Способ диагностики ревматизма

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическон диагностике ревматизма. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа диагностики ревматизма. Для достижения цели маркер ревматизма - аллоантиген В-лимфрцитов Д8/17 - выявляют , в микролимфоцитотоксическом тесте, что не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, упрощает и сокращает время диагностики.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (И) А" (Я)5» 01 И 33/577

P;r

ОПИСАНИЕ HSOE»PETEHNR

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4716357/14 (22) 05 ° 07.89 (46) 23.01.92. Бюл. ; 3 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (72) Н.A.Шостак, B..Н.Анохин, P.ß.Âîéëîêîâà, Т.В.Казакова и Е.И.Морозова ! (53) 615.373(088.8) (56) А.К.Khanna, A.Gibofsky, D.R.Buskisk et al. genetic studies in

Pheumatic Fever: I Presence of à new

НЬА. В-cell а11оапс1до» in probands

and famalies as йеГined by à monoclo—

nal antibody Arthrit.is Foundation

and HIM Foundation, 1986, р. 5-8.

Изобретение относится * медицине, в частности к иммунологическим способам диагностики ревматизма.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа диагностики ревматизма.

Способ осуществляется .следующим образом.

Кровь для исследования получают венепункцией кубитальной вены в количестве 20,0 »»л. В качестве антикоагулянта используют гепарин Рихтер"

300 МЕ, Кровь разводят средой 199 в

Соотношении 1.: ?,6. Разведенную I:ронь осторожно наслаинают ластеронской» пипеткой на 3,0»»ч +II»: .lë-я.р1граЛпнлвого градиента плотностью 1, 1. 8, центрифугируют 25 мин при 1500 об.. мин (350 g). Пастеровской пипеткой с тон2 (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТИЗМ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологической диагностике ревматизма. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа диагностики ревматизма. Для достижения цели маркер ревматизма — аллоантиген В-лимфоцитов <8/17 — выявляют в микролю»фоцитотоксическом тесте, что не требует дорогостоящего oGop:läîвания и реактивов, упрощает и сокращает время диагностики. Ф ким концом "отсасывают" беловатое >

"облачко" лимфоцитов в пробирку со средой 199, тщательно ресуспендируют и отмывают средой 199 путем центрифугирования при 1500 об/мин (350 g) в течение 9 мин. Далее разделяют клетки в колонках с нейлоновой ватой с предварительной подготовкой среды и колонок для разделения л»»»»*оц»»тов.

К 50,0 мл среды 199 прибавляют 2,0 мл. инактивированной эмбриональной телячей сыворотки, перемешивают во флаконе стеклянной палочкой и помещают в ). термостат при 31 С. В чашке Петри 3 однораэовж»»» иглами волокнят 50 мг

HP ЛОНОНОй ВатЫ ДЛЯ ЯЬДСЧ .. В ЦЯ вЂ” КЛС— ток. Колонку на /3 рыхло эапол»»яют нейлоновой ватой и промывают 150,0 мп ,физиологического раствора, эате» теп-.

1707542.лой средой 199. Промытую колонку помещают в горизонтальном положении в увлажненной чашке Петри в термостат при температуре 37, 4 С. Лим юцить», отмытые средой 199, разводят в 1,0 мл нагретой до 37,4 С среды (199 + Э С).

Суспензию лимфоцитов по каплям прибав,ляют в колонку, которую непосредствен:но перед введением клеток промывают 1р ,2,0 мл теплой среды (119 + ЭТС). Ко;лонку помещают в термостат на увлажненной чашке Петри на 30 мин при о

37,4 С. После инкубированпя ставят колонку вертикально и промывают последо 15 вательно над 6 пробирками, прокапьвают через колонку над каждой пробиркой около 8,0 мл среды (199 + ЭТС).

При 2фомывании колонки над пробирками

1 и 2 производят энергичное "встряхи- 2р

1 ванне, а начиная с пробирки 3 — осторожные возвратно-поступательные двиl ,жения, не касаясь верхнего слоя ваты. Над пробирками 5 и 6 выдавливают всю

1жидкость из колонки, отжимая вату. 25

В пробирках 5 и 6 собираются В-клетки.

Лимфоциты из пробирок 5 и 6 отмывают

2 раза путем центр»»фугирования пр!» 1500 об/мин (350 g) в тс.-<ение 10 мин, затем тщательно ресуспендпруют, дово- 30 дя до концентрации 1,5х10 клеток в 1,0 мл, и используют для постановки микролимфоцитотокс»»ческого теста, В микрокамеру под вазелиновое масло, которое используется в количестве

0,005 мл в каждо i тестовой. лунке в качестве покрытия для предотвращения испарения небольшого ксличества реагентов, последовательно раскапывают микрошпрпцом типа Гамильтон: 1 — моно-40 клональные антитела Д8/17 в количестве 0,001 мл в центр опьггных лунок (всего использовали 6 лунок микрокамеры: 3 первые контрольные, 3 опьггные) 2 — В-лимфоциты, полученные по- 45 сле разделения на колонках с нейлоновой ватой, в количестве 0,001 мл

Вносят в каждую тестовую лунку (3 контрольные и 3 опытные). Тщательно перемешивают в опытных лунках моноклональные антитела Д8/17 с В-клстками. Затем микрокамеры инкубируют

10 "мин при температуре +4 С. После

»»нкубации в каждую л 1ку закаггывают . 1

" э мл свежераэморожснного комчле° 55 мента и помег»ают в термостат на

25 мин при температуре 37 С. Затем в каждую лунку добавляют по 0,003 мл оэнна для окрашивання. Через 2 мин закапывают по 0,005 ил нейтрального формалина для фиксации реакции. Учет реакц»»»» проводят на инвертированном микроскопе ИБИ-14 и выражают в процентах. Подсчитывают число погибших клеток на 100 клеток в каждо»» лунке.

Разница между процентом пог»»бш»»х клеток на 100 клеток в каждой лунке.

Разница между процентом погибших клеток в контроле и опьгге является результатом теста и отражает процент

В-клеток, прореаг»»ровавших с моноклональными антителани Д8/17. Положительньм считают результат более 10Х.

Пример 1. Больной Е., 21 год.

Заболел в ноябре 1988 года через

2 недели после ангины, когда появились боли и припухлость в крупных суставах. В апреле 1989 года на фоне мигрирующего артрита стал отмечать боли в области сердца и сердцебиения, в связи с чем был госпитализирован.

После полного клинико-лабораторного обследования был поставлен диагноз: ревматизм в активноп Лазе. Первичньп» ревмокардит. Формирующийся митральный порок сердца. Н-О.

Для выявления генетического марк,ра ревматизма — аллоантигена В-лим„ эцитов Д8/17, был применен предлагаемь»й метод. Выделенные В-клетки вносили в тестовые лунки микрокамеры в количестве 0,001 мл в каждую; в опытные лунки были предварительно эакапаны моноклональные антитела Д8/17 в количестве 0,001 мл. Проводили инкубацию

В-.лимфоцитов с моноклональными антителами при +5 С в течение 8 м»»н, посо ле чего добавляли во все лунки

0,005 мл комплемента. Инкубацию на этапе комплемента проводили в течение

20 мин при 37,5 С. Производили окраску и фиксацию так же, как описано ранее. В результате. исследования выявлено 20Х "положительных" В-клеток, :то свидетельствовало о наличии на В-лимфоцитах данного больного аллоантигена

-Д8-17-генетического маркера ревматизма и подтверждало диагноз.

Пример 2. Больная К-ва, 11 лет.

В 1986 г у больной после переохлаждения отл»ечались явления артрита с преимущественным поражением мелких суставоа стоп, голеностопньгх, к зле):нюх сус.тавов, лихорадка до 37,4 С. Состояние было расценено как ревматопдный артрит по поводу которого в течсние нескольких месяцев проводилось лечение. В ян° 5 1707542

Формула изобретения

Составитель P.Ãóìåíþê

Техред М Моргента. вЂ, Корректор М.Самборская

Редактор Н.. 1аэаренко

Заказ 264 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводствнно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 варе 1989 года после ангины на фоне . вновь появившихся явлений артрита впервые были отмечены гиперкинезы, раздражительность, плаксивость. При обследовании в клинике у больной выявлен зндомиокардит, малая хорея, что в сочетании с,лабораторными данными позволило поставить диагноз: ревматизм в активной фазе, II ст. актив- 10 ности. Эндомиокардит с поражением митрального клапана. Малая хорея. Подострое течение Н-о. Перенесенньп ранее артрит расценен как первая атака ревматизма. 15

Проведено выявление генетического, маркера ревматизма В-клеточногоалло антигена Д8/17 в микролимфоцитотоксическом тесте. Были получены В-лимфоцйты, как описано в примере 1. Моно- 20 клональные антитела Д8/17, внесенные в тестовь:е опыт п1е лупки микрокамеры, смешивались с О, 001 мл В-клеточной суспенэпей. В-клетки были также внесены в лунки omn . Инкубация проводи11 II 25 лась в течение 12 мин при температуо ре 4 С, после чего в лунки добавляли комплемент s коли естве О, 005 мл, микрокамср l помещалась в термсстат при температуре 38,С на 20 мин. Затем 30 проводилась окраска и фиксация, как описано в примере 1. При подсчете ре11 зультата реакции получено 22 положительных" В-клеток, что подтверждает правильность постановки диагноза.

Способ позволяет обнаружить аллоантиген Д8/17 у 96 больных, что свидетельствует о закономерном характере носитсльства данного маркера у больных ревматизмом. Использование спосооа позволит без больших материальных затрат ускорить и упростить диагностику ревматизма.

Способ диагностики ревматизма путем инкубации В-клеток с моноклональными антителами Д8/17 с последующей оценкой результатов реакции иммунологическим методом и при выявлении Но сительства аллоантигена В-лимфоцитов диагностируют ревматнзм, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, инкубацию осуществляют при 4-5 С в течение

8-12 мин дополнительно вносят комt о племент и инкубируют при 37 — 38 С в теч.-ние 20-25 мин, а результаты реакции оцснивают с помощью лимфоцитотоксического теста.