Штамм бактерий sнigеllа sonnei используемый для приготовления живой вакцины против дизентерии зонне

 

Изобретение относится к медицине, в частности к профилактике дизентерии Зонне. Целью изобретения является штамм Shigella sonnei 13359, обладающий высокой иммуногенностью, стабильным уровнем остаточной вирулентности, маркированный, безопасный для использования в качестве живой вакцины против дизентерии Зонне, хорошо растущий на простых питательных средах. Бактерии вакционного штамма несут две мутации - зависимость по пурину и рифампицинрезистентности, связанные с аттенуацией. Наличие оптимального уровня аттенуацйи обеспечивает высокую иммуногбнную активность вакцинного штамма, уста'новленную как в опытах эффективной защиты лабораторных животных от заражения вирулентным штаммом шигелл Зонне, так и при клиническом испытании при регистрации у вакцинированных высокого титра специфических копроантител. Две мутации у бактерий (pur'/rif*^), связанные с утратой вирулентности, обеспечивают безопасность использования штамма в качестве живой вакцины и служат маркерами, позволяющими дифференцировать вакцинный штамм от штаммов шигелл Зонне естественного происхождения. 2 табл.ч^ч*'ЁVJ о00со ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ е (21) 4799475/13 (22) 05.02.90 (46) 30.01,92. Бюл. N 4 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Лейпцигский институт медицинской микробиологии и эпидемиологии университета им. К.Маркса и Научно-исследовательский институт заразных и паразитарных болезней Медицинской академии Болгарии (72) В.M,Áîíäãðåíêî, K.Ëèíäe, В.Денчев, Ю,M,Poìaíoaà, С.Маринова, M.Áðàòîåâà и

И. Цветанов (53) 576.851.49 (088.8) (56) Белая Ю.А., Бирковский Ю.Е., Милованова Л.П, и др. Испытание безвредности, реактивности и имммуногенности живой дизентерийной вакцины Флекснера 2а и Зонне из спонтанных мутантов. — Жур. микробиол. 1977, ¹ 1, с.20 — 25.

Nel. D,M., Gangarosa ЕЛ., Radoranovic P.

et.al. Studies on vaccinatIon agalnst baclllary

dysentery, — Bali. Uno, 1971, Vol. 45. р. 457464. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЯН16Е(1 А

SONNEI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ

ДИЗЕНТЕРИИ ЗОННЕ

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения вакцинных штаммов, которые могут быть использованы в медицине для профилактики дизентерии Зонне, В соответствии с требованиями вакцинные штаммы должны быть высокоиммуногенными, стабильными по остаточной... Ы,, 1708351 А1 (я)5 А 61 К 39/106, С 12 N 1/20 (57) Изобретение относится к медицине, в частности к профилактике дизентерии Зонне. Целью изобретения является штамм

Shlgella зоппе! l 3359; обладающий высокой иммуногенностью, стабильным уровнем остаточной вирулентности, маркированный, безопасный для использования в качестве живой вакцины против дизентерии Зонне, хорошо растущий на простых питательных средах. Бактерии вэкционного штамма несут две мутации — зависимость по пурину и рифампицинрезистентности, связанные с аттенуацией. Наличие оптимального уровня аттенуации обеспечивает высокую иммуногенную активность вакцинного штамма, установленную как в опытах эффективной защиты лабораторных животных от заражения вирулентным штаммом шигелл Зонне, так и при клиническом испытании при регистрации у вакцинированных высокого титра спецм: ических копроантител. Две мутации у бактерий (pur/rlf ), связанные с утратой вирулентности, обеспечивают безопасность использования штамма в качестве живой вакцины и служат маркерами, позволяющими дифференцировать вакцинный штамм от штаммов шигелл Зонне естественного происхождения. 2 табл. вирулентности, безопасными и нести маркеры для их дифференциации от штаммов естественного происхождения.

Известны вакцинные штаммы Shigella

sonnei, полученные путем селекции спонтанных авирулентных клонов.

Однако спонтанные авирулентные мутанты шиггел не отвечают таким требовани17083"11 ям, как генетическая охарактеризованность в связи с трудностями расшифровки их гейотипа, приводящего к утрате вирулентности, что свидетельствует об их нестабильности и небезопасности и делает невозможным повторное выделение такого типа штаммов при утрате исходным вакциОнным штаммом иммуногенности.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм S,sonnei !, зависимый QT стрептомицина. Штамм характеризуется достаточной им муно ген н остью, генетически охарактеризован, маркирован.

Недоста гком ст Г(ептомици нза Висимь! х штаммов яв"",ëeòñÿ нестабильность, связанная с наличием одного маркера, приведшего к аттенциации, небезопасн ость использования и необходимость добавления антибиотика в -.ðåäó Вь1ращивания, что ограничиваст применение таких вакцичных штаммов из-за возможности аллергизации организма.

Целью изобретения является штамм

S.sonnei I 3359, обладающий высокой иммуногенностью, стабильным уровнем ocTBTo÷ной Виp/ëентности, марKèpоеанHûé, безопасный для использования в качестве . живой вакцины для профилактики дизентерии Зонне, хорошо расту@и(4 на простых питательных средах.

Штамм 5.воппе! l 3359 получен с исг(ользованием траг, .;ционных гене;-::;:ко-селекционных при-мов (путем обработки мутагеном и отбором} из штамма S.sonnel I

1180, характеризу1о;цегося низкой частотой утраты плазмиды фазы, варьиру::още,"1 в

Д пределах 10 0 . Бактерии исходного ш гамма зс ВИСИМ ь(по нико ИНОВОИ кису(о Г е.

Штамм S,sonnel i 3359 депонирован в кЬ(1лекции(I ) "„K им . арасевича г(од Е

Отбор штамма производится путем первичнои селекции зависимых попурину мутантов с последующим введение;-4 в ауксотрофный:<лен мутации устойчивости к рифам пици ну, Kë o (ы, сО;кpа ни вшие плазми ду 120МД контролиру(ащую синтез антигена Iфазы :и инвазивну;о актив,-(ость шиггел, характеризуются способностью г(рсникать

В КЛЕТКИ 1Е а, ОбЛВД210Т ВЫСОКОЙ ИММУHO генность(G и несут две мутации, сообьцающие бактериям потребность в (гурине и устОЙчивость к Оифампицину, каждая из l(o торых ведет к снижению вирулентности, что определя(стабильность аттенуации и безопасность таких штаммов.

Штамм Shlgelia sonne! ГИСК М 192 характеризуется следу(ощими свойствами, Морфологические признаки, Бактерии

LUT2l4M3 Грамотр(ицательные палочки, средние размеры на фиксированных окрашенных препаратах 2,5-3,0 х 0,5-0,7 мкм. лишены капсул и спор, неподвижны, не обладают жгутиками, Культуральные признаки. На мясопеп5 тонном агаре (МПА), питательном агаре

"Дифко" штамм образует круглые, гладкие колонии в S-форме. Имеются единичные колонии в R-форме (ll фаза!. формирующиеся с частотой 2х10 — 1х10 . На среде Эндо

":,0 клетки штамма дают образование круглых, бледно-розовых прозрачных колоний. В мясопептонном бульоне дает равномерное помутнение с легким осадком. Кипячение в течение 2 ч не влияет на мутность взвеси и !5 не ведет к увеличению осадка.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Максимальная скорость роста при 37 С и рН 6,8 — 7,5.

Штамм ферментирует глюкозу, фруктозу.

20 маннозу, мальтозу, маннит, замедленно лактозу. Декарбоксилирует орнитин, дает положительную реакцию с метиловы(л красным. Не ферментирует сахароэу, ксилозу, дульцит, адонит, инозит, глицерин, сали25 цин, не продуцирует индол, не образует сероводорода, не гидролизует аргинин и жел ат и ну.

Антигенная структура. Характеризуется антигенной специфичностью, типичной для

30 шигелл Зонне l фазы. Колонии в S-форме даюг выраженную агглютинацию на стекле с сывороткой шиггел Зонне I фазы, свидегельствующую о сохранении бактериями собственной плазмиды 120 МД, не обуслов35 ливают реакции агглютинации с сывороткой

Il фазы. Колонии R-формы (II фаза). теряющие плаэмиду I фазы с частотой 2x10—

1х10, агглютинируют с сывороткой II фазы и становятся чувствительными к действию

40 R-специфического фага F2.

Вирулентность. Заражение в коньюнктиву глаза морской свинки в дозе 1-2х10 и бактерий не приводит к развитию кератоконьюнктивита в течение 2-недельного сро45 ка наблюдения.

Введение в сегмент перевязанной тонкой кишки кроликов 10 петлевых единиц по исходному вирулентному штамму шигелл бактерий аттенуированного мутанта

50 S.sonnel 3359 дилатации не обусловливает, уровень остаточной вирулентности, оцениваемь(й по способности шигелл проникать в цитоплазму клеток He!a, осуществлен при исследовании препаратов с помощью све55 товой и электронной микроскопии. Бакте. рии аттенуированного мутанта S.sonnel

3359 через б ч инкубации проникают и обнаруживаются в 52,3 3,8 клеток монослоя, однако внутриклеточное их размножение

1708351 полностью блокировано и развития цитотоксических изменений не наблюдают.

Стабильность остаточной вирулентности (аттенуации). Стабильность остаточной вирулентности и сохранение прежнего генотипа установлено после 10-кратного пассажа бактерий через конъюктиву глаза морских свинок.

Иммуногенность. Трехкратное введение в коньюнктивальный мешок 20 морских свинок 1-2х10 клеток штамма S,sonnei

3359 с интервалом в 3 дня с последующим через 2 недели заражением животных тем же способом 1,2х10 (3L0so) клеток вирулен8 тного штамма S.sonnel 1180, обеспечивает защиту 75% (15) животных от развития кератоконьюктивита. Иммуногенность штамма испытана также и на петлях перевязанной тонкой кишки кроликов массой 2-2,5 кг после трехкратного введения через зонд s æeëóдок 5х10 бактерий с интервалами в 3 — 4 дня

9 и последующим заражением исходной вирулентной культурой S.sonnei I 1180 в дозе

5х10 (5 петлевых доз) через 14 дней после

7 иммунизации в сегменты изолированных петель тонкой кишки. Аттенуированный 2маркерный штамм S.sonnei 3359 характеризуется выраженным протективным свойством, защищая 43 из 54 (80%) петель от развития энтеросорбции (подавление дилатации петли. вызываемой воспалением и продукцией энтеротоксина).

Дифференциация вакцинного штамма от штаммов естественного происхождения.

Штамм S.sonnei 3359 может быть легко идентифицирован среди выделенных культур естественного происхождения по устойчивости к 100 мкгlмл рифампицина и по зависимости от пурина.

Клиническая переносимость орально вводимых бактерий вакционного штамма

S.sonnei 3359:

Безвредность и переносимость вакцинного штамма после тщательно выполненных опытов на лабораторных животных была оценена на 6 добровольцах, 3 из которых получали перорально возрастающее количество живых бактерий в дозах 2, 4 и

6х10 с 30 мл молока. За 10 мин до вакцина9 ции давали 2 г бикарбоната натрия. 3 добровольца получили плацебо (убитые нагреванием бактерии этого же вакцинного штамма), Реактогенность и безвредность вакцины прослеживалась ежедневно в течение 2 недель постоянным контролем локальных симптомов (тенезмы) и генерализованной реакции на ЛПС О антигена (высокая температура и коллапс). Все использованные дозы переносились добровольцами беэ каких-либо клинических про5

50 явлений, т.е, вакцина при оральнои аппликации побочным действием не обладала.

Пример 1. Исходный штамм Shlgella

sonnei 1180, вирулентный по кератоконьюнктивальной пробе на морских свинках, после обработки нитрозогуанидином и пенициллинового обогащения, рассевают на чашках с минимальным агаром, содержащих и не содержащих аденина (пуриновых оснований), Таким образом удается получить клоны, зависимые по пурину, среди которых отбирают стабильные мутанты с частотой обратной реверсии к пуриннезависимости, равной 1-2х10 . Суспензию

8 одномаркерного мутанта (Pur) вводят в коньюнктивальный мешок морских свинок в концентрации 2-4х10 и отбирают клоны, О обусловливающие в отличие от исходного родительского штамма развитие отдаленного по времени (не ранее чем через 2-3 дня) кератоконьюнктивита. В аттенуированный одномаркерный зависимый от пурину клон вводят вторую мутацию путем высева на чашку с МПА, содержащим 100 мкг/мл рифампицина, в концентрации 10 — 10 и ото ю бирают устойчивые к антибиотику мутанты.

Колонии отобранных мутантов 3 раза рассевают на МПА с рифампицином и у стабилизированных клонов изучают частоту спонтанной утраты плазмиды I фазы, контролирующей синтез антигена I фазы и инвазивную активность шиггел, уровень остаточной вирулентности и иммуногенность.

Пример 2. Способность вакцинного штамма S.sonnel 3359 к созданию местного специфического иммунитета.

Выделение и эффективность вакцинного штамма изучена при его клиническом испытании на 97 здоровых детях в возрасте от

2 до 17 лет.

Перед оральной аппликлацией вакцины все дети исследованы с помощью иммуноферментного анализа(ИФА) на наличие специфических копроантител. Дети с наличием копроантител к шигеллам 3онне к клиническим исследованиям не допускались. Дети принимали вакцину натощак трехкратно с возрастающим числом живых бактерий с 5—

10х10 до 2,5-5,0х10 на 1-, 2- и 4-й день. В

7 8 клиническое испытание было включено 4 опытные и 1 контрольная группы (см. табл,1}. 1-ю группу составили 13 детей в возрасте от 4 — 6 лет, 2-ю — 27 детей в возрасте 6 — 10 лет, 3-ю — 19 детей в возрасте 11 — 15 лет, 4-ю — 13 детей в возрасте 15-17 лет и

5-ю контрольную — 15 детей в возрасте 6 — 15 лет, получавшие плацебо

Клиническое наблюдение показало, что при использовании выбранной схемы иммунизации непереносимых побочных реакций

1708351

Таблица 1

Безвредность и клиническая переносимость вакцинного штамма S. sonnei 13359 не наблюдалось. Выделение вакцинного штамма из фекалий не зарегистрировано.

Специфический антиген 1 фазы шигелл Зонне обнаруживали в копрофильтратах с помощью реакции торможения пассивной 5 гемагглютинации (РТПГА) в течение первых

4-5 дней (табл.1). Исследование динамики титров-специфических копроантител с помощью ИФА показало наличие защитных титров, особенно выраженных в течение 10 первых 2 мес (28-53 дня), с сохранением у некоторых привитых детей до 7 (210 дней ) (см. табл.2}, Штамм S.sonnel 1 3359 по сравнению со штаммом-прототипом, зависимым от стреп- 15

1 томицина, характеризуется высокой иммуногенностью и стабильностью, безопасен для использования, имеет две мутации, связанные с аттенуацией, которые одновременно являются маркерами для дифференциации вакцинного штамма от штаммов естественного происхождения, не требует при его выращивании добавления антибиотика в питательную среду, т.е, является более технологичным.

Формула изобретения

Штамм бактерий Shlgella sonnel ГИСК

М 192, используемый для приготовления живой вакцины против дизентерии Зонне.

1708351

Таблица 2

Динамика образования специфических копроантител, изученная с помощью

ИФА у детей, привитых вакцинным штаммом S. sonnei i 3359 (данные после третьей вакцинной дозы ) Редактор Т.Лазоренко Техред М.Моргентал Ко екто Н. Ревская рр р

Заказ 378 Тираж Подписное т ытиям и и ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, r, Уж ор д, у .

° Ф

r о л.Гагарина, 101