Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклонального антитела к антигену мембран жировых глобул женского молока

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в лабораторной иммуногистохимической диагностике ряда опухолей, экспрессирующих антиген мембран жировых глобул женского молока (АМЖГМ). Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ), специфичные к АМЖГМ, Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗХ63 Ад 8.653 с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных очищенным АМЖГМ. МонАТ отбирают. МонАТ относятся к классу lgG1. В иммуногистохимическом методе монАТ ИКО-25 реагирует из нормальных тканей преимущественно с эпителием молочной железы, более слабыми реакциями этот антиген выявляется в подчелюстной и околоушной слюнных железах , бронхах, фундальных железах желудка , а также в потовых железах взрослого человека, на грани выявпения наблюдается реакция с клетками яичника. Пр ч злокачественных заболеваниях происходит перераспределение интенсивности экспрессии АМЖГМ. Он инте:-.сивно экс дрессируется в 100% случаев в опухолевых клетках карци- 3 ном молочной железы и яичника, а также в метастазах. Кроме того, данный антиген определяется на клетках аденокарцином легкого , матки, желудка, толстой кишки, почек I мочевого пузыря. Штамм депонирован под №ВСКК/П/456Д ЕМССЧ

СОЮЗ COBE СКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

rs!is C 12»! 5/20, С 12 Р 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4764632/13 (22) 31.10.89 (46) 15,12.91. Бюл. N 46 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР и Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А,Герцена (72) А.Ю.Барышников, О,В.Короткова.

З.Г.Кадагидзе, Р.И.Якубовская, T.À,Êàðìàкова, Н.И,Казачкина, Г.И.Авдеев и К.И,Жордания (53) 578.085.23(088,8) (56) Taylor I., ес. а! Monoclonal antibodies to

epithelium specific components of the human

millifat globule membrane. — Int l. Cancer, 1981, vol 28, р,17 — 21. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМ ЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К АНТИГЕНУ МЕМБРАН ЖИРОВЫХ ГЛОБУЛ ЖЕНСКОГО

МОЛОКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в лабораторной иммуногистохимической диагностике ряда опухолей, экспрессирующих антиген мембран жировых глобул женскоИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического подтверждения диагнозов раков молочной железы и яичника.

Цель изобретения — получение штамма гибридомы мыши, продуцирующей моноклональные антитела (монАТ), специфичные к антигену мембран жировых глобул (МЖГ) женского молока.

„„Я,.„1698287 А1 го молока (АМЖГМ), Цель иэобретения— получение LuTBMMa гибридомы мыши, продуцирующей моноклянальные антитела (монАТ), специф:л !ные к АЫЖГМ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы

РЗХ63 Ац 8.653 = клетками селезенки мышей ВА В/С, иммунизированных очищенным АМЖГМ, МонАТ отбираю г. МонАТ относятся к классу (ц61. В иммуногистохимическом методе манАТ ИКО-25 реагирует из нормальных тканей преимущественно с эпителием молочной железы, более слабыми реакциями TQT антиген выявляется в подчелюстной околоушной слюнных железах, бронхах, фунда:bHblx железах желудка, а .также в потовых железах взрослого человека, на грани выявления наблюдается реакция с клетками яичника. При злокаче-

cTBeHHbIx заболеваниях происходит перераспределение . н. енсивности экспрессии

АМЖГМ, Он инте: —:..::ивно экспрессируется в

100% случаев в опухолевых клетках карци- ноу молочной железы и яичника, а также в метастазах, Кроме того, данный антиген определяется на кл тках аденокарцином легкого, матки, желудка. толстой кишки, почек и мочевого пузыря. Штамм депонирован под № ВСКК/П/ 5;Д.

Штамм гибрид-..мы ИКС вЂ” 25 ¹ ВСКК (П)

456 Д получают следующим способом.

Проводят ccìатическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗХ63Ац 8.653 и клеток селезенки «! .ìyíèsèðoâaíèoé мыши линии HALB/C, Иммунизаци;о мышей проводят высокоочищенным а. тигеном, выделенным изоэлектробокусированием лз солюбилизата мембранного матрикса МЖГ

1698287!

1% ным тритоном Х вЂ” 100 в 0,01 M трис-НС1буфере с 200 ИЕ/мл котринала, получен: ным после последовательной обработки

МЖГ 0,01 М трис-НС1-буфером с 200 ИЕ/мл котринала и тем же буфером с 1 M MgClz для удаления сывороточных белков молока и периферических макромолекул, Выделение антигена осуществляют сле. дующим образом, Женское молоко центрифугируют, отделяют МЖГ от молочной плазмы, МЖГ промывают буфером с 1 M

М9С4 для удаления сывороточных белков.

Отмытые МЖГ инкубируют с 0,01 М трисНCl-буфером, рН 7,2, содержащим 1%-ный тритон Х-100, Смесь центрифугируют при

105000g 1 ч, надосадочную жидкость собирают и далее выделяют антиген при помощи изоэлектрофокусирования в градиен те о Н

?,5 — 10 и градиенте плотности сахарозь

5-50 . Фракции, содержащие специфическую активность (рН 5,3-4,3), тестируемую методом двойной радиальной иммунодиффузии в агаре с применением выведенной стандартной тест-системы, обьединяют, диалиэуют против рабочего буфера с 1%-ным тритоном Х вЂ” 100 и используют для иммунизации мышей, В результате проведенных этапов очистки удается получить фракцию, содержащую 2 мажорные белковые полосы в алектрофорезе в SI3S, соответствующие компоненту с мол. массой 85,200 Д (гликопротеидной природы), составляющему 90% по интенсивности, и мол. массой 250.000 Д (гликолипоп ротеидной природы).

Для иммунизации используют 20 — 40 мкг полученной антигенной фракции на мышь.

1-ю иммунизацию проводят внутрибрю- шинным введением антигена в адьюванте

Фрейнда. Последующие три иммунизации проводят внутривенным введением антигена.

На 7-й день после последней иммунизации мышь забивают и в стерильных условиях извлекают селезенку. Селезенку измельчают в гомогенизаторе Поттера.

Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли и трижды отмывают средой 199, Клетки селезенки и клетки миеломы P3X63Ag 8.653 сливают в соотношении 10:1 (9х10 клеток

7 селезенки; 9х10 клеток миеломы). Смесь б клеток отмывают 1 раэ средой 199 и помещают в обьеме 20 мл среды 199 во флакон обьемом 100 мл. В этом флаконе клетки центрифугируют при 800 об/мин в течение3 мин и инкубируют при 37 С в течение

20 мин, Среду осторожно насухо отсасывают и добавляют 3 мл 50%-ного полиэтиленгликоля с мол. массой 1500, Через 75 с во флакон вносят 20 мл среды 199. Клетки 3

20

30 роля используют сыворотку крови мыши, 35 а также поликлональные антитела кролика

55 раза отмывают центрифугированием. не встряхивая, и инкубируют 2 ч при 37 С в 20 мл среды роста (среда RPM1 1640, содержащая 15 телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина). Затем клетки разливают по 0,2 мл в лунки плоскодонного 96-луночного плато.

На следующий день среду роста заменяют на селективную среду (среда роста, содержащая 0,1 мМ гипоксантина, 5,8 M азасерина); Видимые колонии появляются на

20-й день в 9 лунках, Отбор гибридом — продуцентов специфических антител, осуществляют при помощи иммуноферментного анализа; каждый раэ используют две модификации

1) МЖГ женского молока фиксируют на стекле 2.5% — ным глутаровым альдегидом и высушивают нэ воздухе, затем после 40-минутной промывки в 0,02 M Na-фосфатном буфере с 0,15 M NaCI наносят среду. содержащую монАТ, на " ч при 37 С, затем среду отмывают 2 раза по 10 мин в аабуференном физиологическом растворе (ЗФР) (0,01 М

Na-фосфатный буфер, рН 7,6-7,8, с 0,15 М

NaCI), наносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой, на 1 ч при 37 С и после промывки 2 раза по 10 мин в ЗФР реакцию выявляют 0,08%-ным раствором 5-аминосалициловой кислоты. Контрольные пробы содержат ЗФР вместо культуральной среды. В качестве положительного контк МАМЖ-1.

2) В лунки полистироловых плашек наносят по 100 мкл раствора антигена МАМЖ1 в 0,02 M Na-карбонатном буфере, рН 9,5, в присутствии 1 -ного тритона Х-100 в концентрации 20 мкг/мл и инкубируют в течение 2 сут при 40С; затем избыток энтигена отмывают 0,02 M Na-фосфатным буфером, рН 7,6, с 0,15 M NaCI и наносят монАТ на

2 ч при 37 С, затем проводят отмывку 3 раза по 3 мин тем же буфером и наносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой, на 1 ч при 37 С после промывки 3 раза по 3 мин реакцию проявляют 0,08 -ным раствором 5-аминосалициловой кислоты, Гибридому, продуцирующую антитела необходимой специфичности, клонируют методом предельных разведений на фидере из клеток селезенки и тимуса мышей BALB/C:

Для приготовления фидера кусочки тимуса и селезенки разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера, Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли. Суспенэию клеток разливают по 0,1 мл в лунки 96-лу1698287 ночного плато. Через 1-7 дн плато с клетками используют как фидер, При клонировании клетки из продуцирующей лунки снимают нежным пипетированием. Клетки разводят в среде роста до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды и разливают по 0,1 мл в лунки на фидер, при этом на 2 лунки приходлтся 1 клетка, После первого клонирования колонии появляются в 14 из 72 лунок на 6-й день. В

7 лунках из 14 наблюдается положительная реакция на монАТ, После второго клонирования процент позитивных клонов равен 100%, В последующем отбор гибридом — продуцентов специфических монАТ, осуществляют иммунофлюоресцентным методом.

Продуктивность гибридомы оценивают по титру монАТ в иммунофлюоресцентном методе. На депарафинированные толуолом и гидратированные этанолом понижающейся концентрации срезы наносят супернатант, полученный декантацией культуральной среды с гибридных клеток и инкубируют

16 — 18 ч при 4 С. Затем срезы отмывают в

ЗФР 3 раза по 20 мин при перемешивании

ЗФР на магнитной мешалке и инкубируют с раствором иммуноглобулинов кролика против глобулиное белой мыши, меченных флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) в разведении 1:32. в течение 2 ч при 37 С.

Предварительно раствор иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, был обработан печеночным порошком. После инкубации с мечеными антителами срезы отмывают 3 раза по 20 мин е

ЗФР при перемешивании на магнитной мешалке. Затем срезы заключают в смесь глицерин — ЗФР в соотношении 1:1 и аналлзируют на флюоресцентном микроскопе, В качестве отрицательного контроля используют культуральную среду, не.содержащую манАТ.

Полученный штамм обозначен ИКО-25.

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши хранится в лаборатории экспериментальных моделей ВОНЦ AMH СССР, Москва, под номером 3-34.

Кул ьтурал ь н ые свойства, Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластиковую посуду, Во флакон объемом 45 см засевают по з

5 10 клеток штамма в 10 мл среды. Пассаж

1 раз в 3 — 4 дня той же дозой, без подсчета клеток — 1:3 — 1:4, Штамм выращивают при 37ОС в атмосфере 5% СО2 на среде

RPM 1 1640 или среде МЕМ в IX модификации Дул ьбек ко, соде ржа щей 15% телячьей эмбриональной сыворотки, 1 мМ/мл глютамина, 0,1 мг/мл гентамицина.

Титр антител в культуральной жидкости опрсделяют в иммунофлюоресцентном тесте. Титр " íòèòå.ë в культуральной жидкости равен 500, 5 Для выращивания асцитной опухоли из штамма гибридных кле-,ок пригодны мыши самки ВА(В/С. Интактным мышам за 1 — 7 дн дс прививки опухоли вводят внугрибрю. шинно по 0,5 мл 3%-ного пептона на вазели10 новом масле. Клетки гибоидомы иньецируют внутрибрюшинно по 10 клеток на 1 мышь в 5 мл среды, Через 7 — 10 дн. у мышей вознлкают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридом поддерживают серийными пассажами асцитной опухоли. Титр анти

55 тел в асцитической жидкости 10.000.000—

1.000.000.

Кариологическая характеристика.

Модальное число хромосом 82. Маркерных хромосом не выявлено.

Продуктивность.

Стабильность продуцирования антител сохраняется в течение 25 пассажей in vitro и 15 пассажей in v! vo, Титр антител в культуральной жидкости на протяжении 25 пассажей составляет 500-100; в асцитической жидкости титр антител на протяжении 15 пассажей 10.000,000-1.000.000.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном культивировании и посевах на питательные среды. Заражение, микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде

RPM1 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки. К суспензии клеток добавляют диметилсульфоксид до конечной концентрации 10%. Количество клеток на 1. ампулу обьемом 1 мл составляет 5 — 10х10 .

Замораживание проводят при -70 С в течение 2 ч, затем ампулы с клетками помещают в жидкий азот, Размораживание клеток проводят при 40 С в течение 70 с. Жизнеспособность клеток nocrе размораживания пс включении трипанового синего составляет 75 — 80%.

Характеристика целевого продукта, Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирует МКА igG1-класса. Класс иммуноглобулинсв определяют по методу

Оухтерлони в реакции преципитации. С этой целью используют моноспецифические сыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулиное мыши. Культуральную жидкссть гибридомы концентрируют в 10 раз раствором сульфата аммония, диализуют и помещают в центральную лунку 1%ный агар. В периферические лунки вносят моноспецифические сыворотки. Через 1 сут

1 698287

Составитель Г. Игнатьева

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор И. Муска

Редактор А. Огар

Заказ 4367 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )К-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский <омбинат "Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 образуется четкая полоса преципитации с сывороткой против иммуноглобулинов IgGlкласса.

Специфичность полученных монАТ

ИКО-25 изучают непрямым иммунофлюоресцентным методом на депарафинизированных срезах, ИКО-25 в норме реагируют преимугцественно с эпителием молочной же езы; более слабыми реакциями этот антиген выявляется в подчелюстной и околоу"иной слюнных железах, бронхах, фундальных железах желудка, а также потовых железах взрослого человека; на грани выявления наблюдается реакция с клетками яичника, При злокачественных заболеваниях происходит перераспределение специфичности антигена. Он интенсивно зкспрессируется в 100% случаев в опухолевых клетках карцином молочной железы и яичника, а также в метас.газах; существенно менее интенсивно антиген выражен в опухолях головы и шеи (20% случаен), легкого (20% случаев), желудка (30; ). Полученные AT не реагируют с клетками рака других локализаций, а также с опухолями незпителиального п роисхождения, Поскольку ИКО-25 интенсивно реагируют с первичными и метастатическими опухолевыми клетками рака молочной железы и яичника, данные антитега перспективны для разработки метода уточнения диагноза в иммуноморфологическом и иммуноцитохими"еско: . методах, а также при иммунодетекции рака молочной железы и яичника.

Пример 1, Больной А. Удалена опухоль желудка. При плановом гистологическом обследовании установлена лимфосаркома желудка. Непрямым иммунифлюоресцент5 ным методом с применснием монАТ ИКО25 реакции на получено, Пример 2. Больная Б. Удален яичник, пораженный опухолью, При плановом гистологическом обследовании установлена

i0 серозная сосочковая аденокарцинома яичника. Непрямым иммунофлюоресцентным методом с приме:e!" èåì MKG-25 получена интенсивнейшая ре" êöèÿ с опухолевыми клетками, 15 Пример 3, Больная 8, Удалена опухоль молочной железы и лимфатические узлы. При плановом гистологическом обследовании установлен внутрипротоковый рак с метастазами в подмышечные лимфатиче20 ские узлы. Непрямым иммунофлюоресцентным методом с применением ИКО-25 получена интенсивная реакция с опухолевыми клетками как в первичном, так и в метастатических очагах.

25 Полученные монАТ ИКО-25 могут быть использованы для уточнения диагноза в им-, муноморфологическом и иммунохимическом методах.

30 Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus LI К БСКК(П)

456Д вЂ” продуцент моноклонального антитела к антигену мембран жировых глобул жен35 ского молока.