солевом буфере

Б (0,5 мМ NaCI, 2,5 MM KCL, 8 мМ NazHP04, 1,5 мМ KHzP04, рН 7,2), содержащем 0,1 твина 20. Каждый слой инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С, после чего планшеты трижды промывают буфером Б. Все растворы наносят в лунки по 50 мкл. После последней промывки активность пероксидазы, входящей в состав коньюгата, выявляют инкубацией в течение 30 мин в цитратно-фосфатном буфере (34 мМ безводной лимонной кислоты, 68 мМ NazHPG,,ðÍ 5,0), содержа5 щем 0,5 мг/мл ортофенилдиамина и

1мкл/мл 337ь-ного HzOz. Реакцию тормозят добавлением в лунки равного объема 12,5 ного раствора HzS04, Оценку результатов производят на вертикальном многоканаль10 ном спектрофотометре (при 490 нм). Нормальная человеческая плазма от 20 здоровых доноров была использована как стандарт. Контроль неспецифического связывания был сделан с нормальными мыши15 ными иммуноглобулинами (вместо моноклональных антител).

Результаты показывают, что монАТ в сэндвич-ИФА выявляют достовернее повышение содержания в крови фактора Виллеб20 ранда у больных лимфогрануломатозом, раком молочной железы, раком головки поджелудочной железы.

МонАТ могут быть использованы в разработке тест-системы для количественного

25 определения антигена, Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. N. ВСКК(П)

30 317Д вЂ” продуцент моноклонального антитела к фактору Виллебранда системы свертывания крови человека.