Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий bacillus suвтilis и bacillus liснеnifоrмis

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть исползовано в производстве бактерина-СЛ идругих технологических процессах, где применяются спорообразующие аэробные микроорганизмы рода Bacillus. Цель изобретения - повышение выхода биомассы, увеличение антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке. В питательную среду, содержащую в качестве основы агаризованную среду на пивном сусле и гидролизат мяса, дополнительно вводят хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны, при следующем соотношении компонентов, г/л: пивное сусло 500-600: гидролизат мяса 50- 60; хлоропластная фракция зеленого рока, полученного из листостебельной биомассы люцерны 50-100; агар-агар 25-30: вода остальное. Использование питательной среды позволяет повысить выход биомассы в среднем на 75 %, выживаемость бактерий после лиофилизации в 1,5- 1,6 раза, увеличить их антагонистическую активность в 1,5-2,0 раза. 4 табл.Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть исполь^овано в производстве бактерина-СЛ и других технологических процессах, где применяются спорообразующие азробные микооорганизмы рола Bacillus.Наиболее близкой предлагаемой является питательная среда на основе пивного сусла, обогащенная мясным гидролизатом и; микроэлементами Мп'^'^ и Си'^*, следующего состава, г/л:Пивное сусло500,0-600,0Гидролизат мяса100,0-120,0Мп^""0,01-0,05Си^^0,003-0,005Агар-агар25,0-30,0ВодаОстальноеНа известной комбинированной питательной среде происходит рост и размножение B.subtllfs и B.llcheniformls. Однако процесс накопления биомассы при длительном культивировании происходит недостаточно знергично. Кроме того, выращенные на питательной среде B.subtilis и B.llcheniformls обладают низкой устойчивостью к неблагоприятным факторам и антагонистической активностью. Входящие в состав питательной среды марганцевокали-V4О 00 00 00ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В (21) 4775802/13 (22) 28.11,89 (46) 30.01.92. Бюл. М 4 (71) Днепропетровский химико-фармацевтический завод, Центральная научно-исследовательская лаборатория комплексной переработки растительного сырья и отходов агропромышленного производства Южного отделения ВАСХНИЛ и Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного (72) В.Я.Чаплинский, Ю.Ф.Новиков, M.M,Коганов, Ю,А.Чурсинов и И.В.Косюк (53) 576.8.093.1 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N- 1520094, кл. С 12 N 1/20, С 12 R 1;10, 1:125, 1988. (54)ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДАДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ СПОРООБРАЗУЮЩИХ АЗРОБНЫХ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И

BACILLUS LICHENIFORMiS (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть исползовано в производстве бактерина-СЛ и

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве бактерина-СЛ и других технологических процессах, где применяются спорообразующие аэробные микаоооганизмы рола ВасП!ов.

Наиболее близкой предлагаемой является питательная среда на основе пивного сусла, обогащенная мясным гидролизатом и1 микроэлементами Мп и Cu . следующего состава, г/л:

Пивное сусло 500,0-600,0

Гидролизат мяса

100,0-120,0

Мп 0.01 — 0,05

».ЫЛ«1708832 А1 других технологических процессах, где применяются спорообразующие аэробные мик- роорганизмы рода Bacillus, Цель изобре-.ения — повышение выхода биомассы, увеличение антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке. В питательную среду, содержащую в качестве основы агаризованную среду на пивном сусле и гидролизат мяса, дополнительно вводят хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного иэ листостебельной биомассы люцерны, при следующем соотношении компонентов. г/л: пивное сусло 500 — 600; гидролизат мяса 50—

60; хлоропластная фракция зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны 50 — 100; агар-агар 25 — 30; вода остальное. Использование питательной среды позволяет повысить выход биомассы в среднем на 75 /,, выживаемость бактерий после лиофилизации в 1,5 — 1,6 раза, увеличить их антагонистическую активность в 1,5-2,0 раза. 4 табл.

Си + 0,003-0,005

Агар-агар 25,0 — 30,0

Вода Остальное

На известной комбинированной питательной среде происходит рост и размножение B.subtills и В,llcheniformls. Однако процесс накопления биомассы при длительном культивировании происходит недостаточно энергично. Кроме того, выращенные на питательной среде В.subtills u

В.llchenlformis обладают низкой устойчивостью к неблагоприятным факторам и антагонистической активностью. Входящие в состав питательной среды марганцевокали1708832 евая соль Оксиэтилендифосфоновой кислоты (МпКгР2Сг07Нл) и меднокалиевая соль

Оксиэтилендифосфоновой кислоты (СОК2Р2С207Н 1) являются дифицитными и дорогостоящими.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы, увеличение антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке.

Способ приготовления питательной среды включает следующие операции: отбор компонентов среды в количествах согласно рецертуре; соединение компонентов среды за исключением хлоропластнай фракции; кипячение смеси 20 — 30 мин до полного растворения агар-агара; фильтрацию среды через ватно-марлевый фильтр; хлоропластную фракцию растирают с незначительным количеством среды, после чего добавляют в основной объем среды; разливают в бактериологические матрацы по 0,3 л и автоклавируют (стерилизую.г) текучим паром при избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.

Сг1особ получения хлоропластной фракции из люцерны включает механическое обезвоживание листостебельной биомассы, которого разделяют на пресс-остаток и жидкук фракцию — зеленый {клеточный) сок.

Затем зеленый .Ок, имеющий рН 6,0, нагревают до 53 С, выдерживают при этой температуре в течение 3 мин и центрифугируют.

Осадок представляет собой хлоропластную фракцию, которую вводят в состав питательной среды.

Хлоропла"тная фракция зеленого сока., полученного из листостебельной биомассы люцерны„содержит белки и свободные аминокислоты со сбалансирОванным -составом незаменимых аминокислот, а также комплекс витаминов, углеводы, фосфолипиды, стимулятор роста растений триоконтанол и ряд минеральных веществ. В отличие от зеленого сока в ей не содержатся сапонины, полифенолы, ингибиторы ферментов и хелатообразующие вещества, которые подавляют рОст бактериЙ, I:HN>KGIDT их антагонистическую активность и устойчивость к неблагоприятным факторам, Вследствие оптимального состава oplBHH IBcKNx u минеральных веществ, входящих в хлоропластную фракцию. ее введенис в питательную среду существенно повышает выход ломассы споросбразующих аэробных бактерий, например В. subtltis u

В.! heniformis, а также увеличивает их анта Онистическую активность и устойчивость к неблагоприятным факторам.

Введение хлоропластной фракции в состав питательной среды позволяет исклю5

55 чить из нее микроэлементы (Mn и Cu ). что обусловлено наличием в хлоропластной фракции данных ионов, входящих в состав активных центров кислооодвыделяющей системы хлоропластов (Mn ) и в состав пла2 стоцианина (Cu ).

Кроме того, введение хлоропластной фракции в состав питательной среды позволяет уменьшить в два раза содержание в ней гидролизата мяса. Благодаря эффекту взаимного обогащения белков животного и растительного происхождения и ее оптимальному для спорообразующих аэробных бактерий составу увеличивается выход биомассы, повышается антагонистическая активность и устойчивость бактерий к неблагоприятным факторам. Это проявляется в более высокой выживаемости бактерий после лиофилизации и более высокой антагонистической активности по отношению к тест-микробам.

Для экспериментальной проверки состава питательной среды подготовлено 6 вариантов среды, состав которых приведен в табл. 1.

После приготовления каждый вариант различают в 50 бактериологических матрацев по 0,25 л и стеризируют текучим паром с из5ыточным давлением 0,5 атм в течение

3G мин, Засев питательных сред в матрацах производят одной и той же маточной культурой В.sub(ills и отдельно В licheniformis, содержащей в 1 мл 1 млрд. микробных тел (по оптическому стандарту мутности). B каждый матрац вносят 10 мл одной из указанных бактериальных взвесей, которую равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды. Матрацы ïîìåщают в термостат с температурой 28 С.

Выросшую бактериальную пленку на 2 — 512-й день роста собирают с каждого матраца отдельно с помощью шпателя и 0,85 -ного раствора натрия хлорида. Полученную взвесь бактерий с. хлопьями пленки гомогенизируют путем пропускания через стерильный медицинский шприц с насаженной иглОЙ. В гомогенной бактериальной взвеси определяют количество микробных тел на 1 мл питательной среды и вычисляют средние данные по каждой группе исследований.

Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Еа видно из табл. 2, питательные среды

3-6 обеспечивают увеличение выхода биомассы по сравнению с известной питательной средой. Питательная среда 2, содержащая хлоропластную фракцию в количестве 25 г/л. не позволяет получать вы1708832

i0

30

50,0--100,0

25,0--30,0

Остальное ход биомассы более высокий, чем на известной среде. Питательная среда 6, содержащая хлоропластную фракцию в количестве

125 г/л, обеспечивает практически такое же увеличение выхода биомассы. кэк и питательная среда 5, содержащая 100 г/л хлоропластной фракции. Из-за необоснованного перерасхода хлоропластной фракции питательную среду 6 использовать нецелесообразно.

Наилучшие результаты по выход биомассы получают пои содержании хлоропльстной фракции в составе питательной среды

50 — 100 г/л. Использование такой питательной среды позволяет повысить выход биомассы в среднем на 75 Р по сравнению с известной питательной средой.

Введение в состав питательной среды хлоропластной фракции позволяет получа гь спорообразующие аэробнь1е бактерии с высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам. К их числу относятся условия лиофилизации, Проведены опыты по определению влияния процесса лиофилизэции на жизнеспособность (выживаемость) бактерий. предварительно выращенных нэ питательной среде, содержащей хлоропластную фракцию, и известной питательной среде.

Для этого взвеси бактерий, выросших на известной и предлагаемой питательных средах, содерх<ащих по 100 млрд. микробных тел в 1 мл (по оптическому стандарту), разливают по 1 мл в одинаковые стеклянные флаконы емкостью 5 мл, замораживают при минус 40 С в течение 24 ч и лиофилизируют в течение 36 ч до остаточной влажности 3 — 4 . Для определения количества живых бактерий после процесса лиофилизэции во флакон вводят 1 мл 0,85,-ного раствора хлорида натрия. В дальнейшем, используя метод последовательных 10-кратных разведений в стерильном растворе 0,85 7,-ного натрия хлорида, из пробирок с разведениями 1:107 — 1:108 делают -..ысев на мясопептонный агар (по 3 чашки на разведение), Чашки с посевами помещают в термостат при 37 С и через 18 — 20 ч производят подсчет выросших колоний. Предварительно перед замораживанием по такой же методике определяют количества живых бактерий в каждой микробной взвеси.

Средние данные проведенных исследований представлены в табл. 3.

Данные табл. 3 показывают, что состав питательной среды, на которой выращивают бактерии, имеют важное значение для их выживания в процессе лиофилизации. Так, предварительное выращивание на предлагэемой питательной среде в 1,5-1,6 раза повышает выживаемость бактерий

B.subtllis и В.licheniformiq после лиофилизации по сравнению с выживаемостью этих же бактерий, выросших на известной питательной среде, Для определения антагонистической активности бактерий, выросших на известной и предлагаемой питательных средах, используют тест-микробы. Содержимое флакона (высушенный препарат бактерий) растворяют стерильной водопроводной водо, и петлей производят посев пятном 0,5 см в диаметре в центре чашки Петри с мясопептонным эгаром. После выдерживания чашки в термостате в течение 48 ч штрихом от периферии к центру наносят посевной материал тест-бактерий (1 млрд. взвеси тест-бактерий, разведенные в 0,85 %-ном растворе натрия хлорида в 5 раз).

Результаты оп ытов п ри ведены в табл. 4.

Таким образом, В.subtilis u

В.lichenifarmis, выращенные на предлагаемой питательной среде и подвергнутые последующей лиофилизации, обладают антагонистической активностью. а 1,5--2 раза превышающей таковую этих же бактерий, выращенных на известной питательной среде.

Использование изобретения позволяет повысить выход биомассы, увеличить выживаемость при лиофилизации и антагонистическую активность спорообразующих аэробных бактерий, а также снизить расходы на технологический процесс выращивания данных микроорганизмов.

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий

Bacillus subtilis u Bacillus licheniformis, содержащая пивное сусло, гидролизат мяса, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, увеличения антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке, среда дополнительно содержит хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны при следующем соотношении компонентов, г/л:

Пивное сусло 500,0 — 600,0

Гидролизат мяса 50.0-60.0

Хлоропластовэя фракция зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны

Агар-агар

Вода

1708832

Таблица 1

Таблица 2

Наименование бактерий

Среда

2- и ень

5- и ень

12- и день в% кпрототип в% к прототип в % прототип млрд. мл рд.

1 (прототип) 100

0,28

0,73

100

0,23

0,27

0,34

К45

0.60

0,71

150

0,23

0,42

0,31

0,70

91

152

0,57

1,38

189

0,36

0,44

0,53

0,77

157

157

171

167

183

195

1,10

1,42

161

164

0.37

0,46

0,60

0,79

1,22

1,46

203

200

169

164

0,39

0,46

182

169

1,46

206

200

0,38

165

0,62 182

1,24

206

Таблица 3

В. subtlils!

В.

licheniformis! B. subtilis

В.

Ilchenifor-! mis

F, subtliis

В.

iIcheni form i s

В, зиЬМ11з

В.!

lichenIformis

В. subtills

В.

lichenlforrn i s

В. subtilis

В.

lichenlforml s

Количество бакте ий, вы осших на 1 мл с е ы

1708832

Таблица 4

Составитель Г.Смирнова

Редактор Т.Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор С.Черни

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 402 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5