Способ получения днк для диагностики н @ -а, н @ -в- гепатита

 

Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики заболевания Ни-А, Hu-В-гепатита, Способ получения ДНК для диагностики Hu-А- Ни- В-гепатита заключается в том, что осуществляют стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22 мкм осаждают полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделяют осадок, растворяют его в буфере, встряхивают с фреоном в соотношении 1:1, отделяют фреоновую фазу, осаждают ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обрабатывают РНК- и ДНК- азой, фракционируют в градиенте хлористого цезия, отдел я ют фракции с плотностью Т,3 г/мл, диализуют, обрабатывают полученную фракцию протинозой К, экстрагируют 80%-ным фенолом и хлороформом, обрабатывают ДНК рестриктазой EcoRI, клонируют фрагмент ДНК в плазмиде pRR 322 или в лямбда-фагах. & В

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ . РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/10, 15/51

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356796/13 (86) PCT ЕР 88/00123 19.02.88 (22) 19.10.89 (31) P 3705512.7 (32) 20.02.87 (33) ОЕ (46) 07.02.92. Бюл. Ь 5 (72) Др. Ренате Зеелинг, Проф. Др. Ханс

Петер Зеелинг (0Е) Др. Жан Буркхард (СН) (53) 575.224.2; 577.2/048(088,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Ни-А, Ни-.В-ГЕПАТИТА (57) Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики заболевания Ни-А, Ни-В-гепатита, Способ получения ДНК для диагностики Ни-А- HuВ-гепатита заключается в том, что осущестИзобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики за-. болевания Ни-А,,Ни-В-гепатита.

Предложен способ получения ДНК, предусматривающий предварительную стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22, осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000) при конечной концентрации

10%, отделение осадка, растворение его в буфере, встряхивание с фреоном в соотношении 1:1, отделение фреоновой фазы, осаждение ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обработку РНК-азой и:ДНК азой, фракционирование в градиенте хлористого цезия, отделение фракции-с плотностью 1,3 г/мл, диализ, обработку пол;. ученной фракции протеиназой К, экстракцию 80%-ным фенолом и хлороформом, Ы 1711676 АЗ вляют стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22 мкм осаждают полизтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделяют осадок, растворяют его в буфере, встряхивают с фрероном в соотношении 1;1, отделяют фреоновую фазу, осаждают ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обрабатывают PHK- и ДНКазой, фрак ционируют в градиенте хлористого цезия, отделяют фракции с плотностью 1,3 г/мл, диализуют, обрабатывают полученную фракцию протинозой К, экстрагируют 80%-ным фенолом и хлороформом, обрабатывают ДНК рестриктазой EcoRI., клонируют фрагмент ДНК в плазмиде pRR

322 или в лямбда-фагах. обработку ДНК рестриктазой Есо R1, клонирование фрагмента ДНК в плазмиде pBR322 или в лямбдах-фагах.

Пример 1. Выделение ассоциированнаго с Ни-А Hu-B-гепатитом вещества из кала пациентов. (с

Испол ьзуемый буфер: трис-Н CI, р Н 7,4, 0,05 н. во всех стадиях работ, О а) Обработка: 0,5 r кала суспендируют в

10 ма буфере, центрифугируют при 8000g и 1,и собирают надосадочную жидкость. Остаток промывают еще раз с помощью 10 мл и затем 5 мл буфера. Собранные надосадочные жидкости центрифугируют (30 мин, 10000 об/мин) и фильтруют через непроницаемый для бактерий фильтр (около 0.22 миллипор). Надосадочную жидкость осаждают с помощью ПЭГ 6000 (конечная концентрация 10%, соответственно, 0,4

1711676 моль/л), Спустя 2 — 12 ч осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 10 мл буфера. Этот раствор встряхивают с 10 мл фреона, фазы разделяют пу тем центрифугирования, фреоновую фазу еще раз промывают 5 мл буфера. Повторяют осаждение с помощью ПЭГ и NaCi (конечная концентрация 10%, соответственно 0,4 моль/л). Осадок обрабатывают примерно 800 мкл буфера.

Полученный раствор переваривают с

РНК- и DHK-азой в течение 1 ч при 37 С и наносят на градиенты хлористого цезия. б) В пробирки для центрифугирования вносят 1 мл раствора хлористого цезия с плотностью 1,4 г/мл и сверху в каждую по 3 мл раствора с плотностью 1,3, 1,25 и 1,2 г/мл, Все растворы готовят на укаэанном буфере. На градиенте наслаивают 800 мкл экстракта кала, центрифугируют 65 — 72 ч при 10 С (31000 об/мин). Затем собирают фракции нижней области градиента (плотность 1,4 — 1,4 г/мл) примерно по 200 мкл, в верхней области с плотностью 1,1-1,2 гlмл можно отбирать большие фракции. Плотность каждой фракции определяется путем измерения показателя преломления. Все фракции диализируют и по 50 мкл каждой фракции исследуют по NAN8-анализу на ассоциированное с Ни-А, Ни-В-гепатитом вещество. В положительных фракциях определяют концентрацию белка, Идентификация и характеристика вещества. в) Приготовление градиентных полос.

Продиализированные и возможно сконцентрированные фракции градиента хлористого цезия смешивают с 10 мкл SDS, 10 мкл глицерина и 5 мкл бета-меркаптоэтанола, 5 мкл бромфелового синего на 100 мкл пробы и кипятят 3 мин на водяной. бане, Затем их смешивают с 5 мкл 0,1%-ного раствора пиронина и наносят на градиентный полиакриламидный гель, Продолжительность 3,5 ч, напряжение 160 — 300 В, сила тока 40-25 А, мощность 20 Вт, Примерно за 5 мин до окончания электрофореза еще раз накосят.5 мкл пиронина и заканчивают операцию, как только пиронин пройдет через гель, Гель либо окрашивают с помощью серебра, либо осуществляют блоттинг в течение ночи при 0,5 А, затем 1 ч при 1 А.

r) Блоттинг-анализ.

По окончании блоттинга различные полосы (выделенные пирониновыми маркировками) вырезают и в сопровождении стандарта молекулярного веса окрашивают амидо-черным. Полосы с пробами встряхивают в течение 24 — 72 ч в 1 -ном

55 растворе желатины в PBS,!цй-фракция пациента, соответственно ЕаЬ-2-фрагменты этой IgG- ôðàêöèè маркируют с помощью иода-125 (хлорамин Т): 0,5 мкг на 100 мкг протеина, При этом инкорпорируются примерно 70% активности. Радиоактивный индикатор, объем которого соответствует примерно 2 мкг протеина, разбавляют в 20 мл желатины в PBS и затем полосы инкубируют при встряхивании в течение 12 ч. После этого полосы промывают по 1 ч 3 раза с помощью желатины-PBS, 2 раза с помощью

PBS-Твин 0,5%-ный и 1 раз водой. После высушивания полос их накладывают на чувствительную рентгеновскую пленку и экспонируют при -70 С в течение 2 — 7 ми дней.

Пример 2. Метод обнаружения ассоциированного с HNANB вещества в кале, Полистирольные шарики вместе с сывороткой выздоровевших пациентов, болевших Ни-А, Ни-В-гепатитом, в разбавлении

1:200 в карбонатном буфере, рН 9,2, 0,01 моль/л, инкубируют 12 ч при комнатной температуре, шарики промывают забуфе-. ренным фосфатом физиологическим раствором хлорида натрия (PBS). Пробы кала в форме 10%-ной суспензии кала инкубируют

2 ч при 37 С с покрытыми, как указано, шариками из полистирола, после чего обильно промывают с помощью P BS, который содержит 0,5% Таина-20, и затем инкубируют при

37 С в течение 1 ч с человеческим igG из сыворотки выздоровевших от Ни-А- Ни-8гепатита, которая маркирована иодом-125.

После промывки дистиллированной водой связанную с шариками радиоактивность подсчитывают на гамма-счетчике. Пробы кала, в которых связанная радиоактивность достигает трехкратного значения отрицательного контроля, считают положительными на наличие ассоциированного с Ни-А, Ни-В-гепатитом вещества.

Установлено, что положительную реакцию обнаруживают в пациентов с Нц-А, НиВ-гепатитом, что применение этого анализа у большого числа пациентов с массой совершенно различных заболеваний печени, которые, не имеют ничего общего с Ни-А, Ни-В-гепатитом, вещество, если вообще находят его, находят только в очень низком процентом содержании, Во время исследования коллективов пациентов с гепатитом другого генеза либо гепатитом А, либо гепатитом В, ассоциированное с Ни-А, Hu-B-гепатитом вещество находят в очень низком процентном содержании.

Установлено, что пациенты с Ни-А, ÍuB-гепатитом имеют 30% положительных ре1711676 зультатов, в противоположность чему в случае подозрения на гепатит А, гепатит В и постгепатит В у пациентов это число значительно ниже.

Пример 3, Выделение ДНК.из кала 5 и клонирование ДН К-последовательностей. . Из кала пациентов с Ни-А, Ни-В-гепатитом, как описано в примере 1, выделяют ассоциированные с Ни-А, Ни-В-гепатитом частицы, как там описано, обрабатывают и 10 .очищают через градиенты хлорида цезия и диализуют. Диализованные фракции исследуют.на наличие ассоциированного с NANB вещества описанным образом. Фракцию плотности 1,3 г/мл в градиентах хлорида -.15 цезия переваривают с 50 мкг протеиназы К, 1 SDS и ЭДТА в конечной концентрации

10 мМ в течение 6 ч при 37 С, Протеины удаляют путем экстракции с помощью 80 ного фенола (вес/объем) и хлороформа, и 20 после этого растворенную в водной фазе

ДНК в присутствии 0,3 М ацетата натрия осаждают с помощью двух с половиной кратного объема этанола в течение 60 ч при

-70 С. Затем центрифугируют и осадок про- 25 мывают один раз с помощью 70; .-ного этанола, высушивают и после этого обрабатывают ТЕ-буфером, состоящим из.

10 ммоль/л Трис, рН 3, и 1 мМ ЭДТА, s объемном соотношении 1 мкл/5 мг обрабо- 30 танного кала.

15 мкл этого основного раствора ДНК инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в общем реакционном объеме

50 мкл с 6 единицами полимеразы Кленова 35 (ДНК-полимераза 1, большой фрагмент), 1 мкл раствора dATP, dTTP и dGTP, в концентрации 1 мМ, а также 5 мкл альфа-32Р-бСТР в инкубационном буфере для полимеразы

Кленова по данным изготовителя, 40

После этого добавляют 2,5 мкл 1 мМ.

dCTP-раствора, инкубируют1 ч при комнатной температуре, прогревают при 68 С в течение 10 мин и охлаждают до О С. Затем реакционную смесь вместе с 2 единицами 45

Т4-ДНК-лигазы, 1 мкг фосфорилированного

EcoR-1-линкера и 6 мкл 10 мМ раствора dATP инкубируют в течение 16 ч при 16"С. В:реакционной смеси затем устанавливают конечную концентрацию 150 мМ NaCI и 50 вместе с 240 единицами EcoR-1-рестрикци онной эндонуклеазы (80 ед./мкл) переваривают 3 ч при 37 С. Реакцию прекращают добавлением5мкл 80 j ногофенолаи1мкл

° 20 -ного SDS. Радиоактивно микрирован» 55 ную и снабженную линкерами ДНК отделя.ют от соли и нелегированных линкеров через колонку с сефарозой (объем колонки

3 мл, длина 25 см) и осаждают 2,5-кратным объемом этанола в течение 16 ч при -700С.

dj, "

Осажденную ДНК центрифугируют 10 мин при 14000 g, осадок промывают 150 мкл

70 /-ного этанола, высушивают и обрабатывают 10 мкл ТЕ-буфера.

Пример 4. Клонирование изолированной ДНК в лямбда-фаги и трансфекция на бактерии.

Для лигирования с ДНК-вектором 2 мкг

ДНК лямбда-фагов 1149 вместе с 2-мя единицами EcoR-1 (4 ед./мкл) в общем реакционном объеме 6 мкл/инкубационный буфер по данным изготовителя) инкубируют 1 ч при 37 С. Затем фермент инактивируют путем "I0-минутного нагревания при 68 С.

Этот раствор лигируют с 3 мкл маркированной ДНК, которая выделена как описано в примере 3, 1 мкл 5 мМ ATP и 1 ед. Т4-ДНКлигазы при комнатной температуре. 4 мкл этой реакционной смеси упаковывают в оболочки лямбда-фагов. Этими упакованными фагами инфицируют штамм Escherlchia

coll NM514, Для скрининга на наличие встроенной ДНК примерно 10 фагов наносят на пластины для скрининга размером

22х22 см и инкубируют в течение ночи при

37 С. ДН К-фаги переносят на фильтр из нитроцеллюлозы путем отпечатка, фильтр гибридизируют с 1 мкл описанного радиоактивного основного раствора ДНК, промывают и ауторадиографируют 6 ч при

-70 С, Из 70 положительных сигналов гибридизации выбирают 17 подчиненных колоний фагов при плотности примерно 5тромбоцитов на 1 см . После очистки.тромбоцитов готовят 16 положительных клонов, которые содержат ДНК-вставки длиной от 0,3 т.п.о. до примерно 1,5 т.п,о и гибридизируют с пробой первоначального основного раствора ДНК.

Пример 5. Характеристика ДНКфрагмента длиной 0,45 т.п.о и субклонирование этого фрагмента в плазмиду pVC19 в

Escherichle coll. . ДНК-фрагмент удаляют из ДНК фагов путем переваривания эндонуклеазой EcoR1 при описанных условиях. Фрагмент отделяют на агарозо-геле от ДН К лямбда-фагов, и геля вырезают соответствующие вставке

ДНК-полосы и элюируют. Изолированную

ДНК-вставку вносят путем лигирования в

ДНК-вектор pVC19 и после этого трансфицируют в штамм Н 1 Escherlchia coll. После селекции штаммов бактерий осуществляют выращивание наработку штамма.

Вставку радиоактивно маркируют и испытывают путем анализа по Соузерну на гибридизацию с исходным материалом, экстракциями из калов контрольных лиц; вирусом гепатита и плазмидой PBR 322.

1711676

Пример 6. Обнаружение ассоциированной с Ни-А, Ни-В-ДНК в сыворотке.

2 — 5 мл сыворотки центрифугируют при

150000 g в течение 2 ч, Осадок переваривают при 37 С в течение 1 ч в 200 мкл раствора протеиназы К (0,5 мг/мл, 10 мМ ЭДТА), к раствору добавляют 165 мкл горячего насыщенного раствора иодида натрия (2,5 г иодида натрия/мл Н20, 75 С) до конечной концентрации 12,5 М, нагревают 10 мин при

90 С и фильтруют непосредственно через нитроцеллюлозный фильтр под вакуумом.

После фильтрации нитроцеллюлозную. пленку промывают 3 раза 70%-ным. зтано;. лом и затем 10 мин при комнатной темпера- туре инкубируют в 100 мл уксусного ангидрида (100 мл, 0,1 M тризтаноламина, 250 мкл уксусного ангидрида). После инкубации пленку обжигают в вакууме при 80 С, в течение 1-2 ч. Высушенную пленку вносят в раствор предварительной гибридизации, инкубируют 3 ч при 65ОС (6xSSC), 1 х

Denhardt, 0,5% SDS,-где 20 х SSC (стандартный солевой цитрат) соответствует 3М

NaCl, 1,5 M цитрат натрия.

SDS — додецилсульфат натрия.

100 х Denhardt — раствор соответствует . 2% Flepll, 2% поливинилпирролидона, 2о бычьего сывороточного альбумина), 20 мкг/мл денатурированной нагреванием

ДНК спермы), инкубируют с 32Р-маркированной пробой s течение ночи в условиях прегибридизации. Затем нитроцеллюлозную пленку промывают 3 раза в растворе (1

6х3$с, 1xDenhardt, 0,5 / SDS, 20 мкг/мл

ДНК-спермы, 1xSSC, 0,5% SDS, 1 х

Denhardt, 0,1 х SSCi+ 0,05% SDS). После высушивания пленки ее накладывают на рентгеновскую пленку на время от 6 ч до 2 дней при 70 С.

Пример 7. Обнаружение Ни-А, НиВ-ДНК в сыворотке.

200 мкл сыворотки инкубируют с 75 мкл раствора протеиназы К(4 мгlмл) и 25 мкл 0,5

М ЭДТА при 37 С в течение 1 ч, затем добавляют 100 мкл 1 í. NaOH, выдерживают

10 мин при комнатной температуре и нейтрализуют 250 мкл 2М ацетата аммония. 500 мкл смеси(соответственно181 мкл сыворотки) наносят на нитроцеллюлозу, нейтрализуют 250 мкл 2М ацетата аммония, сушат в вакууме.при 80 С в течение 45 мин. Фильтры перегибридизируют в 6 х SSC, 0,5% SDS, 1 х растворе Denhardt и 20 мкл/мл денатурированной (5 мин, 100 С) ДН К спермы при

65ОС в течение 3 ч.

Для гибридизации, которую осуществ.ляют в течение ночи в условиях прегибридиззции, ис пол ьзуют ма ркирова н ную с помощью 32 P за счет Nick-трансляции

15 мкл 0 5 М ЭДТА инкубируют 30 мин при

20 37 С, Затем раствор разбавляют с помощью

55 вставку фвговык клонов удвльнвя вктнвность примерно 1 — 2 х 10 cpm (мкг ДНК).

Фильтры затем, смотря по обстоятельствам, промывают еще раз 20 мин при 65ОC с помощью 6 х SSC, 1 х раствором Denhardt, 0,5% SDS,- 20 мкг/мл денатурированной

ДНК Hering-спермы, затем 1 х SSC, 0,5%

SDS, 1 х- раствора Denhardt и 0,1 х SSC, 0,05% SDS и высушивают при 80 С. Аутора-. диографию осуществляют с помощью рентгеновской пленки и усилительной пленки при времени ауторадиографии 6 — 48 ч при

-70 С.

Пример 8. Подготовка проб для анализа.

1 мл сыворотки с 350 мкл раствора протеиназы К (3 мгlмл протеиназы К, 10 мМ

Трис, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5% SDS) и 125

8 мл 2 М ТСА (рН 7,0), 3,2 мл 2М ацетата аммония, 20 мкл РНК(10 мг/мл) и 5,3 мл Н20 до 16 мл. ДНК осаждают 10 мл изопропанола при комнатной температуре в течение 30 мин. Осадок ДНК отделяют центрифугированием (15 минут при 8000 об/мин) промывают ere 2 мл 70%-ного этанола, растворяют в 600 мкл 10 мМ Трис, рН 8,4, и 1 мМ ЭДТА, экстрагируют 1 раз фенолом, 1 раз хлороформом и еще раз осаждают, Аликвотные части осажденной ДН К используют для l3otблоттинг-анализа или для рестрикционного анализа, Получение ассоциированной с частицами ДНК из проб кала осуществляют таким же образом. Суспензии кала предварительно стерильно фильтруют и осаждают с помощью ПЭГ, П риме р 9. Если имеется относительно мало ассоциированного с Ни-А, Ни-В вещества, то оказывается целесообразным обнаружить ДНК путем амплификации.

Обнаружение Ни-А, Ни-В-ДНК в сыворотке осуществляют путем гибридизации с радиоактивно маркированной клонированной Ни-А, Ни-В-ДНК-пробы после предва- рительной специфической ферментативной

ДН К-амплификации.

25 мкл сыворотки, 50 мкл Nal (насыщенный раствор) смешивают, инкубируют 2 мин при 37 С, после чего инкубируют 10 мин при

О С. Инкубат диализуют на поликарбонатной мембране против ТЕ-буфера (10 мМ

Трис, 1 мМ ЭДТА) 20 мин. 5 мкл диализата отбирают для специфической ферментатив" ной ДНК-амплификации с помощью по 0,5 мкг олигопраймера (пара А и В,.соответственно, С и D). Олигопраймерные пары готовят по известным данным секвенирования посредством ДНК-синтезатора. После амп1711676 с

Формула изобретения

Способ получения ДНК для диагностики

Ни-А, Ни-В-гепатита, заключающийся в предварительной стерилизации суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером пор 0,22 мкм осахрении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделении осадка, растворении его в буфере, встряхивании с фреоном в соотношении 1:1, отделении фреоновой фазы, осаждении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации l0%, обработке PHK- и ДНК-азой, фракционировании в градиенте хлористого цезия, отделении фракции с плотностью 1,3 г/мл, диалиэе, обработке полученной фракции протеиназой К, экстракции 80%-ным фенолом и хлороформом, обработке ДНК рестри ктазой Есо R 1, клонировании фрагмента ДНК в плазмиде pBR 322 или в лямбда-фагах.

Составитель Т.Забойкина

Редактор С.Патрушева Техред М.Моргентал Корректор В.Гирняк.

Заказ 351 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 лификации реакционную смесь разделяют электрофоретически на 2%-ном агароэном геле, наносят на нейлоновую мембрану.и . гибридиэуют с маркированной с помощью з р клонированной Ни-А, Ни-В-ДНК-про- 5 бы." После ауторадиографии идентифицируют положительные результаты,.руководствуясь стандартом и маркерами. Сопровождающие контроли служат для оценкй эффективности, амплификации, как с по- 10 мощью HBV-специфических праймеров, так и также с помощью специфических к Ни-А, Ни-В-праймеров. Доказательство идентичности находящейся в инфекционной загрузке ДНК с ДНК иэ кала пациентов с Ни-А, 15

Ни-В-гепатитом говорит об идентификации включенной в Ни-А, Ни-В-гепатит ДНК.

Исследование дальнейших 57 проб капа пациентов со спорадическим и пост-гемотрансфузионным Ни-А, Ни-В с помощью ра- 20 диоиммуноанализа, как описано в предыдущих примерах, и в 0ot-блоттингс- пособе, дает замечательную корреляцию обоих способов исследования,в отношении обнаруживаемого, ассоциированного с Ни- 25

А, Ни-В-вещества (R 1A) и обнаруживаемой

ДНК (Dot-блоттинг, см, пример 7).

ДНК показывает родство с HBV-ДНК.

Если клонированный 0,45 кВ фрагмент или очищенный материал кала маркирован Ð 30 и гибридизован,в анализе по Соузерну до .,HBV-ДНК, обе пробы дают сигнал, правда, примерно в 1000 раз слабее, чем сам по себе. Плазмида pBR 322 и лямбда-фагй не дают никакого сигнала. В предварительных 35 опытах очищенную пробу кала, без осуществления денатурации, можно очень хорошо маркировать маленьким фрагментом Е coll, полимераэы.

Обработанная полимераэой Кленова 40 проба кала мигрирует в геле агарозы отчетливо медленно, чем необработанная проба..

Это говорит о том, что исследованная ДНК, также как HBV-ДНК, частично двунитевая.

Результаты и обработка рестрикционными 45 ферментами и экстрензйя праймера дока- . зывают циркулярную структуру ДНК.

Полученные ДНК,. в особенности находящиеся в этих ДНК гены, можно использовать для включения в соответствующие векторы экспрессии, как клетки и бактерии (например Е.coll и дрожжи, как

Saccharornyces cerevlsiae, а также культуры клеток) и для получения вирусных антигенов. Таким образом возможна диагностика и получение иммунореагентов и вакцин, В случае диагностики нужно назвать в особенности исследование на инфекционность (исследование консервированной крови) и диагноз острой, хронической или по времени прошедшей инфекции. Приготовленные в культурах клеток антигены, а также соответствующие, синтезированные благодаря этим вирус-ДНК ин виво и ин витра протеины можно использовать для установления иммунологической диагностики. ДН К-последовательность может применяться для идентификации потенциальных вирусных протеинов (белков) и их синтетического получения, следовательно, получения синтетических антигенных пептидов.