Способ хранения фрагментов талломов анфельции с карпоспорами

 

Изобретение относится к марикультуре водорослей-макрофитов, а именно к методам хранения и посадки их посевного мате2 риала, и может быть использовано при лабораторном и промышленном выращивании водорослей. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных карпоспор. Выделенные фрагменты талломов с карпоспорами помещают в контейнеры , добавляют диметилсульфоксид с концентрацией сахарозы от 10 до 20%, охлаждают контейнеры со скоростью 0,4-0,5°С/мин. По достижении температуры замерзания раствора осуществляют инициацию образования кристаллов льда, после чею стабилизируют температуру среды, окружающей контейнеры , на время, необходимое для выравнивания температуры внутри и снаружи контейнера Затем контейнеры помещают в жидкий азот и хранят необходимое время, После этого проводят оттаивание контейнера и разбавление криопротектора. 2 табл. w fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 01 6 33/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4648508/13 (22) 29.12.88 (46) 30.11.91. Бюл, N 44 (71) Институт физиологии растений АН

СССР и Северное отделение Полярного института рыбного хозяйства и океанографии (72) В.И.Мелетьев, 0,А.Ïðoíèíà, А.С.Попов и P.Ã.Áóòåíêî (53) 584(088.8) (56) Nlan der Меег,3,Р. et а1. Cryopreservation

of Gracilaria tikvahial (Rhodophyta) and the

other macrophytic marie algae — phycologil.

1984, v 123, М 2, р. 195-202. (54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ФРАГМЕНТОВ

ТАЛЛОМОВ АНФЕЛЬЦИИ С КАРПОСПОРАМИ (57) Изобретение относится к марикультуре водорослей-макрофитов, а именно к методам хранения и посадки их посевного матеИзобретение относится к марикультуре водорослей — макрофитов, а именно к методам хранения и посадки их посевного материала, в частности спороносных .зон талломов, и может быть использовано в лабораторном и промышленном выращивании этих водорослей, а также в селекции новых их форм с целью получения сверхпродуцентов и резкого увеличения съема продукции с плантаций и в промышленных цехах.

Морские водоросли — макрофиты таксономически относятся к нескольким разным типам низших растений и отличаются сложным длительным онтогенезом с неоднократным чередованием полового и бесполого размножения и сменой гаметофитного и

„„5U „„1694084 А1 риала, и может быть использовано при лабораторном и промышленном выращивании водорослей. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных карпоспор. Выделенные фрагменты талломов с карпоспорами помещают в контейнеры, добавляют диметилсульфоксид с концентрацией сахарозы от 10 до 207, охлаждают контейнеры со скоростью 0,4-0,5"С! мин. По достижении температуры замерзания раствора осуществляют инициацию образования кристаллов льда, после чего стабилизируют температуру среды, окружающей контейнеры, на время, необходимое для выравнивания температуры внутри и снаружи контейнера. Затем контейнеры помещают в жидкий азот и хранят необходимое время, После этого проводят оттаивание контейнера и разбавление криопротектора. 2 табл. спорофитного поколений, Цикл развития заО нимает несколько лет, а пик выхода капроспор в условиях естественных зарослей продолжается у анфельции не более двух 0© недель, причем не одновременно,у разных Д растений, и карпоспоры в первые же часы прикрепляются к песку дна, иначе они погибают. Все это затрудняет марикультур и в д особенности лабораторно-промышленное выращивание этих растений и селекционногенетическую работу с ними. Между тем потребность в такой работе большая, так как природные запасы наиболее ценных для человека видов уже истощены. Это полностью относится и к Anfeltia plicata, принадлежащей к типу красных водорослей

1694084 т и анфельции с карпоспорами, предусматривающий сбор спороносящих растений, выделе(Rhodophyta) и являющейся единственным источником агар-агара — студнеобраэующего вещества — важного и дефицитного сырья для медицинской, пищевой и кондитерской промышленности.

Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных карпоспор, Способ осуществляют следующим образом.

Собирают спороносящие растения ан фельции, выделяют фрагменты талломов с, карпоспорами, помещают их в контейнер, добавляют раствор криопротектора — диме-! тилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 11;7 с сахарозой в концентрации 10— 20, охлаждают контейнеры со скоростью

0,4 — 0;5 С/мин, После достижения температуры замерзания раствора инициируют образование кристаллов льда с последующей стабилизацией температуры среды, окружающей контейнеры, на период времени, необходимый для выравнивая температуры, внутри и снаружи контейнера. После этого контейнеры помещают в жидкий азот и хранят необходимое время. После этого проводят оттаивание контейнеров и последующее разбавление криопротектора, По завершении этих операций фрагменты талломов готовы к высаживанию и проращиванию, Пример . Отбирают женские растения со спорангиями — нематециями в период массового созревания и выхода карпоспор.

Талломы растений затем содержат в естественной, постоянно аэрируемой морской воде при 4-8 С и освещении 1500 — 2000 лк белым светом люминесцентных ламп. Вырезают фрагменты талломов диаметром

0,8-1,2 мм и длиной 2-3 см с нематециями.

В состав криопротектора — диметилсульфоксида вводят сахарозу в количестве

15 - 5; . В опытах используют пастеризованную (стерилизация 35 мин при 68 +1 С) естественную морскую воду. Фрагменты вместе с раствором криопротектора переносят в полиэтиленовые контейнеры емкостью 1 мм, которые помещают в ледяную баню. Вкладывают контейнеры в плоские стальные тонкостенные перфорированные кассеты и помещают в камеру программного замораживателя.

Программа замораживания включает: первоначальное охлаждение со скоростью

0,4 — О,р С/мин до точки замерзания раствора, которая рассчитывается заранее в зависимости от его концентрации. Затем проводят инициацию кристаллизации путем очень быстрого (0,54 0,2 с) погружения кассеты с контейнерами в жидкий азо

5 t0

55 возвращения ее тотчас же обратно в камеру замораживателя, температуру в которой стабилизируют в течение 10 — 20 мин. Этот период времени необходим для выравнивания температуры в контейнерах, где в момент инициации происходит пик кристаллизации, с температурой в камере замора>кивателя. Далее контейнеры помещают в жидкий азот, Хранение при столь низких температурах (-196 С) может быть практически неограниченно длительным, так как биохимические процессы и перестройка кристаллов льда полностью исключены.

Оттаивание контейнеров проводят путем встряхивания в воде при 40 С до почти полного исчезновения последнего кристаллика льда, затем их быстро помещают в ледяную баню и переносят в холодильную камеру, где их содержимое постепенно разбавляют в 10 — ЗО раз и фрагменты талломов высаживают в чашки Петри. Выходящие из нематециев фрагментов карпоспоры, пережившие экстремальную процедуру глубокого замораживания, прикрепляются непосредственно к дну чашек, где и прорастают. Через 7 — 10 дней удаляют фрагменты талломов и полностью меняют воду в чашках. В дальнейшем смену воды производят каждые 10дней или помещают чашки в культиватор с проточной аэрированной морской водой. Выжившие споры формируют типичные проростковые трубки и диски тетраспорофитов (табл,1 и 2).

Табл,1:показывает, что процент проросших спор, формирующих нормальные диски, увеличивается в результате снижения скорости замораживания на первом этапе процесса и благодаря введению в состав криопротектора сахарозы.

Из табл,1 и 2 видно, что наилучший и высокий (92 4 проросших карпоспор) результат был получен при скорости замораживания на первом этапе 0,4 — 0,5 С/мин и при концентрации сахароэы 15 .

Таким образом, предлагаемый способ позволяет хранить и высаживать фрагменты талломов анфельции с достаточно высокой эффективностью формирования карпоспорами растений-тетраспорофитов. Использование изобретения обеспечит хозяйственников и исследователей посевным материалом анфельции в любое удобное для них время и в необходимь.х количествах.

Формула изобретения

Способ хранения фрагментов талломов

1694084

Таблица 1

Число карпоспор (;, ), прорастающих вполне нормально после глубокого замораживания, хранения и оттаивания, в зависимости от скорости охлаждения.

* Условия прототипа как по скорости, так и по добавлению ДМСО.

Таблица 2

Число карпоспор(), прорастающих вполне нормально после глубокого замораживания со скоростью 0,4 — 0,5 С/мин на первом этапе, в зависимости от концентрации сахарозы в ю растворе криопротекторов.

Составитель О. Корженко

Редактор А, Маковская Техред M.Moðãåíòàë КоРРектоР Т. Колб

Заказ 4102 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ние фрагментов талломов с карпоспорами, помещение их в контейнеры, добавление в контейнеры раствора криопротектора, в качестве которого используют диметилсульфоксид, охлаждение контейнеров, помещение их в жидкий азот, оттаивание и последующее разбавление криопротектора, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных карпоспор, раствор криопротектора содержит сахарозу в концентрации от 10 до 20, охлаждение проводят со скоростью 0,4-0,5 С/мин, при атом во.время охлаждения после достижения температуры замерзания раствора

5 осуществляют инициацию образования кристаллов льда в растворе с последующей стабилизацией температуры среды, окружающей контейнеры, на период времени, необходимый для выравнивания температуры

10 внутри и снаружи контейнера.