Способ выделения бактерий bacillus масеrаns из почвы

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к селекции микроорганизмов, и может быть использовано при выделении новых штаммов Bacillus macerans. Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селективности . Способ осуществляют следующим образом. Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду, содержащую, г/л: альфа-декстрин 3- 10; кукурузный экстракт 0.19-0.21; К2НР04 0.19-0.21; (МН4)2НР04 0,19-0.21; вода до 1 л. и инкубированием ее в атмосфере N2 при 48-49°С в течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на картофельно-глюкозном агаре (КГА) и инкубировзнием npt- 48-49°С в течение 48-50 ч. Полученные на КГА изолированные однотипные по морфологии колонии микроорганизмов пересевают намясо-пептонныйагар(МПА)и идентифицируют . Способ способствует 100% выделению бактерий Bacillus macerans. 6 табл. (/) С

| ск:, Г,н ir Klii

Г Of,.ifÃ, ЛИСТ И lf Сг K

f l С"ГУГ ЛИК (sf is С 12 N 1/02

ГСГУДЛРГTBEffflf, KOMUlTET

flO ИЗО,Pf TFffÈßfË И OTKPhlТИЯМ

ПРИ (Кfit СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4801038/13 (22) 11.01.90 (46) 07.01.92. Бюл N-. 1 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) Н.Г.Усанов. О.Н.Логинов и А.И.Мелентьев (53) 576.8 (088.8) (56) Zentr. Bact. Parasitenk. 1905, 14, 772-781.

"Agricaltur Handbook", N 427, 1973, 275. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ

BACILLUS MACERANS ИЗ ПОЧВЫ (57) Изобретение относится к микробиологии. в частности к селекции микроорганизмов, и может быть использовано при выделении новых штаммов Bacillus macerans. Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селекИзобретение относится к экспериментальной микробиологии в частности к селекции микроорганизмов. может быть использовано при выделении новых штамMo8 Bacillus macerans, Известен способ выделения В macelans. предложенный F.Schardingef более подробно разработанный J.Н.Northrop (1 2) Способ заключается в том накопительную культуру получают путем инкубирования в течение 4 — б дней проб, взятых с поверхности клубней картофеля и помещенных в пробирки, содержащие ломтики стерильного картофеля. Выращивание накопительной культуры проводят при 37 С. Чистую культуру получают высевом пробы из накопительной культуры методом Коха на глюкозный агар и инкубацией в течение 2 сут при

37 С.

„, 5Ц, „1703681 Л1 тивности. Способ осуществляют следующим образом. Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду, содержащую, г/л: альфа-декстрин 310; кукурузный экстракт 0,19-0,21; К2НРО4

0,19-0.21; (NH4)zHP04 0,19-0,21: вода до 1 л, и инкубированием ее в атмосфере N2 при

48 — 49 С в течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на картофельно-глюкозном arape (КГА) и инкубированием при

48-49 С в течение 48-50 ч. Полученные на

КГА изолированные однотипные по морфологии колонии микроорганизмов пересевают на мясо-пептонный агар(МПА) и идентифицируют. Способ способствует 1007(, выделению бактерий Bacillus macerans. б табл.

Данный способ не обеспечивает селективности выделения Вас.macerans. так как на картофельной среде хорошо развиваются Вас,subtilis. Bac.polimyxa. Вас,сегоus, Вас.licheniformis, Вас.circulans и другие представители рода Bacillus, причем наиболее сильно доминируют виды Вас.subtilis u

Bac.polymyxa, что очень сильно затрудняет выделение Вас.macerans на стадии чистой культуры.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения микроорганизмов вида Вас.macerans, включающий получение накопительной культуры путем

10-дневного инкубирования в анаэробных условиях, атмосфере йг, влажного образца почвы с периодическим (3 раза) добавлением к нему КМОз. Чистую культуру получают

1703681 следующим образ м По окон«ан 1» инкубации 1 г образца почвы суспендируют в стерильной воде и рассевают методом Коха «а чашки Петри. содержащие глицериновый агар. Засеянные чашки Петри инкубируют 5 при 28 С в течение 3-4 сут (3).

К недостаткам способа относится то, что он длителен по времени и трудоемок, особенно на стадии получения накопительной культуры. Трудоемкость заключается в 10 необходимости дискретного добавления

КИОз в образец почвы с последующим созданием анаэробных условий и поддержания определенной влажности образца почвы на п ротя жени и 10 сут. Существен ным недостат- 15 ком является также то, что в накопительной культуре кроме Вас.macelans хорошо развиваются Вас.polymyxa и Вас.lichemifor mis, что снижает селективность процесса выделения. Кроме того, способ неэффективен со 20 многими образцами почв.

Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селективности.

Поставленная цель достигается тем, что 25 согласно способу выделения микроорганизмов вида Вас.macerans из почвы, включающему получение накопительной культуры иэ образца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом 30 на агаровую среду. культивированием бактерий и отбором типичных колоний по культурально-морфологическим признакам, получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготов- 35 ленной иэ образца почвы на питательную среду, содержащую г/л:

Альфа-циклодекстрин 3-10

Кукурузный экстракт 0.19 — 0,21

К2Н Р04 0,19-0,21 40 (NH4)zН Р04 О, 19-0,21

Вода До 1 л из al аровых сред используют картофельноглюкозный агар (КГА), при этом получение накопительной культуры и культивирование 45 на агаровой среде осуществляют при 4849 С в течение 48-50 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Накопительную культуру получают пу- 50 тем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду особого состава с содержанием компонентов, г/л;

Альфа-циклодекстрин 3-10

Кукурузный экстракт 0.19-0,21 55

К2Н РО4 0,19-0,21 (N Н4)2Н РО4 0,19-0,21

Вода До1л и выращиванием в атмосфере Nz при 4849 С s течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из Hal cпительной культуры на КГА и инкубированием при 48 49" С в течение 48 50 ч. Полученные на КГА изолированные колонии микроо1)ганизмов одного морфологического типа пересевают на мясо-пептонный агар (МП Л) и идентифицируют известными методами

Пример 1 (прототип).

К каждому из десяти образцов почвы, произвольно отобранных в лесопарковой зоне г.уфы (диаметр образца 11 см, высота

7 см), добавляют по 2,1 г К1чОЗ и помещают в анаэростат. Инкубирование проводят при

28 С, в атмосфере Nz, при постоянной влажности образца, равной 55 . Через 3 и б сут к каждому образцу почвы добавляют повторно 2.1 г ККОз. Время инкубации 10 сут.

Чистую культуру выделяют следующим образом: 1 г из каждого образца по<вы по окончании инкубации суспендируют в 100 мл стерильной воды и полученную суспензию высевают методом Коха на чашки Петри с глицериновым агаром, состава. г/л:

Глицерин 1.0

Пептон 1,0

Дрожжевой экстракт 0,1

КМОз 3,0

Агар 10,0

Вода До 1л

Инкубируют засеянные чашки Петри при 28 С в течение 4 сут, По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии различных морфологических типов (иэоляты). Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и

Гордон (3,4). Результаты идентификации и количество колоний, высеянных с каждого образца почвы, приведены в табл. 1.

Пример 2. 1 г почвы из образцов, отобранных при тех же условиях, что и в примере 1, суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вносят B пробирки с 5 мл стерильной среды. состава, г/л:

Альфа-циклодекстрин 5,0

Кукурузный экстракт 0,2

К2Н РО4 0,2 (М Н4)2Н РО4 0.2

Вода Дo1 л

Пробирки помещают в анаэростат и инкубируют при 48 С в течение 48 ч в атмосфере Nz. По окончании выращивания пробы из каждой пробирки рассевают методом Коха на чашки Петри со стерильным КГА. 3асеянные чашки Петри инкубируют при 48 С в течение 48 ч. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон (3,4). Результаты идентификации и количество изолятое. высеянньгх с каждо о образца почвы. приведены в табл. 2.

П ри мер 3. 1 г почвы образца1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и

0 5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильных сред, состав которых приведен в табл. 4. Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают первую повторность при 48 С, вторую — при 49 С в течение 48 ч в атмосфере

Мg. По окончании выращивания пробы из каждой пробирки пересевают методом Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют при 48 С в течение 48 ч, По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и

Гордон (3.4) Результаты идентификации и количество и3олятов. выросших из пробирок со среда и 1 -17 при 48 и 49 С. представлены в табл. 3.

Пример 4. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и

0,5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной среды 2 (см, табл.

4). Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают при 48 С в атмосфере N2. Время инкубирования одной пробирки составляет 24 ч, второй — 36 ч, третьей — 45 ч, четвертой — 48 ч. пятой — 50 ч, шестой 72 ч. По окончании инкубации пробы из каждой пробирки пересевают методом

Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют 48 ч при 48 С. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон (3,4).

Результаты идентификации и количество изолятов. выросших на КГА. представлены в табл. 5, Пример 5. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и

0,5 мл полученной суспензии вводят в пробирки с 5 мл стерильной среды 2 (см табл.

4). Инокулированные пробирки выращивают в атмосфере Л1 Одну пробирку г ри 50 С вторую при 49 С, третью при 48 С. четвертую при 45 С, пятую при 40" С. Время инкубации составляет 48 ч. По окончании инкубации пробы из каждой пробирки высевают методом Коха на чашки Петри с 1 ГА

Засеянные чашки Пе ри инкуби,", о р,i

48 С в ечение 48 ч. По окон«ан и нкубации на чашках Петри получают изс., рован5 ные колонии, которые пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги.i Гордон (3,4) Результаты идентификации и количество изолятов, полученных на КГА. пгедставлены в табл, 6.

10 Использование для выращивания накопительной культуры жидкой среды с а ьфациклодекстрином позволяет ускорить процесс выделения микроорганизмов вида

В.macerans. Процесс выделения поданному

15 способу осуществляется в течение 4 дней, в прототипе за 14 дней. Кроме этого, использование альфа-циклодекстрина в качестве единственного источника углерода и высокой температуры выращивания (48-49 C)

20 обеспечивает практически 100 селективность процесса выделения Вас.гласегапз иэ-за того. что представители этого вида наиболее хорошо приспособлены к потреблению этого углевода в анаэробных

25 условиях. при высокой температуре (4849 С), нежели другие виды микроорганизмов.

Формула изобретения

30 Способ выделения бактерий Bacillus

macerans иэ почвы, включающий получение накопительной культуры из образца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом на агаровую сре35 ду. и культивированием бактерий и отбором типичных колоний по культурально-морфологическим признакам. о т л и ч а ю щ и йс я тем. что, с целью ускорения процесса выделения и повышения его селективности.

40 получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготовленной из образца почвы. на питательную среду. содержащую. г/n:

Альфа-циклодекстрин 3-10

45 Кукурузный экстракт 0.19-0.21

КзНРО4 0,19-0.21 (N H4) Н Р04 0,19-0.21

Вода До 1 л, из агаровых сред используют картофельно50 глюкозный агар. при этом получение нлкопительной культуры и культивирование на агаровой среде осуществляют пр«48-49 C в течение 48-50 ч.

1703681

Таблица 1 нных как виды

Bacillus

licheniformi s;

Количество изолятов идентифицирова

Bacillus Bacillus polymyxa

maceians

Образец Количество изо- лированных ко-!

1ОНИЙ Нд глицериновом агаре

7

1

1

3

5 б

8

Итого

7

4

10

12

20 бб

Таблица 2 ство иэоввтов иоентифиоиооввннык квк витСы с lus polymyxa l Bacillus

Количество изо- Количе, лированных ко- Ва

Образец ( лоний на macerans

1 глицериновом

licheniformls агаре

Таблица 3 олятов на КГА, высеянных из культуры. выросшей при температуре ! ! 49 С

Вид микроорганизмов т=

Среда Количество из накопительной

48 С

11 б

В. macerans

В macerans

В. п1асегans

В macerans

12

3

В, macerans

9

В. macerans

В. macerans

В. macerans

2

4

6

8

10

2

4

5 б

8

11

12

7

5 б

6

14

17

12

7

5 б

7 б

14

17

10

1703681

Продолжение табл 3 табалца а к Сккnрнснxы кут 1 2

Таблица 5

Таблица б емпература выращи, ания накопительной культуры. С

В.

12

11

Составитель Г Усанов

Редактор Л. Волкова Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Алк,"а-чикао,аекстрлн

Кукуруаныи экетракт

К тт РОл т нлук РО4, вола

49

48

ЗО,В0

0 20, 0 с 020 02

020 02 ство изолятов Количество изолятов, идентифицированн на КГА как в ы

17

11

12