Штамм клубеньковых бактерий вrаdyrнizовiuм sp. (glycyrriza) для производства бактериального удобрения под солодку голую

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур (солодки голой). Целью, изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizoblum sp. для производства бактериального удобрения под солодку голую. Штамм клубеньковых бактерий Brodyrhlzoblum sp. (Glycyrrhiza)3101 выделен из клубеньков солодки голой, депонирован во ВНИИСХМ под №3101. Штамм позволил увеличить урожай зеленой массы солодки голой на 7,0 ц/га(61,4%) и содержание белка в растениях на 3,2%. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4612685/13 (22) 05.12.88 (46) 15.12.91. Бюл. M 46 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т. Новикова, В,Л. Князева, А.П. Кожемяков, Т.П. Надежина и Н.Г. Орищенко (53) 631.847.211 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1036718, кл. С 05 F 11/08, 1982. (54) ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

BRADYRH1ZOBIUM SP. (GLYCYRRIZA) ДЛЯ

ПРОИЗВОДСТВА БАКТЕРИАЛЬНОГО

УДОБРЕНИЯ ПОД СОЛОДКУ ГОЛУЮ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробиологических средств повышени1 урожайности бобовых культур, а именно солодки голой.

Целью изобретения является получение штамма клубен ьковых бактерий

Bradyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под солодку голую.

Бактерии штамма Bradyrhlzobium sp. (GIycyrrhiza) 3101 выделены из клубеньков солодки голой дикой популяции. Идентифицированы по определителю бактерий Берги.

Штамм 2101 депонирован и хранится в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сел ьскахоэя йст вен ной микробиологии под номером 3101.

Культурно-морфологические признаки.

Штамм 3101 растет нэ питательных средах следующего состава:

„„5LI ÄÄ 1698242 А1

Is»s С 05 Е 11/08, С 12 N 1/20 (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к получению микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур (солодки голой). Целью изобретения является получение штамма клубеньковых бактерий 8radyrhizobium sp. для производства бактериального удобрения под солодку голую. Штамм клубеньковых бактерий Brodyrhizoblum sp, (GIycyrrhiza) 3101 выделен из клубеньков солодки голой, депонирован во ВНИИСХМ под N 3101. Штамм позволил увеличить урожай зеленой массы солодки голой на 7,0 ц/га(61,4%) и содержание белка в растениях на 3,2%. 3 табл.

Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит

10,0; К2НРО4 0,5; MgSO4 7Н20 0,2; NaCI 0,1: дрожжевой экстракт 0,4; агар 15.0; рН среды

6,8-7,0.

Маннитно-дрожжевой агар с бромтимолсиним, г/л: 10,0; К2НР04 0;5;

MgS04x7HzO 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; бромтимолсиний 5 мл Д

05% спиртового раствора, рН среды 6,8- Я

7.0.

Маннитно-дрожжевой агар с аминопептидом, г/л: маннит 10,0; К2НРО4 0,5:

М9304х7Н20 0,2; NaCI 0,1; СаСОэ следы, дрожжевой экстракт 0,4; аминопептид

10 мл; агар 15 0, рН среды 6,8 — 7,0.

На косом маннитно-дрожжевом агаре при Т 26 — 28 С и рН 6,8 — 7,0 в 5-ти суточной культуре клетки имеют форму коротких толстых палочек с закругленными концами, размер 1,5 — 2,0х0.7-0,8 мкм, грамотрицэ1698242

20 аута Текатор

55 тельные, до 72 ч подвижные, затем по мере старения к 5-и суткам утрачивают подвижность. Медленно растущая культура, Образование специализированных клеток.

При старении культуры на маннитнодрожжевом агаре с рН 6,8 — 7,0 и при Т 26—

28 С в возрасте 7 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Хэрактеристика роста на плотной среде.

1. Маннитно-дрожжевой агар (МДА), Т

26 — 28 С. рН 6,8 — 7,0. Штрих 5-ти суточной культуры умеренный, бесцветный, слизи; стый, стекающий, слабо-выпуклый, блестящий, Колонии появляются на 7-е сутки, на

10-е сутки имеют размер 2 — 2,5 мм, однотипные, беловатые, круглые, слабо-выпуклые, растекающиеся, слизистые, S-формы.

2. МДА + бромтимолсиний, Т 26 — 28ОС, рН 6,8 — 7,0.

Рост бактерий на данной среде аналогичен росту на МДА, но культура окрашивается в желтый цвет, а среда — в зеленоватый.

3, МДА + аминопептид, Т 26 — 28 С, рН

6,8-7,0.

Штрих 5-ти суточной культуры обильный, бесцветный, слизистый, стекающий, плоский, Колонии появляются на 4-е сутки, на 7-е сутки имеют размер 3 — 4 мм, однотипные, круглые, беловатые, слизистые, выпуклые, растекающиеся, S-формы,.

Рост в жидкой среде.

Молоко с лакмусом, Т 26 — 28 С, не пеп тонизирует, интенсивно подщелачивает.

После 48 ч окраска молока изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение цвета отмечается нэ 15-е сут, Физико-биохимические свойства.

Симбионт. Макросимбионт — бобовое растение солодка голая.

Отношение .к: а) кислороду — азроб б) Т максимальная 40 С; минимальная

10 С, оптимальная 26 — 30 С. в) рН максимальная 8.0; минимальная

6,0; оптимальная 6,8 — 7,0.

Отношение к углеводам. Интенсивно использует маннит, рамнозу, ксилозу, мэльтозу, сахароэу, лактозу. декстрин, слэбее— глюкозу, галактозу, сорбит. Среды с ксилозой, декстрином — подкисляет, с остальными сахарами — подщелэчивает, Клетчатку и крахмал не усваивает.

Отношение к источникам азота: хорошо растет на средах с аэотнокислым натрием, аммонийными солями, аминопептидом. На мясо-пептонном агаре (МПА) бактерии не растут.

Признаки штамма устойчивы, Штамм не патогенен.

Штамм 3101 хранится на маннитном агэре при 4 — 5 С и рН 6,8-7,0 пересевается один раз в 6 мес, Пример 1 (оценки симбиотических свойств штамма 3101).

Оценку симбиотических свойств штамма 3103: вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводят в условиях микровегетацион ного и вегетационного опытов.

Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции солодки голой клубеньковыми бактериями, Азотфиксирующую активность штаммов определяют по величине активности нитрогенаэы ключевого фермента в процессе связывания молекулярного азота. В свою очередь нитрогеназную активность измеряют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) нэ интактных растениях..

Эффективность симбиотической азотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями нэ сосуд, а также по величине урожая зеленой массы солодки голой и содержанию в нем азота, который определяют с помощью системы КьельтекМикровегетационный опыт.

B большие пробирки с 5 мл стерильного вермикулита добавляют 11 мл среды Красильникова-Кореняко, стерилизуют в автоклаве, Семена солодки голой дикой популяции стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 20 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры и чашках Петри для прорастания. Через 2-е суток проростки в асептических условиях раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка). Опыты ставят в 10-ти кратной повторности, Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом маннитно-дрожжевом агаре в пробирках в течение 5 сут. при 28 С и суспендируют в растворе микроэлементов (по прописи Федорова), Через 2 сут. после посева семян в каждую пробирку вносят 1 мл инокулюма, имеющего концентрацию 10 клеток, Расте7 ния выращивают в фитотроне при 24 — 26 С.

Через 45сут, пробирки герметично закрывают и вводят шприцем ацетилен до концентрации 10% по обьему, Количество этилена, образовавшегося в результате восстановле- ния ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через 24 ч на газовом хроматографе.

Величину нитрогеназной активности клубеньков. которой измеряют аэотфикси1698242

20

40

55 рующую активность штамма, выражают в микромолях С Н4 за 24 ч на сосуд.

Вегетационный опыт проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но беэ азота. Повторность опыта 4-кратная.

Используют семена солодки голой дикой популяции, Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивают на скошенном маннитно-дрожжевом агаре. Культуру в пробирках с титром 4 — 5 млрд. смывают водопроводной водой, затем суспенэию наносят на семена солодки голой, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда, В сосуд вносят 10 клеток.

Симбиотические свойства: вирулентность и азотфиксирующая активность штамма 3101 и известных штаммов Rhizobium

meliloti 425а и Rhizobium meliiotl 282 приведены в табл,1.

Сравнительная вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 3101 и

Rhizobium meliloti 425а и 282 при инокуляции солодки голой даны в табл.1.

Как показывает табл.1, бактерии предлагаемого штамма 3101 вирулентны на солодке голой, они образуют на ее корнях типичные для этого растения клубеньки; бактерии штамма 282 слабо вирулентны на этом растении, образуют бурые, единичные клубеньки не на всех растениях, а штамма

425а не вирулентны.

Штамм 3101 является активным азотфиксирующим симбионтом солодки голой, нитрогеназная активность клубеньков, образованных бактериями этого штамма на солодке голой, в 268 раз выше, чем у контрольных растений и растений, инокулированных штаммами 425а и 282. Бактерии штамма 282 образуют неактивные клубеньки на солодке голой, их нитрогеназная активность не превышаетуровня контрольных растений.

В табл,2 приведены данные микровегетационного опыта, эффективность симбиотической азотфиксации штаммов

Bradyrhlzobium sp, 3101, Rhizobium

meliloti 425а и 282 при инокуляции солодки голой

Как прказывают данные, полученные в микровегетационном опыте (табл.2), в результате активной симбиотической фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 3101 общее накопление азота растениями солодки голой, бактеризованной этим штаммом, было на 96,4 и

114,5 выше, чем при использовании штаммов 425а и 282 соответственно. При этом урожай зеленой массы растений, инокулированных штаммом 3101, повысился на

22,9, а содержание азота в ней на 1,69 .

В вариантах, где применялись штаммы

425а и 282, фиксации азота атмосферы не происходило, растения дополнительно не снабжались этим элементом и продуктивность растений не повысилась. Напротив, инокуляции солодки голой штаммом

Rhizobium mellloti (Meiilotus) 282 привела к достоверному снижению урожая зеленой массы, что по-видимому можно объяснить тем, что в данном варианте бактерии были конкурентами растений за азот, усвоенный ими из почвы.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активная симбиотическая азотфиксация у солодки голой может быть получена только при инокуляции специфичными для нее штаммами клубеньковых бактерий, Ввиду этого в дальнейшие опыты штаммы-прототипы не включались.

Пример 2 (использование штамма

3101 для получения бактериального удобрения).

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или 5-ти литровых бутылях B течение 3 сут. на среде следующего состава, мас,, кукурузный экстракт 0,7 — 1,0; пекарские дрожжи (влажные) 0,06; сахар пищевой

1,0, (NH4)zS04 О, 05; КН2РСф 0,025;

KzHP04x3HzO 0,025; MgSO4x7620 0,02;

Са СОз (стер ил ь н ы й) О, 1; вода водо п роводная до 100,0; рН 6,8 — 7,0, Титр клеток

4 — 5 млрд/мл, Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-литровых бутылях на среде следующего состава, мас.,; кукурузный экстракт 0,7-1,0; пекарские дрожжи (влажные) 0,05; меласса 1,0; глюкоза 0,5-1,0; (NHn)zSO4 О., 05- О, 1; К НгР04 О, 025;

KzHPOnx3H2O 0,025; Mg SOq 7Hz0 0.02;

СаСОз 0,02 — 0,1; вода водопроводная до

100,0; рН (после стерилизации) 6,8-7.0, .Бутылки засевают посевной культурой клубеньковых бактерий солодки в количестве 5 /. Бутыли встряхивают.на качалке в течение 72 — 96 ч при Т 28 — 30 С, Титр

5-6 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей используют для смеси с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН

6,8 — 7,0, с влажностью 30-40 в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад.

Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость+ меласса (6 /) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 млрд/г тор1698242

Таблица 1

Вирулентность

Варианты инокуляции штаммами

Азотфиксирующая активность

Нитрогеназная активность, мк моль

С2 Н 4/сосуд/ сут*

Характеристика клубеньков количество клубеньков на 1 растение

0,01**

Нет

Беэ инокуляции

Штамм 3101 Мелкие, 1-1,5 мм, округлые и цилиндрические, розоватые, в основном вокруг главного корня

2,68

0,01

0,01

Нет

Штамм 425а

Штамм 282

Единичные, не на всех растениях, мелкие, до 1 мм, округлые, бурые на боковых ко нях

* Статистическая обработка, Р— 7,8%, НСРоь — 0,33, ** Фоновая величина нитрогеназной активности, Таблица 2

* Статистическая обработка, Р— 1,8, НСРоь — 1,1 мг/ сосуд, фа и влажности 45 — 50 . Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 сут. при

15-20 С. Ризоторфин хранят при 3 — 8 С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Риэоторфин для солодки голой на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворимую в ваде. Влажность готового продукта 50-55%, Риэоторфин содержит 3-4 млрд бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес. со дня изготовления. Расход препарата 200 r на гектарную норму семян.

В таблице 3 приведены данные по эффективности инокуляции солодки голой штаммом 3101, Эффективность инокуляции солодки го5 лой штаммом Bradyrhlzobium sp, (Glycyrrhiza) 3101 представлена в табл.3.

Из табл.3 следует, что штамм 3101 является активным азотфиксирующим симбионтом солодки голой и благодаря этому

10 свойству способен повышать урожай зеленой массы растения-хозяина на 7,0 ц/га (61,4о ) и увеличивать содержание белка в растениях на 3,2 .

15 Формула изобретения

Штамм клубеньковых бактерий

Bradyrhizobium sp. (Glycyrrlza) ВНИИСХМ3101 для производства бактериального удобрения под солодку голую.

2010

1698242

Таблица 3

Составитель С.Левин

Редактор Н.Сильнягина Техред М.Моргентал Корректор Т Малец

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4365 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5