Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению нового продуцента фермента а -галактозидазы. Цель изобретения - выявление штамма продуцента а -галактозидазы, обладающего более высокой активностью. Изобретение позволяет получить а-галактозидазу в количестве 4-7 ед./мл культуральной жидкости. Из глубинной культуры предлагаемого продуцента выделенный ферментный препарат может быть применен в сахарной промышленности и медицине. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 9/40, 1/14

ГОСУДАРСТВЕ ННЬ! Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4744590/13 (22) 02.10.89 (46) 07.03.92. Бюл. N. 9 (71) Институт биохимии растений АН ГССР (72) Т.Ш. Радиани, Т.И. Билай, А.Т. Школьный, А,К, Церетели, ll.Т. Кушашвили, M.М.

Гомартели и Г,И. Квеситадзе (53) 577.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 958503, кл. С 12 N I5/00, 1980.

Авторское свидетельство СССР

М. 798173, кл. С 12 N.9/40. 1979.

Авторское свидетельство СССР

N1509402,,кл. С 12 N 9/38, 1987.

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению нового штамма, продуцента фермента а -галактозидазы. а -Галактозидаза используется широко в пищевой и микробиологической отраслях промышленности, аналитической биохимии, при выяснении строения различных углеводосодержащих биополимеров и низкомолекулярных соединений, содержащих кон цевые Q -0-галактоэидн ы е группировки, а также в медицине при лечении. наследственных энэимопатий — болезни

Фабри, связанной с недостатком в организме человека лизосомальной а -галактоэидазы и гематологии при изучении группоспецифических веществ крови.

„, Ы„„1717632 А1

{54) ШТАММ ГРИБА PENICILLILIM

CANESCENS-ПРОДУЦЕНТ а -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового продуцента фермента а -галактозидаэы. Цель изобретения — выявление штамма продуцента а -галактозидазы, обладающего более высокой активностью. Изобретение позволяет получить а-галактозидазу в количестве 4 — 7 ед,/мл культуральной жидкости.

Из глубинной культуры предлагаемого продуцента выделенный ферментный препарат может быть применен в сахарной промышленности и медицине. 2 табл.

Предлагаемый штамм Peniciliium

canescens ВКПМ F-417-продуцент а -галактозидазы получают путем облучения ультрафиолетовыми лучами в дозе 400 Дж/м г конидии исходного штамма Peniciliium

canescens Sopp. 20171 и обладает указанными свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм атоксичен, быстрорастущий, характеризуется умеренным спороношением.

Образование конидии начинается на два дня позже, чем в исходной культуре.

Конидиеносцы длиной 400-500 мкм и с диаметром 2,8-3 мкм отходят от войлочного мицелия, оболочка четко-шероховатая. Кисточки двухьярусные, растопыренные, состоят из веточек (метуль), несущих мутовки — фиа1717632

10 лид, метули около (10 — 15)x(3 3.5) мкм, стеригмы (7-8)х2,8 мкм.

Культуральные признаки.

Штамм хорошо растет на искусственных средах (сусло-агаре, картофельно-глюкозном агаре, картофельном arape) и синтетических эгаризованных средах (средах Чапека, Сабуро, Ролена-Тома, агаризованной среде с лактозой), На агаризованной среде Чапека, суслоагаре, агаризованной среде с лактозой кол он и и пуш исты е. состоя щие из плотного базального войлочного и рыхлого сплетения воздушного мицелия со слабо выраженной радиальнобороздчатостью, умеренным спороношением; с растущим краем до 2 — 3 мм ширины; колонии бледно-голубовато-серого цвета, затем сероватого цвета и потом при старении колонии приобретают дымчато-сероватый оттенок, Линейный рост колонии на агаризованных средах по дням: на сусло-агаровой среде — 5-й день — 45 — 50 мм, 10-й день—

60 — 70 мм; на среде Чапека — 5-й день — 25 мм, 10-й день — 35 — 40 мм; на агаризованной сре,е с лактозой — 5-й день — 30 мм, 10-й день — 50 — 60 мм.

На отрубях штамм растет хорошо.

Отношение к углеродному питанию; мутант хорошо усваивает моносахариды— глюкозу, галактозу, арабинозу; сахароспир-. ты — сорбит, маннит; иэ дисахаридов — лактоэу, сахароэу, мальтозу, а также крахмал и инулин, Отношение к азотному питанию: усваивает нитратный азот, лучше аммонийный.

Из органических источников азота ассимилирует пептон, мочевину, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат.

Отношение к кислороду: облигатный аэроб.

Отношение к температуре: мезофил, оптимальная температура для роста и биосинтетической активности 27 — 28 С, Отношение к кислотности питательной среды: растет в широких пределах рН 2,09,5.

Для размножения штамма применяют модифицированную среду Чапека с раффинозой следующего состава, fo: раффиноза

3,0; ИН4ЙОз 0,2; КНгРО4 0,1; MgSO4 0,05;

KCi 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар 2; исходное рН 5,8 — 6,0.

Питательной средой для ферментации служит среда следующего состава, %: соевая мука 3,0; йагНРО4 12НгО 1,5; (ЙНг$04

0,2; KCI 0,05; MgSO4 0,015: исходное рН

4.1-4,2, Проверкой, проведенной в течение четырех лет, установлено, что при хранении и

55 пересевах уровень ферментативной активности Peniciilium canescens AMT-85 не снижается, Испол ьзова ние и редлэгэемого штамма дает возможность при организации производства а -галактозидазы в СССР получить культуру гриба с повышенной в 5-6 раз активностью, Термостабилы4ость штамма 5055 С. кислотоустойчивость — рН 2,0 — 8,0.

Кроме высокоактивной а-галактозидаэы предлагаемый продуцент о зразует богатую белком биомассу (до 35 от веса сухой биомассы).

Пример 1. Штамм Peniciilium

canescens АМТ-85 поддерживали на агариэованной среде с раффинозой, : раффиноэа 3,0; ИНайОз 0,2; КНгР04 0,1; KCi 0,1;

MgS04 0,05; кукурузный экстракт 0,05; агар

2; исходное рН среды 6,0.

Глубинное культивирование гриба проводили на жидкой питательной среде следующего состава, : соевая мука 3 0;

МагНРО4 12НгО 1,5; (NH4)2$04 0,2; КС1 0,05;

Мц$0д 0,015: исходное рН 4,2.

Культивирование проводили в колбах емкостью 750 мл на термостатированной качалке, делающей 220 об/мин (уровень аэрации 1,4 т Ог/л ч) при 30 С в течение

72 ч.

Объем питательной среды в колбах составлял 100 мл. Засев питательной среды производили 2 -ной суспензией конидий поверхностной культуры гриба, выращенной в пробирках на скошенном лактозном агаре в течение 12 дней при

280С

Биомассу отделяли фильтрованием и в фильтрате определяли активность а-гэлактоэидазы, используя в качестве субстрата паранитрофенил- а -0-галактопиранозид. Реакционную смесь, состоящую из 0,1 мл

5 мМ субстрата, 0,2 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 4,2) и 0,1 мл раствора фермента (культуральной жидкости), инкубировали при 37 С в течение 10 мин, а затем добавляли 2 мл 1 М йагСОз для прекращения реакции. Освободившийся и-нитрофенол определяли при 410 нм.

Стабильность уровня активности фермента, продуцируемого Peniclltium сапезсепз AMT-85, дэна в табл. 1.

Зависимость активности Q-галактоэидазы от применяемой среды дана в табл.

Активность биосинтезирующего штамма а-галактоэидаэы равна 5 — 6,5 ед./мл.

Активность а -галактозидазы определяли и по гидролизу мелибиозы.

1717632

Таблица 1

Таблица 2

Составитель Т.Радиани

Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Редактор И.Дербак

Заказ 853 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Активность а -галактоэидазы в экстракте. определяемом по.гидролизу мелибиозы, составляет 90-100 ед. на 1 r сухой культуры.

Предлагаемый штамм дает возможность получить ксиланаэу с активностью 33.5 ед./мл.

Предлагаемый фермент может быть .применен в пищевой промышленности и медицине.

Штамм Peniciliium сапезсепз АМТ-85— продуцент а-галактоэидазы депонирован в

Центральном музее промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика"

5 под коллекционным номером ВКПМ-F-417.

Формула изобретения

Штамм гриба Penlcilllum canescens

10 ВКПМ F-477-продуцент а-галактозидаэы.