Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы и штамм бактерий еsснеriсна coli - продуцент полипептида со свойствами проурокиназы (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при создании тромболитических средств. Целью изобретения является повышение стабильности целевого продукта„ Согласно изобретению генно-инженерными методами конструируют рекомбинантные плазмидные ДИК pMUPIpm, pMUTULpm2, ptrpUK2, кодирующие синтез проуроки-, назы, трансформируют ими гатаммы бактерий Escherichia coli . После культивирования штаммов выделяют полипептид, обладающий свойствами проурокиназы, с аминокислотной последовательностью Met-Ser X35-Y1s7,ivi,e Ketu Ser - аминокислоты метионин и серии, Х-глибо глутамин, либо треонин, -«фенилаланин. 2 табл. сл с

СООЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

0% (10, (gg)g С 12 N 15/58,:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К llATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4028425/13 (86) РСТ/ Р Р86/00031 (?4..Г)1. 86) (22) 24 .11.86 (31) 60-11033; 60-83611 (32) 25. 01,85, 20. 04. 85 (33) JP (46) 30.11 ° 91 ° Бюл. b> 44, (71) Сегами Кемикал Рисерч Сентр,Сентрал Гласо Компани, Лимитед, Ходогая Кемикал Ко, ЛТД, Ниппон Сода

Компани, Ниссан Кемикал Индастриз, Лимитед, Тойо Сода Мануфакчуринг Ко, Лтд, .(ТР) (72) Тосио Мияке, Ясуо Хибино, Еити Кобаяси, Кен Ватабе, Мунеки

Омори, Тецузои Мики, Мидори Екояма, Рейко Мацумото, Казуо Ватанабе и Наганори Нумао (53) 575.224.2.577.2/048 (088,8) .(56) JP, А,59-51300, кл. C 12 N 9/72р

С 12 N 15/00, 24.03.84.

Изобретение относится к биотехно логии и может быть использовано при создании тромболитических средств.

Целью изобретения является nomr» шение стабильности полип ептида.

Согласно изобретению предлагается способ получения стабилизированного человеческо-проурокиназо-подобного полипептида, имеющего аминокислотную

Ю (51 (Met) - Ser — Х вЂ” Y .где Met — необязательно присутствувщий щетионин;

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТЩА СО

СВОЙСТВАМИ ПРОУРОКИНАЗЫ И ШТАММ БАКТЕРИИ E.SCHKRIСНЕА C0IJ — ПРОДУЦЕНТ, ПОЛИПЕПТИДА СО СHOACTBAYH ПРОУРОКИНА зы (ВАРИАнты) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при создании тромболитических средств.

Целью изобретения является повышение стабильности целевого продукта. Согласно иаобретению генно-инженерными методами конструируют рекомбинантные плазмидные ДИК р1ПРТрш, р1БПЛ.рш2, рйгрЦК2, кодирующие синтез проуроки-; ! назы, трансформируют ими штаммы бактерий Eseherichia coli . После культивирования штаммов выделяют полипептид, обладающий свойствами проурокиназы, с аминокислотной последовательностью Yet-Ser-X -У,где Yetu Ser35» 167 аминокислоты метионин и серии, Х .-либо глутамин, либо треонин, 7-фенилаланин. 2 табл.

Ser — расположенный первым N-конце" QQ вой серии;. 3

Х - либо находящийся в положении

135 треонин или глутамин;

Y — находящийся в положении 157 йенилаланин, сплошная линия обозначает аминокислотную последовательность, идентичную,фЬ соответствующим частям аминокислотной последовательности природной человеческой проурокиназы.

Пример 1. Получение РНК °

20 г клеток почечной ткани, замороженных при -80 С, измельчают в смео.

1695827 сителе в жидком азоте и суспендирувт в 80 мл 5 И раствора гуанидинизоцианата (5M гуанидинизоцианата, 0,5/ N, лауроилсаркозина-натрия, 25 мМ тартрата натрия, 0,1 М меркаптоэтанола и 0,1Х анифоума А). Суспенэию гомогенизирувт н тефлоновом гомогенизаторе и нуклеиноную кислоту выделяют с помощью центрифугирования н хлористом

1 цезии.

PHK растворяют в 2/-ном растворе

;ацетата калия, добавляют два объема о

,этанола, оставляют на ночь при (-20) С. .и центрифугирувт. !5

Поли(А) РНК выделяют и очищают с помощью олиго (ЙТ) целлюлозной хроматографии. 10 r-.êëåòîê почечной тка ни дают около 3 мг РНК в целом, из

+ которых на поли(А) PHK приходится ь0 2-3Я.

II р и м е р 2. Построение кДНК, библиотеки.

Синтез кДНК проводят с использованием 40 мкг поли(А) РНК, полученной 25 в примере 1. Используя! 40 мкг олиго (Т)< <> в качестве затравки, проводят реакцию с 40 единицами обратной транскриптазы в течение 2 ч при 42 С для ,синтеза первой цепи и после удаления матричной РНК путем щелочной обработки синтез второй цепи проводят с исполь зованием 100 единиц фрагмента Кленова

,полимеразы 1.

После обработки нуклеазой-1 цепь ( (d C)

Этот материал клонирувт в pBR 322 и получают кДНК-библиотеку, состоящую из 2х10 тетрациклин-резистентных и ампициллин-чувствительных трансфор» мантов.

Пример 3. Получение синтети ческих ДНК-олигомеров для использова- ния в качестве зондов для классифика- ции кДНК-библиотеки.

С использованием фосфотриэфирного метода синтезируют следующие 16 ДНКолигомеров, состоящих из 14 нуклеотидов, которые комплементарны, и РНК, соответствующей аминокислотной последовательности человеческой урокиназы

Азп Gln, 1 ro, Trp, Phe

AACCAAGGTT(АТТ

ААССЛАССТТССТТ

ЛЛССАС(*"(ТТСАТТ

ЛАССАСС(TTGATT

ААССАСССТТ((TT

ААССАТССТТССТТ

ЛАССАТС(ТТ(. (ТТ

ААССАЛСССТСАТТ

AACCAAGGCTGGTT AACCAGGGCTGATT

AACCAGGGCT(."GTT

ЛАС САСС(СТ(АТТ

AACCACGGCTGGTT

ААССАТСССТСАТТ

AACCATGGCTG(»TT

AACCAGGGTTG(HATT

Эти 16 ДНК-олигомерон именуют как зонд I.

Дпя использования н качестве подтверждающих зондов тем же путем синтезированы следующие 8 ДНК-олигомеров, состоящих из 14 нуклеотидов,,которые комплементарйы, и РНК, соответствующей Net, Try, Asn, Аэр, Pro 83 237;

5 GGATCATTATACAT 3

GGATCGTTATACAT

ССАТССТТСТАСАТ

GGATCATT(:ТАСАТ

СССТСАТТАТАСАТ

GGGTCGTTATACAT

GG)jCGTT)TACA

Эти 8 ДНК-олигомеров именуют как зонд II »

С использованием Т4-полинуклеоти;» докиназы, 200 кг каждого из зондов

I u II метят радиоактивностью на 5— конце с помощью gATP получения зондов гибридизации колоний.

Пример 4. Классификация кДНК библиотеки.

1. Классификация.

Нитроцеллвлоэный фильтр помещают на 1 В-агарную среду,содержащую

15 мкг/мл тетрациклина„ и среду

I инокулирувт трансформантами, полученными в примере 2, чтобы обеспечить рост 2000 колоний трансформантов.

По прошествии 8 ч инкубирования при

37бС колонии реплицирувт на два нитроцеллюлозных фильтра, которые далее инкубируют в течение 3 ч при 37 С.

Исходный нитроцеллюпозный фильтр используют н качестве эталона, тогда как два вторых фильтра переносят на

1В-агарнув среду, содержащув 15мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл хлорамфени кола,и подвергавт инкубированив. при

37оС в течение ночи. Фильтры затем помещают на 3 мин на 0,5 М Na0H и

1,5 М ИаС1 для осуществления лизиса колоний и денатурации ДНК, и после

1695827 нейтрализации на 0,5 »(трис-НС1 рН и 1,5 M NaC1 сушат на воздухе и затем в печи при 80О(: в течение 2 ч.

После промывки фильтров в 4-х

SSC в течение 30 мин каждый раз при

60 С, предгибридиза»(»»в праводят в

4xSSC, 1ОхДенхардт и 50 мкг/я»» денатурированной ДНК Е.coli в течение часа при 60 С, и после добавления о, 10

0,1 мМ АТР и меченного зонда гибриди,зацию проводят в течение 16 ч при о

37 С ° После промывки фильтры сушат на воздухе и классифицируют в отношении трансформантов, гибридизирующихся с зондом I, что дает 21 клон. Плазмиды этих клонов в дальнейшем именуются плазмидами рКУ1(1-pKYU21 . Полученные

21 клон обрабатывают описанным выше путем и получают клоны, гибридизирую- 2(1 щиеся с UK их зондам II.1!лазмиды в этих, клонах в дальнейшем именуются плазмидай pKYU2 .

2. Характеристики ДНК плазмиды

pKYU21 25

После переваривания ДНК плазмиды

pKYU21 с различными рестрикционными эндонуклеазами и субклонирования их в М13 mp8, определение нуклеотидной последовательности проводят с помощью 30

fif, методики . з ав ер ше ни я дид еэ о к си-цепи

Путем контрастирования этой последо,вательности с известной аминокислотной последовательностью урокиназы подтверждают, что хотя кДНК содержит полную кодирувщую область низкомоле- (35 ,кулярной урокиназы, отсутствует фрагмент ДНК длиной около 100 п.о. на

5 -конце кодирувщей области высокомолекулярной урокиназы.

Пример 5. Построение кДНК библиотеки (II) с помощьв реакции продления затравки„

Основываясь на нуклеотиднай последовательности, определенной в п.2. 45 примера 4 с помощьв AocAoòðèý»rrèðíîão метода получают ДНК-олигомер

5 СТ(:ААСАССАТСА(А 3, состоящий из

15 нуклеотидов, которые комплементарны мРНК-последовательности, соответствующей Бег, Asp, Ala, 1.eu, Clu ° .

89 93 5О

Используя 100 мкг поли (Л) +РНК в качестве матрицы. синтезируют первую кДНК-цепь с использованием 100 единиц обратной транскриптазы и 1 мкг Pмеченной затравки с последующим син55 тезом второй цепи 100 единицами фрагмента Кленова ДНК полимеразы I Е .со1 .

Затем однонитевув )IHK расщепляют

SI-нуклеазай и цепь (ЙС) добавляют

I на 3 -конце, используя концевую дeaоксинуклеатидилтрансферазу. После отпуска этой вставки Ф;-хвостом (кДНК) и вектора с dG-хвостам (76 (pBR 322), трансфарла»рувт Е,. col i X с получением кДНК-библиотеки, состоящей из приблизительно 5х10 трансфар4 мантов.

Пример 6. Классификация кДНКбиблиотеки.

Полученные в примере 5 трансформанты подвергают гибридизации по методике примера 4, В этом случае в качестве зонда используют фрагмент Pst I

Bg1 t15 плазм» л» pKYU21 . Гибридизацию проводят при 60 С, Клоны, гибридизирующиеся с .указанным зондом, выявля ют с помощью ауторадиографии и получают 8 полола»тельных клонов. Плазмиды этих клонов впоследствии именуются плазмидами рРЕ1-рРЕ8. После переваривания этих плазмидных ДНК рестрикционным ферл»ентол» Pst I подтверждают, что плазмида pPF3 содержит кДНКвставку длиной приблизительно 420 п.о.

Фрагменты, полученные перевариванием ДНК плазм»»ды рРЕЗ рестриктазой

Рз I, субкланируют в M13prn8 . В результате подтверждено, чта кДНК содержит не только достаточно длинную область кодирования са стороны 5—

-( конца проурокиназного гена, Но также ( и нетранслируемув область 5 -конца, длиной 66 rr à. перед кодовом ATC инициации трансляции.

Пример 7. Построение проуракиназного гена.

5 мкг ДНК плазмидь» рКУП21, содержащей полную область кодирования низкомалекулярной урокиназы, дважды переваривают 10 единицал»и рестриктазы

Bgl IIr» Hinrl III и вьдслявт фрагмент длиной 5,7 т.п„а. Затем ДНК плазмиды рКУ21 переваривают дважды 10 единицами Bgl II u Ncol а затем выделявт фрагмент размером 66 п.о. После этого

5 мкг ДНК плазмиды рРЕЗ, полученной в примере 6, переваривавт дважды 10 единицами NcOI и НЫй 111 с получением ДНК-фрагмента 1,1 т.п„а. Эти три ДНК-фрагмента повторна экстрагируют фенолхлорофармам, осаждают 2

2 объемами этанала, осадок выделяют и очищают. Эти три разных ДНК-фрагмента связывают между собой с помощьв

Т4ДНК-лигазы и трансформируют клетки

Е.ñoli Х . Трансформанты классифи(776

1695827 цирувт по методике щелочного лизиса

И получают клон, несущий плазмиду

pKYU2? которая содержит полный ген

Проурокиназы.

II р и м е р 8. Определяют нуклеотидную последовательность сайта плаз жды pKYU2? .

Пример 9. Синтез проурокиназпого гена, модифицированного на 5 / (онце.

Структуру 30 п.о. 5 -концевого участка кДНК, кодирующей проурокиназу (пример 7), изменяют так, чтобы обеспечить эффективнув экспрессию проуро-,15 киназного гена под контролем ЯГ-посЛедонательности гена С230 на основе

Р seudomonas put)d e .

По фосфотриэфирной методике синтезируют следующие три одноцепочечных

ЦНК-олигомера, нклвчавщих 29, 15 и 20 нуклеотидон соответственно:

5 (; @ „.(;@:СТССАССАС(ТТС(GT 3

3 ТССЛй"АСтС(" 5 ).

С(А((ТС(ТССАА((СА(С 5 25

1 мкг каждого из синтетических

ДНК-олигомеров нагревают в течение

О Р

2 мин при 95 С, фосфорилирувт на 5 онце Т4-полинуклеотид-киназой, очищают н высушивают. Очищенный материал(30 растворяют н 50 мкл 20 мМ Трис-НС1, рН 7,6 и 10 &I KgC1<,прогревавт в течение 2 мин при 95 С, медленно охлаждают до комнатной теМпературы, а затем ныдерживавт в течение ночи при

ЗS

12 С с получением следувщей двунитеной ДНК!

$ С ®ф;А Я ОА(;С САС(:А(*С .(ТСС(*T 3"

3 ТС1СА(.Й. .(. ((ТХССТС(АЯЛЙ Х(;САА(;С(;А(;С

5 мкг ДНК плазмиды pKYU22 дважды п.еренаривают рестриктазами Bgl III и, Aat II- и выделяют ДНК-фрагмент размером 5,7 т„п,о. Затем 5 мкг ДНК той же плазмиды pKYU .22 дважды переваривают рестриктазами Pst Xu Bgl EI и получают ДНК-фрагмент размером

400 п.о. Этот фрагмент вновь переваривают рестриктазой Тая 1 и выд жявт фрагмент размером 260 п.о. Эти два

ДНК-фрагмента очищают экстракцией

Фенолхлороформом и осаждением 2 объемами этанола.

ДНК-фрагменты и указанный двунитеной синтетический ДНК-олигомер связы н ают с помощьв Т4 ДНК-лигазы и транс формируют в клетки E.coli X . Транс(Лб форманты классифицируют по методике щелочного лизиса и получают клоп

Е.coli Х 1776/pKNU1, несущий плазмиду рКМП1, которая содержит модифицированный проурокиназный ген.

Пример 10. Построение плазмиды pNUT4I,.

5 икг плазмиды pKYiU1 из примера 9 переваривают 10 единицами эндонуклеазы Aat II и выделяют после обработки кишечной фосфатазой телят. Затем 5 мкг плазмиды pTCN1 переваривают 10 единицами эндонуклеазы Aat II, выделяют фрагмент размером 500 п.о. Фрагменты очищают повторной экстракцией фенол/

/хлороформом и осаждением этанолом.

Фрагменты лигирувт и трансформируют в Е.coli Л"103. Отбирают клон, несущий плазмиду pNU TII„ в которой

t аспромотор-оператор и С230Я)— последовательность имеют пранильнув ориентацию относительно проурокиназного гена.

Плазмида pTCN1 содержит область управления экспрессией, включающую йас-промотор-оператор, последовательности lac SI), С230БВ, а также структурный ген С230.

5 мкг плазмиды рКК223-3 переваривают 10 единицами рестриктазы Hind III, обрабатывают кишечной фосфатазой телят.

Затем 1 мкг плазмиды pNU TIL nepe варивавт 4 единицами эндонуклеазы

Dra1 и оставшийся от переваривания фрагмент и 1 мкг 5 -фосфорилированного Н1пй III-линкера (d CAACGTT() лигируют. Проводят переваривание с использованием 12 единиц эндонуклеазы

Hind III и растворяют в О, 15 М NaC1, экстрагирувт равным объемом фенолхлороформа и ДНК осаждают добавлением

2 объемов этанола. Осадок собирают центрифугироваиием и высушивают.

Фрагмент переваривания pNUTII. u фрагмент Н1пй III-pKK223-3 лигирувт и трансформируют в К.coli Л4103, Отбирают клон Е.coli )М103/рМБ Т2Е, содержащий плазмиду рМБТ2 ..

5 мкг плазмиды pNUT2L переваривают

10 единицами эндонулеаз Sph u Tth III

I и после зкстракции фенол - хлоро-— формом ДНК осаждают этаноло14. <НК затуплявт с использованием Т4-полимеразы и лигируют. ДНК трансформируют в Е.cali ЗИ303 и клетки выращивают на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл ампицилина, и отбирают клон Е.coli ,1МХ03/рК)Т4Ь .

827 I 695

Пример 11. 1. Получение однонитевой ДНК.

По 1 мкг плазмиды рКУП22 и М13рш

8-фаговой двунитенои ДНК переваринают в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС1 (рН 7,Я, 7 мМ gClrZ, 7 мМ

-меркаптоэтанола и 50 мМ Ха(;1 в течение часа при 37"(. с использованием 5 единиц Pat I . Фрагменты ДНК выделяют, лигируют и трансформируют

10 клетки F..coli ЛМ103. Трансформанты высевают на агар, содержащий 0,02Х

Х-gal и 1 мМ fPTC, культивируют в о, течение ночи при 37 С. Однонитевую

ДНК получают из белых бляшек, образованных рекомбинантом.

Однонитевую ДНК используют в качестве шаблона, определяют последовательность оснований и подтверждают последовательность клонированной од20 нонитевой ДНК.

2.;(интез..двунитевой ДНК, Используя клонированную цепь одно-. нитевой ДНК в качестве шаблона и син- 25

t тетической олигонуклеотид

5 (АТ(САСААЛАСССС З в качестве затравки (1), проводят реакцию полимеризации с помощью ДНКполимеразы Кленова.

3. Переваривание с помощью БЕ— нуклеазы.

Переваривание с SI-нуклеазой про водят для устранения из результирую щей двунитевой ДНК непрореагировавшей

„35 однонитевой ДНК, служащей н качестве фона. 2 мкл реакционной смеси гидролизуют ЯЕ-нуклеазой, инкубируют при

-о, 26 С в течение 30 мин. Реакцию завер- 40 шают добавлением 10 мкл 0,25 М трисНС1 (рН 8, О) .

4. Трансформация F..coli IN)03.

10 мкл указанной реакционной смеси трансформируют E,coli (К 03.

5. Классификация мутантов.

С использованием зонда - олигонук-" ,пеотида, использовавшегося н качестве затравки, фаговые бляшки классифицируют гибридизацией бляшек для определения мутантного Aara. Бляшки переносят

50 с мягкой агаровой среды на нитроцеллюлозный фильтр, нагревают н вакууме в течение 2 ч при 80 С и гибридизируют в течение ночи и растворе. Фильтр

55 промывают и мутантно-фагонь е бляшки, дающие положительные сигналы, изолируют. Мутантный фаг дает мутантно-фаговую ДНК днунитевого типа. (рп I ) .

Пример 12. Введение мутации в кодон 135-й аминокислоты с использованием фага N13 (2).

В качестве шаблона с использонанием нового олигонуклеотидного мутагена проводят введение сайт-специфической мутации. В этом случае в качестве затравки (2) использован синтетический олигонуклеатид

5 ССААСААА(СССТССТСТ 3

Этот олигонуклеотид из 18 оснонаний комплементарен урокиназному гену в однонитеной шаблонной ДНК, изменено лишь одно основание, как это можно видеть по изменению кодона ААА лизина на кодон ACA треонина.

-Р

2 пмоль 5 -фосфорилированной эатранки добавляют к 0,5 пмоль шаблонной однонитевой ДНК и инкубируют н 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ трис-HCl (рН 7, Я 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ NaCI u

7 мМ .М8С12 в течение 20 мин при 60 С.

Дальнейшее инкубирование проводят в течение 20 мин при 23оС. К реакционной смеси добавляют ИМАТР,4GTP, ЙТТР и

d СТР до концентрации 0,5 мМ и 2 единицы ДНК-полимеразы.. Смесь инкубируют

20 мин при 23 С, а после добавления

1 мкл 10 мМ ATP и 1 единицы Т4 ДНКлигаэы инкубируют н течение ночи при

12 С. Смесь трансформируют в К.coli

JYi 03.

Бляшки переносят с агара на нитроцеллюлозный фильтр, прогревают при

80 C 2 ч, гибридизируют с затравочным олигонуклеотидом. Затем фильтр промывают и мутантные фаговые бляшки, дающие положительные сигналы, изолируют.

Из мутантного фага получают двунитеную ДНК (pm2), определяют нуклеотидную последовательность и подтверждают наличие требуеМой мутации в виде за- . мещения одного основания.

Пример 13. Построение-плазмиды р1ШР1, содержащий ген человеческой проурокиназы.

Используя плазмиду pYTUI, содержащую PI. — ïðoìoòoð и SD-последовательность и С230 в качестве вектора, строят плазмиды, содержащие урокиназную кДНК, полученную на основе человеческой почечной ткани. Для этого

10 мкг плазмиды рУТП I переваривают

10 ед. Sal Е и Aa(II в 100 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-IICi (рН 7,4), 7 мМ М8(:1 и 15(1 мМ ИаСЕ, в течение 2 ч при 37 (, и нь(вселяют

1695827 фрагмент ДНК Sal I — Aat II длиной около 4,5 т.п.о.

10 мкг плаэмиды ply:U I переваривают 10 ед. Dra I в 100 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС1 (pll 7,4),.

7 мМ Mp(, lg и 60 мМ NaCl в течение ,2 ч при 37"С, добавляют АТР в кон центрации 0,66 мМ. После добавления 1 мкм На1 Х - ликерной ДНК, (5 С(ТС(* АСС 3 ) и 100 ед. Т4 ДНК ли, газы смесь инкубируют при 12ОС в ,течение ночи. ДНК-4 рагменты вьделяют

1 с помощью обработки фенолом и этанольного осаждения и переваривают

10 ед. Aat II u Sal I в 100 мкл раст вора, содержащего 10 мМ трис-НС1 (pII 7, 4), 7 мМ MgC1 и 150 мМ ИаС1 в течение 2 ч при З/оС и с помощью электрофореза в агарозном геле вьделяют ДНК-Арагменг человеческой уроки назы длиной около .2,2 т.п.о. По 1 мкг; .каждого из фрагментов смешивают и лигируют в течение ночи в 20 мкл раст:вора, содержащего 66 мМ трис-НС1 25 (рН 7,4), 7 мМ Мф:1, 0,66 мМ ATP и 10 мМ дитиотреитола при 12ОС с использованием 100 единиц Т4 ДНК".лигазы. Лигаэной смесью трансформируют

E.со1 НВ101, отбирают клон, несущий плазмиду pYiUPI „

Пример .14. Построение плазми ды pMUPI рш .

Используя мутантную М13фаговую двунитевую ДНК, содержащую кЦНКфрагмент, в котором кодон ААА, опре-- 35 деляющий лизин в положении 135 рт

И-конца урокиназы, мутирован в кодон

САА, определяющий глютамин, и плазми» ду рЖРХ, имеющую проурокиназный ген „ ниже PL-промотора и С230 ЗВ-последова-, тельности, строят плазмиду, содержа-„, щую мутированный ген. Для этого 10 мкг мутантной M13 - двунитевой

ДНК переваривают с помощью Рst Х и вьделяют фрагмент длиной около

1,2 Tâ,ï.oå

10 мкг плазмиды pYUPI частично переваривают с помощью Pst I и вьделяют фрагмент длиной около 5,4 т.п.о, из которого удаляют лишь фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. Фрагменты вьделяют и лигируют. После трансформации получают клон, содержав(ий плазмиду pMUPIpm.

Плазмида рМПИрш содержит область, 55 кодирующую человеческо-проурокиназоподобный полипептид в сайте ниже

PL-промотора,и С230 Sl)-последовательности. В этой области кодирования кодоны, определяющие шесть N-концевых аминокислот указанного полипептица, заменены кодонами, которые экспрессируются в E.coli, и кроме того, кодон

AAA определяющий Lys в положении

135 заменен на кодон CAA определяющий глютамин.

Пример 15. Построение плаз миды рМБТ4Ьрш2 со структурным геном проурокиназы и точечной мутацией ниже tae"промотора.

10 мкг М13"."мутантнои двунитевой

ДНК гидролиэуют рестриктазой Pst.I, вьделяют фрагмент длиной около

1,2 т.п.о. 10 мкг pYUT4L .частично

° E переваривают с помощью Pst I и вьделяют фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.

Фрагменты смешивают, лигируют и транс"

:.Формируют в E.coli НВ101. Трансформан .ты классифицируют по методике щелоч-: ,ного лизиса и получают клон, содержащий плазмиду "pYUT4l,рш2 .

Пример 16 ° .Введение мутации в кодон 157-й аминокислоты.

Получение однонитевой шаблонной

ДНК.

По 1 мкг плазмиды рК7022 и фаговой

М13шр8-двукитевой ДНК переваривают в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ . трис-НС1 (рН 7,5), 7 мМ МяС1, 7 мМ (3 -меркаптоэтанола и 50 мМ NaC1 в те чение 1 ч при 37 (", с использованием

5 единиц Pst I.

Фрагменты вьделяют, лигируют, Ц трансформируют в E.coli М103 транс-

;Форманты высевают на мягкий агар, содержащий 0,02% X al и 1 мМ ИПТГ..

Пластинки инкубируют при 37 С в тече;ние ночи. Однонитевую ДНК получают из белых бляшек, образованных рекам бинантом.

2. Введение мутации.

С использованием результирующей .рекомбинантной М13-фаговой однонитевой ДНК в качестве матрицы введение мутаций проводят с помощью другого олигонуклеотидного мутагена. В этом случае. в качестве затравки используют, синтетический.олигонуклеотид

5 GGCCCC(С(АЯА(АУТА 3

Хотя этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен урокиназному геку в однонитевой шаблонной ДНК, два .основания изменены. Кодон ТТТ, определяющий фенилаланин, заменен на кодон САТ, определяющий аспарагиновую кислоту.

1695827

С использованием упомянутогo OJIH гонуклеотида в качестве затравки двунитевую ДНК синтезируют in v.itro, Для этого 2 пмоль 5 -фосфорилирован-( ной затравки добавляют к 0,5 пмоль матричной однонитевой ДНК, инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ тряс-НГ1 (pH 7,5), 0,1 мМ ЭДТК, 20 мМ ,NaCl и 7 мМ YgC1, в течение 20 мин Jg при 60 С с последующим инкубированием ! прн 23 С в течение 20 мин, к реакционной смеси добавляют по 0,5 мМ d АТР, d GTP, dTTP и АСТР до объема 20 мкл .и 2 единицы ДНК-полимеразного фраг- 15 мента Кленова. Смесь инкубируют при

23 С в течение 20 мин и после добаво ления 1 мкл 10 мМ ATP и 1 единицы Т4ДНК-лигазы еще в течение ночи при . 12ОС. Реакционную смесь трансформиру- 20 ют и Е.coli Л1103 и получают около

10.000 фаговых бляшек на микролитр указанной реакционной смеси.

После. переноса бляшек с мягкого агара на нитроцеллюлозный фильтр 25

d .фильтр нагревают в вакууме.при 80 С в течение 2 ч, гибридизуют с затра,. вочным олигонуклеотидом, меченым

° с помощью р, промывают в 6xSSG при

52 С и бляшки мутантного фага, даюо щие положительные сигналы, выделяют . ауторадиографически. Из мутантного фага получают мутантно-фаговую ДНК двунитевого типа (рш3) .

Можно заменить кодон ТТТ, опреде"35 ляющий фенилаланин в положении 157>

Glu-определяющим кодоном (АА с использованием олигонуклеотида

5 СССССС(ССАААА(ATTA 3 в кач еств е мутагена .

П р и 4 е р 17. Построение плаэмиды рМцТ4Ьрш3, в которой структурный ген урокиназы, имеющий точечную мута цию, вставлен ниже F.coli tac-промотора. 45

10 мкг М13-мутантной двунитевой

ДНК (рш3), с помощью Pst I выделяют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о.

1О мкг плазмиды pNUT41. частично переваривают с помощью Pst I и выделяют

50 фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.

Фрагменты смешивают, лигируют и используют для трансформации F.coli

НВ101. Получают клон, содержащий плазмиду pNUT41.ðíÇ .

Пример 18. Построение плазми55 ды рКК trp..

5 мкг плаэмиды рКК 223-3 гидролизуют 30 единицами Fcok I и 30 единицами Pvu II в 100 мкл буфера (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ YigCig> 50 мМ

ИаС1 и 1 мМ ДТТ) в течение 1 ч при

37 С. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,71 агарозе и вьуу- ляют ДНК-фрагмент длиной около

2600 п.о,, содержащий ген ампицилин- резистентности, область инициирования репликации в область rrn BT У окон"1 " чания транскрипции.

Фрагмент обрабатывают ДНК-полимер азой в 25 мл буфера (50 мМ трис-liCI (рН 7,2), 10 мМ YigS0, 0,1 мМ DTT и 80 мкМ dNTPS) в течение часа при

25 С и обозначают как (А) .

10 мкг плазмиды pSTN16 и по 20 ед. гидролизуют рестриктазами С1а I u

Pvu II выделяют фрагмент длиной около 300 п.о. содержащий промотор., оператор и рибосомо-связывающий сайт триптофанового оперона.

Фрагмент обрабатывают ДНК полимеразой и обозначают (В).

Далее по 0,5 мкг ДНК вЂ” фрагментов (А) и (В) лигируют и продукт реакции используют для трансформации Е.coli

НВ107 Ампицилин-резистентные трансформанты отбирают для выделения коло ний, несущих плазмиду рКК trp, и требуемую плазмиду выделяют.

Пример 19. Построение плазмиды ptrpUK2 .

1 мкг плазмиды рКК trp гидролизуют рестриктаэой и выделяют требуемый

ДНХ-фрагмент (С).

10 мкг плазмиды pYUT4I. гидролизуют рестриктазой, выделяют фрагмент раз-. мером 640 п.о,, содержащий N-концевую область гена человеческой урокиназы.

Этот фрагмент обозначен (n). ,ДНК-фрагменты (С) и (Д) лигируют и используют для трансформации F,.coli.

НВ101. Отбирают колонии, несущие плаэмиду ptrpUKI, и выделяют требуемую плазмиду.

1 мкг плазмиды ptrpUK расщепляют рестриктазой:Pst Е и выпеляют требуемый фрагмент ДНК (Е) .

l0 мкг плазмиды pNUT41. расщепляют рестриктазой и выделяют фрагмент (1 ) . длиной 1,2 т.п.о., содержащий Сконцевую область гена человеческой урокиназы.

Фрагменты (Е) и (F) лигируют и используют для трансформации F..coli

НВ101. Из ампицилин-резистентных трансформантов отбирают колонии, не15

1695827 сущие плазмиду ptrpUK2, и выделяют гребуемую плазмиду.

Пример 20. Построение лазми,ды ptrpUK2 (1135), Двунитевой мутантный фаг И13И» (113э), в котором вставлен ДНК"фраг

Мент, кодон AAA которого, определяю,щий лизин в положении 135, мутационно. заменен на кодон АТА, определяющий ,Мэолейцин, получают по методике при-

Мера 11, за исключением применения. следующего синтетического олигонукле- отида в качестве затравки:

5, САСАТС(:AATAAAGCC 3

10 мкг фаза N13kl" (1135) полностью

° ° ° ереваривают с использованием .PstI выделяют ДНК-фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 1 мкг плазмнды рйгрБК2 полностью переваривают с помощью Рз1Х 0 выделяют ДНК-фрагмент длиной около

Д,4 т.п.о и используют в качестве вектора. фрагменты лигируют с исполь эованием Т4-ДНК-лигазы и реакционную смесь используют для трансформации 25

Е.coli НВ101. Классифицируют ампици- лин-реэистентные колонии и получают ,клон, содержащий плаэмицу ptrpUK2

,(1135). Все условия проведения этой процедуры соответствуют описанным

:Is примере 4.

Пример 21. Построение нлаэми

"ды ptrpUK (E135).

Двунитевой мутантный фаг И13КР .(Е135), в котором вставлен ДНК-"фраг.мент, кодон ААА которого, определяю щий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон (* АА, определяющий глютаминовую кислоту, получают по ме" тодике примера 10, за исключением применения следующего синтетического нуклеотида в качестве затравки:

5 GATC GAGAAAAGССТ 3

Затем по методике примера 20 из фагà N13kF (135) и ппаэмиды StrpUK2 45 получают плазмиду ptrpUK2 (Е135).

Пример 22. Построение плазми ды ptrpUK2 ((}135 Д 157).

Двунитевой мутантный фаг, в котором вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого изменен на кодон САА, опре50 деляющий глюамин, получают по методике примера 11 ° за исключением применения синтетического нуклеотида в качестве затравки:

5 САТССАСАААА(ССС 3

Затем по методике примера 11 иэ указанного фага получают однонитевую фаговую ДНК и по описанной вине мето дике получают двунитевой мутантный фаг И13КГ ((135 Д 157), в который вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого, определяющий лизин в положении

135, мутационно изменен на кодон САА, определяющий глютамин, и кодон ТТТ> определяющий фенилаланин в положении

157, аналогично изменен на кодон САТ,, определяющий аспарагиновую кислоту, за исключением использования синтетического олигонуклеотида

5 GGCCCCGCGATAACÀÒÒÀ 3 1 в качестве затравки, в результате чего меняют кодон ТТТ, определяющий фенилаланин в положении 157> на кодон САТ, определяющий аспарагиновую кислоту.

Плазмиду trpUK2 (0135 Д 157) получают из И13КГ (0135 Д 157) и плаэмиды

ptrpUK2 по методике примера 20.

Пример 23, Построение плазмиды trpUK2 (Е133 Д 157).

Двунитевой мутантный фаг М13Кг (Е135 Д 157), в котором вставлен ДНКфрагмент, кодон ААА которого, опреде-1 ляющий лизин в положении 135, мутаци- онно изменен на кодон САА, определяющий глютаминовую кислоту, а кодон ТТТ, определяющий фенилаланин в положении

157, изменен на кодон САТ определяю щий аспарагиновую кислоту, получают .по методике примера 22 эа исключением использования синтетического нуклеотида 5 САТССАСААААССССТ 3 для мута:ционного изменения кодона ААА, опре деляющего лизин в положении 135, на кодон САА, определяющий глютамино вую кислоту.

Далее по методике примера 20 плазмиду trpUK2 (Е135 Д 157).получают иэ

:И13КР (Е135 Д 157) и trpUK2 .

Пример 24. Экспрессия проуро,киназо-подобного полипептида.

Плазмиды yNUPI u pNUPIp полученные соответственно в цримерах 13 и

14, трансформируют обычным путем ,в Е.coli 03110 и результирующие транс,форманты культивируют лри 30 C в

50 мл Е-бульона, Температуру культу:рального .бульона повьнпают до 42 0, когда поглощение на 600 нм достигает

0,3, и дальнейшее инкубирование проводят в течение 3 ч при экспрессии урокиназного гена.

Пример 25. Экстракция генного

; продукга из Е.coli и его свойства.

Клетки Е.coli 3110 собирают иэ

5 мл жидкой среды, описанной выше, и .посае суспендирования клеток в

1695827

19 ру л и после разбавления надосадочнои жидкости инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Смесь диализируют, как описано выше. 5

Иутантную (Рт3) урокиназу очищают подвергая результирующий сырой экстракт аффинной хроматографии с исполь зованием сефарозной колонки, с которой связаны антиурокиназо-моноклональные антитела.

Пример 28. Экспрессия проуро1 киназо-подобного полипептида.

Плазмиды ptrpUK2 (0135Д157) и

ptrpUK2 (E135 Д 157), полученные и примерах 22 и 23, трансформируют в E.со1Ы. 03110, трансформанты инкубируют. индуцируют добавлением ХАА (индолуксусная кислота) до конечной концентрации 50 мкг/мп, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5 и ,дальнейшее культивирование проводят о Э ч при 37 С для экспрессии урокиназного гена.

Из жнцкнх сред экстрагируют и очи- 25 щают 5 мл среды на основе плазмиды

ptrpUK2 (0135Д157) с получением мутантного проурокиназо-подобного полипептида ((135Д157). Часть полипептида обрабатывают трипсином следующим 30 образом.

После определения ферментной активности по методу синтетического субстрата пробы разбавляют раствором, содержащим 50 мИ трис-НС1 буфера (рН 7,4), 0,15 И хлористого натрия и 0,1% тритона Х-100 до конечной концентрации 100 NE/мп. К 50 мкл добав ляют 3 мкл водного раствора трипсина до окончательной концентрации 1 мг/мл,ц»

2 мг/мл и 3 мг/мл и смеси инкубируют при 37 0 в течение 60 мин. Затем ре акцию прекращают добавлением 5 мкл соевого ингибитора трипсина. В качестве контроля аналогично обрабатывают 45 пробы, содержащие вместо трипсина воду. .Пробы подвергают электрофорезу в градиентном полиакриламидном геле (10-26%). 1 .ель погружают в 2,5% три- 50 тон Х-100 и инкубирувт в течение часа при комнатной температуре, наслаивают на фибрино-агаровую пластинку и инкубируют 2 ч при 37о(,. Иолекулярную. массу оценивают на основании положения зоны растворения на фибрин-агаровой пластинке.

Также обрабатывают проурокиназоподобный полипептид природного типа,и мутантный проурокиназо-подобный полипептид (0135), полученный экст-ракцией и очисткой жидкой среды, полученной в примере 25, с помощью методики примера 27. Иолекулярная масса проурокиназы природного типа на основе pNUPI составляет около

50.000, диссоциация трипсином снижа ет ее до 30.000. С другой стороны никакой конверсии до низкомолекулярного материала не происходит при обработке трипсином в случае полипептидов на основе соответственно плаз мид pMUPIpm и рстр1Ж2 ((}135Д157) °

Характеристика штаммов хозяев.

Общие. свойства.

1. Длинные стержни размерами 1,1

1,5 на 2,0-6,0 мкм (живые) или 0,40,7.на 1,0-3,0 мкм (высушенные и окрашенные).

2. С+С содержание ДНК: 50-51 моль.7 (плавучая плотность +Т ).

3. Биохимические характеристики приведены в табл.1 и 2.

4. Генотип.

Д,(lас pro), thi, str А, sup Е, end А, sheА, she В, usd k, У сха и 36, pro АВ,. 1ас Х, Х QM15

Специфические свойства Е schericbia

col i /. pNUP3pm2 (FHRM ВР-969) — проду- цент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, со следующей аминокислотной последовательностью: (Met) — Ser — Х вЂ” Y-, где Х - глутамин в положении 135 и

7-фенилаланин в положении 157.

Eschermhia coli / pNUT4Lрг2 (FEPM

ВР9/0) — продуцент полипептида, обладающего свойствами человеческой йроурокиназы со следующей аминокислотной последовательностью, (Net) — SerX - У-, где Х представляет собой треонин в положении 135,а 7 « фенилаланин в положении 157.

Escherichia coli / ptrpUK2 (()D157) (DSN - 3623) — продуцент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, где Х представляет собой глутамин в положении 135, à Y аспарагиновую кислоту в положении 157.

Проурокиназа, полученная с помощью

E.cali W3110 и трансформированная с помощью рИОРХрв, составила примерно 2 мкг/мл, полученная с помощью Е.coli

Ж ОЗ, трансформированной с помощью

PNVT4Lpm2, составляет от 5 до

10 мкг/мл, а полученная с помощью

E„cali W3110 трансформированной с

1695827

Таблица 1

Признак (1) Наличие (+), отсутствие (-} (II) Подвижность

Индол

Н Ь íà TSI

1.-Галактозидаза

Лактоэа

Мукат

+/к

+ помощью pNWpIpm составила примерно от 1 до 2 мкг/мп.

Формула изобретения

1. Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечиваю щей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантными ДНК штамма бактерий Езсйег сЬКа coli, отбор клонов, культивщ>ование штаммов, индукцию образования полипептида, выделение и очистку целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности полипептида, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК PNUpIpm, трансформируют полу- 20 ченной ДНК штамм бактерий E.coli

03100, культивируют трансформировано, ные клоны при 30 С с последующей индукцией при повышении температуры о, до 42 С образования полипептида со 25 следующей аминокислотной последовательностью .

)Net) — Ser — (1n — Phe

<35 <5

2. Итамм бактерий E scheri с1п à coli

FERN ВР-969 — продуцент полипептида со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью.

I Ne t (— S er — G 1 n 35- Ph e

135 157

3. Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы, предусмат1,кивающий конструирование рекомби» нантной плазмидной ДНК, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантной ДНК штамма бакте.рий Escheri chi coli, отбор клонов, культивирование штаммов, индукцию образования полипептида, выделение .и очистку целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности полипептида, конструируют рекомбинантную плазмиднув ДНК рИ1П41.pm?, трансформируют полученной ДНК штамм бактерий Е„cali.

П 103, культивирувт трансформированные клоны при 37 (, и путем прибавлео, ния из о пропил-P-П-тио гал ак топ ир а ноз ида индуцирувт образование полипептида, со следующей аминокислотной последовательностью: (Iet(— Ser — Thr - Phe

335 <57

4. Итамм бактерий Escherichia coli

FERN RP-"970 — продуцент полипептида со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью .

Net — Ser — Thr - Phe .

5. Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной PHI(, обеспечивающей синтез проурокиназы, трансформа цию рекомбинантной,НК штамма бактерий Escheri chi à coli, отбор клонов, культивирование штаммов, ицдукцию образования полипептида, выделение и очистку целевого продукта, о тл и ч а н шийся тем, что, с целью повышения стабильности полипептида, конструируют рекомбинантнув плазмидную ДНК ptrpUK2 — (0135 D 157). трансформируют полученной ДНК штамм бактерий Е.coli W3110, культивируют трансформированные клоны при темпео ратуре 37 С и путем прибавления индолуксусной кислоты индуцирунт образование полипептида со следующей аминокислотной последовательностью. (Net) -Ser-(:1n — esp б. штамм бактерий Е scherichia со1i

DSN-3623 — продуцент полипептида со свойствами проурокиназы и аминокис- . лотной последовательностьв „ „, „(,1„И ». ю5

Приоритетпопункта м.

25.01 ° 85 по пп 1 и 2;

20.04.85 по пп 3 и 4.

1695827

KCN

Желатин

Мал онат

d-Тартрат

Дул ьцитол

d (аналоги}

Таблица 2

50+51

+ илиХ

Примечание. Хпоследний и нерегулярно позитивный.

Каталаза

Оксидаза р-Галактоэидаэа

Газ из Глюкозы при ЗУОС

KCN (роста)

Мукат (кислота)

Восстановленный нитрат

С-С, мол. %

Адонитол

Арабиноза

Лактоза.

Иальтоза

Ианнит

Салицин

Сорбит . Трелалоза

Близкие углеродные источники

Цитрат

Иалонат

М. 1(.

У.P.

Гидролиз желатина

Н Б из TS Т

Индол

Декарбоксилированный лизин

Гидролизованная моч евина

Глутами новая кислота

Фенилаланин

Продолжение табл,1