Способ получения гликопептидных антибиотиков а82846а, а82846в и а82846с или их солей, штамм актиномицета nocardia оriеnтаlis nrrl 18098-продуцент гликопептидных антибиотиков а82846а, а82846в и а82846с, штамм актиномицета nocardia оriеnтаlis nrrl 18099-продуцент гликопептидных антибиотиков а82846а, а82846в и а82846с и штамм актиномицета nocardia оriеnтоlis nrrl 18100-продуцент гликопептидных антибиотиков а82846а, а82846в и а82846с.
Изобретение относится к способам получения новых гликопептидных антибиотиков группы ванкомицина, в частности антибиотика А82846 и его компонентов А82846А, А82846В и А82846С культивированием новых штаммов микроорганизмов, Штамм Nocardia orientalis NRRL 18098 или NRRL 18099, или NRRL 18100 культивируют в глубинных условиях при аэрации и перемешивании в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли. Антибиотический комплекс выделяют из культуральной жидкости, очищают и хроматографически разделяют на составляющие компоненты, обладающие антибиотической активностью. Компоненты могут быть преобразованы в соль, для чего очищенный раствор комплекса подкисляют до рН на уровне 3. На основе компонентов или их солей могут быть приготовлены различные лекарственные формы. 4 с.п,ф-лы, 2 з.п.ф-лы, 3 ил., 3 табл. 18100 в питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота и неорганические соли. Гликопептидные антибиотики произвольно названы как А82846 и его компоненты . По своему строению антибиотик А82846 аналогичен ванкомицину, но обладает большей in vlrto и in vivo активностью по отношению к грамположительным бактериям, а также лучшей фармокинетикой, что проявляется в гораздо большем периоде полураспада , чем у ванкомицина. VI ю 4 О сл 00
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5l)5 я,) 3
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ 4
Ю
О (21) 4203370/13 (22) 18.09.87 (31) 909791 (32) 19,09.86 (33) US (46) 30.03.92. Бюл, М 12 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Роберт Л.Хэмилл, Джеймс Альберт
Мейб, Дзвид Фрэнсис Мэхони, Вальтер Мицуо Накацукаса и Рэймонд Че-Фонг Яо (US) (53) 615.779.93 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ А82846А, А82846В И
А82846С ИЛИ ИХ СОЛЕЙ, ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА NOCARDIA ORIENTALIS ИВЯ(180 98-П РОДУ ЦЕ НТ ГЛ И КОП ЕПТИДН ЫХ
АНТИБИОТИКОВ А82846А, А82846В И
А82846С, ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА
NOCARDIA 0RlENTAUS КВВ 18099-ПРОДУЦЕНТ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ А82846А, АР2846В И А82846С И
ШТАММ АКТИНО11ИЦЕТА NOCARDIA
ОВ! ЕКТАЫ$ ККЯ1 18100-ПРОДУЦЕНТ
ГЛ И КОП ЕПТИДН Ы Х АНТИБИОТИКА
А82846А, А82846В И А82846С.
Изобретение относится к способу получения новых гликопептидных антибиотиков группы ванкомицина, в частности к антибиотику А82846, к его отдельных компонентам А82846А, А82846В и А82846С и их получению культивированием новых штаммов микроорганизмо .
В соответствии с изобре гением обнаружено, что гликопептидные антибиотики с ценными свойствами могут быть получены аэробным глубинным брожением Nocardia
orIentaIIs NRRL18098, NRRL18099 или ЙВЮ
< > .".Ы.и 1 724015 А3 (57) Изобретение относится к способам получения новых гликопептидных антибиотиков группы ванкомицина, в частности антибиотика А82846 и его компонентов
А82846А, А82846В и А82846С культивированием новых штаммов микроорганизмов, Штамм Nocardla orieotalis ййй1 18098 или
NRRL 18099, или NRRL 18100 культивируют в глубинных условиях при аэрации и перемешивании в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли. Антибиотический комплекс выделяют из культуральной жидкости, очищают и хроматографически разделяют на составляющие компоненты, обладающие антибиотической активностью. Компоненты могут быть преобразованы в соль, для чего З очищенный раствор комплекса подкисляют до рН на уровне 3, На основе компонентов или их солей могут быть приготовлены различные лекарственные формы. 4 с.п,ф-лы, 2 з.п,ф-лы, 3 ил., 3 табл.
18100 в питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота и неорганические соли. Гликопептидные антибиотики произвольно названы как А82846 и его компоненты.
По своему строению антибиотик А82846 аналогичен ванкомицину, но обладает большей in virto и!и vivo активностью по отношению к грамположительным бактериям, а также лучшей фармокинетикой, что проявляется в гораздо большем периоде полураспада, чем у ванкомицина.
1724015
Компоненты А82846 обладают следующими физическими и спектральными свойствами.
Характеристика А82846А, Мол.вес 1556.
Эмпирическая формула С73Нв9Й10026С!.
FAB-M (тиоглицерин):(М+1).
Найдено: 1557, 5803.
С73 н90Й10026С !.
Вычислено: 1557, 5716.
УФ (Н20) Я акс, 281 нм (е 5,052) сдвиги к
300 нм с основанием.
ИК (KBr): 1716; 1655; 1611; 1586; 1552;
1504; 1410; 1340; 1310; 1230; 1212; 1132;
1066; 1028 и 1015 см
ЯМ Р (С03)2$0: (фиг.1). рКа (НгО): 4,7; 95. (66% ДМФА): 5,5; 6,8; 7; 9; 9,4; 12,3 (видимый мол. вес 1542).
Характеристика А82846В. Мол.вес 1590.
Эмпирическая формула C73HssN10026C2.
FAB-MS (тиоглицерин): (М+1).
Найдено: 1591; 5315.
C73HS9N10026CI2, Вычислено: 1591; 5327.
УФ (H20) Амакс . 280 нм (s 5, 192), сдвиги к 300 нм с основанием.
ИК (KBr): 1656; 1586; 1562; 1504; 1403;
1264; 1230; 1135; 1105; 1065; 1023 и
1018 см
ЯМР (С03)250: (фиг.2). рКа (Н20): 4,65; 9,5.
Характеристика А82846С, Молекулярн ый вес 1522. Эм пи ри ческая формулы
С7зН90%0026. F А В- М S (т и о гл и ц е р и н): (M+Na).
Найдено: 1545; 5998, С73Н9ой 1002Фа.
Вычислено: 1545; 5925.
УФ (Н20) Qакс . 280 нм (е 5,198), сдвиги к 300 нм с основанием.
ИК (KBr): 3600 — 3004 (широкая); 2999;
2950; 1687-1650 (широкая); 1585; 1570; 1509;
1503; 1453; 1449; 1402; 1212; 1130; 1102;
1060; 1032 и 1014 см
ЯМ К (С03)2ЯО: (фиг,3). рКа (Н20): 4,6; 9,4.
Аминокислотный анализ А82846А, А82846В и А82846С после гидролиза 6 н НС! показал присутствие аспарагиновой кислоты и два широких пика со следами глицина.
Эти два пика, видимо, соответствуют актионидиновой и ванкомициновой аминокислотам, присутствующим в гликопептидах класса ванкомицина.
Сравнительное излучение ЯМР показывает,что А82846А, А82846В и А82846С каждый содержит остаток аминосахара-4эпиванкозамина (З-метилакозамина), Н0 NHq
Молекулярная формула А82846А соответствует молекулярной формуле ванкоми10 цина (С66Н75й9024С!) минус один атом хлора, плюс элементы дополнительного остатка аминосахара типа ванкозамина (С7Н 14ЙОг).
Молекулярная формула А82846В соот15 ветствует молекулярной формуле А82846А, в которой атом водорода эамещен атомом хлора, Молекулярная формула А82846С соответствует молекулярной формуле А82846А, 20 в которой атом хлора замещен атомом водорода.
Компоненты А82846, видимо, отвечают следующим структурным формулам: нн, 25 но нн1
\ -o
Абсолютная конфигурация групп саха35 ров в производных А82846 пока не определена.
А82846 и его отдельные компоненты
А82846А, А82846В и А82846С могут вступать в реакцию с образованием различных
40 солей. Соли А82846 применимы, например, для разделения и очистки А82846. Кроме того, соли обладают лучшей растворимостью в воде, Соли А82846 получают стандартными
45 методами получения солей. Например, А82846 может быть нейтрализован соответствующей кислотой с образованием соли с кисл отой.
Такие соли с кислотами в особенности
50 приемлемы. Характерные приемлемые соли включают соли, образованные в стандартных реакциях как с органическими, так и неорганическими кислотами, такими как, например, серная, хлористоводородная, 55 фосфорная, уксусная, янтарная, лимонная, молочная, малеиновая, фумаровая, холевой, памоевая, муциновая, D-глутаровая, D-камфорная, глутаровая, гликолевая, фталевая, винная, муравьиная, лауриновая, стеариновая, салициловая, метансульфо-, бензолсуль1724015
30
40
50
55 фо-, сорбиновая, пикриновая, бензойная, коричная и т.п. кислоты.
Фармацевтически приемлемые соли с кислотами образуют особенно предпочтительную группу солей по изобретению.
Антибиотик А82846 может быть получен культивированием в условиях аэробного глубинного брожения в соответствующей культурной среде штамма Nocardia
orientalis, продуцирующего А82846, до момента достижения достаточной антибиотической активности. Антибиотик может быть выделен различными хорошо известными способами выделения и очистки.
Изобретение также относится к биологически чистым культурам микроорганизмов: Nocardia orientalis Май(18098, Nocardia orientaiis ййй1 18099, Nocardia
orientalis ИКИ 18100.
Штамм NRRL 18098 обозначен как культура А82846, штамм NRRL 18099 — как культура А82846,1 и штамм NRRL 18100 — как кул ьтура А82846.2. Культура А82846 выделена из образца почвы с острова Гаити. Культура А82846 1 получена путем химического мутагенеза культуры А82846, а культура
А82846.2 представляет собой природный вариант, выделенный из культуры А82846.
Культуры А82846, А82846.1 и А82846.2 депонированы в коллекции культур штаммов Регионального исследовательского центра Нофтери Мивест Эриа сельскохозяйственной исследовательной службы, Министерства сельского хозяйства США.
При депозитировании культуры получили регистрационные номера NRRL 18098 (А82846, основной штамм), NRRL 18099 (А82846,1 мутантный штамм) и NRRL 18100 (А82846,2, вариантный штамм);
Морфология изучена с использованием оптического микроскопа. Для изучения орнаментации поверхности пор использован электронный сканирующий микроскоп (Э CM).
Для присваивания наименований цвета использованы Центроидные цветовые таблицы ISCC — NBS, стандартный образец N.
106 (Национальное бюро стандартов (NBS), 1958, Торговая Палата США, а также ежегодник гармонии цвета.
Характеристика культур. Культуры
А82846 и А82846,2 хорошо растут на всех использованных сложных средах. Культуры на большинстве сред образуют воздушный мицелий. Окраска массы воздушных спор белая или серая в зависимости от характера среды. На большинстве сред происходит образование четко определяемого растворимого пигмента, окраска обратной стороны от коричневой до желтовато-белой.
Культура А82846,1 также растет на всех использованных средах, однако рост этой культуры не такой изобильный, как у основной культуры. Культура А82846.1 образует воздушный белый мицелий только в редких случаях. На нескольких средах происходит образование случайного плохо различимого светло-коричневого растворимого пигмента; обратная сторона имеет окраску от коричневой до желтоватой.
Характеристика культур А82846, А82846.1 и А82846.2 суммирована в табл.1.
Культуры А82846 и А82846.1 очень похожи, отличаются лишь немногими свойствами. Вследствие их схожести и поскольку
А82846.2 является природным вариантом
А82846 дальнейшее сравнение не проводилось, Морфологические признаки. Культуры
А82846, А82846.1 и А82846.2 образуют пространный субстрат мицелия. Воздушные гифы образуют длинные цепи конидий, похожих на паутину.
Для всех культур орнаментация поверхности спор гладкая, форма спор цилиндрическая, Размер спор в интервале 1,2 — 1,3 х
0,4 — 0,5 мкм для А82846 и 1,4 — 2,2 х 0,3 — 0,4 мкм — для А82846.1.
При выращивании в условиях глубинного встряхивания культура А82846 проявляет минимальную фрагментацию, фрагментация А82846,1 интенсивная, а культура
А82846.2 проявляет умеренную фрагментацию, Биохимические свойства. Обе культуры
А82846 и А82846,1 образуют кислоты из арабизоны, целлобиозы, декстрана, фруктозы, галактозы, мальтозы, маннита, маннозы, мелибиозы, рамнозы, глюкозы, а-метил-Dглюкозида, глицерина, инозита, рибозы, сахарозы, трегалозы и ксилоэы, но не образуют кислоты из адонита, целлюлозы, дульцита, эритрита, инулина; сорбита и ксилита.
А82846 также образует кислоту из этанола, гликогена, мелезитозы, раффинозы и салицина, в то время как А82846.1 из этих соединений кислоты не образует. Обе культуры усваивают ацетат, цитрат, лактат, малат, оксалат, пропионат, пуриват, сукцинат, но не усваивают бензоат, мукат и тартрат. Культура А82846.1 усваивает бутират, а культура
А82846 бутират не усваивает.
Культуры А82846 и А82846.1 разлагают казеин, гипоксантин, тирозин, мочевину и
ДНК, но не разлагают аденин, малат кальция или ксантин, Обе культуры гидролизуют крахмал, не гидролизуют эскулин или гиппурат, восстанавливают нитрат, ожижают желатин, выживают при 50 С в течение 8 ч и образуют каталазу, HzS и фосфатазу.
1724015
Культуры А82846 и А82846.1 проявляют одинаковую устойчивость к антибиотикам.
Так они устойчивы к бацитрацину (10 ед.), цефалотину (30 мкг), кентамицину (10 мкг), линкомицину (2 мкг), олеандомицину (15 мкг), пенициллину G (10 ед.), стрептомицину (10 мкг), ванкомицину (30 мкг), тобрамицину (10 мкг), эритромицину (15 мкг), налидиксиновой кислоте (30 мкг), полимиксину (300 ед.), триметоприну (5 мкг), сульфадиазину (30 мкг), но чувствительны к неомицину (30 мкг), рифа мици ну (5 мкг), тетра ци клину (30 мкг), хлорамфениколу (30 мкг), новобиоцину (30 мкг) и мандельямину (3 мкг).
Обе культуры А82846 и А82846.1 окрашивают грамположительные бактерии, но не окрашивают кислотоупорные бактерии.
Культура А82846 образует меланоидные пигменты, в то время как А82846,1 таких пигментов не образует.
Анализ клеточной стенки. Полностью гидролизованные клетки А82846 содержат мезоизомер диаминопимелиновой кислоты, а также сахар арабизону и галактозу, Культуры имеют клеточные стенки, относящиеся к типу lV согласно Бекеру и др. Характер образования сахаров относится к типу А.
Культуры не образуют миколевых кислот (LCN-А).
Культура А82846.1 получена под действием химических агентов, является мутантом культуры А82846, Признаки, по которым
А82846.1 отличается от А82846, приведены в табл. 2.
Культура А82846.1 отличается от А82846 и по антибиотической активности.
Культура А82846.2 представляет собой природный вариант культуры А82846.
Вследствие этого характерные признаки
А82846.2 фактически те же, что и у А82846.
Основное различие между А82846 и
А82846.2 заключается в том, что культура
А82846.2 образует в гораздо большем количестве антибиотик А82846 при выращивании во встряхиваемых сосудах по сравнению с культурой А82846.
Питательной средой, используемой для выращивания культур Nocardla orientalis может быть любая из существующих сред. С целью экономии получения оптимизация выхода и облегчения выделения продукта, предпочтительным определенные среды, Так, например, предпочтительным источником углеродов при широкомасштабном брожении является глюкоза и картофельный декстрин, хотя могут быть использованы также рибоза, ксилоза, фруктоза, галактоза, манноза, маннит, растворимый крахмал и т.п.
Рекомендуемыми источниками азота являются ферментативно гидролизованный казеин и пептоны мяса, хотя также могут быть использованы дрожжевой экстракт, подвергнутый кислотному гидролизу казеин, говяжий экстракт, рыбная мука, печеночная мука и т.п.
Питательные неорганические соли, которые могут быть введены в культурную среду, включают обычные растворимые соли, способные образовывать ионы цинка, натрия, магния, кальция, аммония, хлорид-, карбонат-, сульфат, нитрат- и тому подобные ионы.
Важные следовые элементы, необходимые для роста и развития микроорганизма, также должны быть введены в питательную среду. Такие следовые элементы обычно присутствуют в виде примесей к другим компонентам среды в количестве, достаточном для удовлетворения потребностей растущего микроорганизма. В случае возникновения проблемы пенообразования к ферментационной среде в небольших количествах (например, 0,2 мл/л) может быть добавлено противопенное средство, такое как полипропиленгликоль, Для получения значительных количеств антибиотиков А82846 рекомендуется проведение аэробного глубинного брожения в танках. Небольшие количества антибиотика можно получить встряхиванием культуры в сосуде, Вследствие задержки во времени при производстве антибиотика, обычно связанной с заражением больших танков споровой формой организма, рекомендуют использовать вегетативный посевной материал. Вегетативный повесной материал готовят путем высева в небольшой объем посевной среды споровой формы мицелиальных фрагментов с получением свежей, активно растущей культуры организма. Вегетативный посевной материал затем переносят в танк большего размера. Среда для приготовления вегетативного посевного материала может быть той же, что и используемая для ферментации, однако могут быть использованы и другие среды.
Антибиотики А82846 получают из продуцирующих А82846 организмов путем их выращивания при 23 — 37 С. Оптимальная температура образования А82846 30-31 С.
Как обычно в процессах аэробного глубинного брожения в нижнюю часть сосуда вдувают стерильный воздух с одновременным перемешиванием среды с помощью обычной турбинной мешалки. Максимальное поглощение кислорода при брожении в использованных условиях не превышает примерно 0,2 мм/л/мин. Как правило скоро1724015
5
40
50
55 сть аэрации и скорость перемешивания должны быть достаточными для установления уровня растворенного кислорода в 50 от насыщения или выше.
Образование антибиотиков А82846 контролируется в ходе брожения испытанием образцов бульона на антибиотическую активность против микроорганизмов, о бл ада ющих за ранее известной чувствительностью к антибиотику. Одним из таких пригодных для проведения испытаний микроорганизмов является Bacillus subtllls
АТСС 6638. Биоиспытание обычно проводят использованием пластин для испытаний с а гэром.
После накопления в условиях аэробного глубинного брожения антибиотики А82846 могут быть затем выделены из среды брожения известными способами.
Антибиотическая активность обнаруживается как в мицелии, так и в бульоне. Максимальный выход А82846 достигается в результате первоначальным доведением значения рН до 10,5 с целью выделения
А82846 из мицелия и фильтрования среды с удалением бульона из массы мицелия.
Из отфильтрованного бульона А82846 может быть извлечен самыми разнообразными способами. Рекомендуемая методика включает доведение рН в отфильтрованном бульоне до 7 и абсорбцию его катионообменной смолой, например, Дауэкс
XF5-43278. Дауэкс-50 или Амберлитов
IR-120. Активный, материал вымывают из смолы с помощью соответствующего растворителя, например, разбавленным раствором NH40H. Активные фракции затем концентрируют в вакууме, адсорбируют на макропористой смоле, например Диаионе
HP-20 и Амберлите XAO-4, и вымывают соответствующим растворителем, таким как смесь воды с изопропанолом (95:5), содержащей 1о уксусной кислоты, с получением
А82846, Активный материал может быть также вымыт смесью воды с ацетонитрилом или смесью воды с метанолом с небольшим количеством кислоты.
А82846 может быть разделен на отдельные компоненты А82846А, А82846В и
А82846С аналогичными методами. Рекомендуемая методика разделения включает хроматографию с обращением фаз (C>8 или
C8) на силикагеле.
В качестве источника А82846 могут быть использованы также твердые вещества культуры, в том числе компоненты среды и мицелия без их экстракции или отделения, но предпочтительно после удаления воды.Например, после образования А82846 весь ферментационный бульон может быть высушен лиофилизацией, сушкой в барабане или азеотропной перегонкой и высушиванием. Высушенный бульон затем подмешивают непосредственно в пищевую добавку.
Антибиотики А82846 проявляют прекрасную in vlfro u in vivo активность против грамположительных патогенных бактерий.
Особенно неожиданной особенностью этих антибиотиков является их длительный период полураспада в сыворотке. Например, при внутривенном введении крысам ванкомицин показывает период полураспада в сыворотке в 45 мин, в то время как А82846А и
А82846В имеют период полураспада в 2,2 ч.
Один из важных аспектов антимикробной активности соединений А82846 заключается в их активности против анаэробных бактерий.
Антибиотики А82846 также обладают антимикробной активностью in vivo против эксперименгально вызванных инфекций у лабораторных животных. При введении двух доз испытуемого соединения мыши, искусственно зараженной испытуемым микроорганизмом, наблюдаемую при этом активность измеряют в виде значений ЭД8О (эффективная доза в мг/кг, необходимая для защиты 50 испытуемых животных), Значения ЭДАС для испытуемых соединений приведены в табл. 3, Одним из важных аспектов антибактериальной активности антибиотиков А82846 заключается в их применимости для лечения пиелонефритов. Например, А82846А и
А82846В более эффективны по сравнению с ванкомицином при создании защиты в экспериментальной ликвидации инфекции пиелонефрита у крыс.
Антибиотики А82846 также применимы для лечения эндокардита. Например, А82846А и А82846В также эффективны, как и ванкомицин при лечении искусственно вызванной с помощью катетера инфекционного эндокардита у крыс. B этом испытании крысам вводят пластиковый катетер в правую сонную артерию, затем продвигают в правый желудочек сердца, где надежно закрепляют. Зверьков оставляют в покое на два дня, после чего внутривенно вводят испытуемый микроорганизм (Streptococcus
faccaiis X-бб). Титр микроорганизма примерно 5 х 10 /мл, введено 0,5 мл.
Соединение вводят подкожно за 15 мин до заражения и затем с интервалом в 12 ч в течение 14 дн, всего проводят 28 инъекций.
После лечения зверьков выдерживают 2 дня, затем извлекают сердце, размельчают и наносят на триптиказовый соевый агар.
1724015
Пластинки с агаром инкубируют перед подсчетом в течение 48 ч, Фармацевтические составы, содержащие антибиотики А82846, предпочтительно в виде фармацевтически приемлемой соли готовят для перорального или парентерального введения с целью лечения или профилактики бактериальных инфекций.
Например, соединение может быть смешано с обычными фармацевтическими носителями и наполнителями и использовано в виде таблеток, капсул, элексиров, суспензий, сиропов, вафель и т.п.
Содержание антибиотика А82846 в композиции: 0,1 — 90 мас. активного соединения, но, как правило, 10 — 30 мас. . Композиции могут включать обычные носители и наполнители, такие как кукурузный крахмал или желатин, лактоза, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, каолин, маннит, дикальций фосфат; хлористый натрий и альгиновая кислота, Размельчители, обычно используемые в составах предлагаемого изобретения, включают кромкармеллозу натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, натрийгликолят крахмала и альгиновую кислоту.
Связывающие вещества для получения таблеток включают аравийскую камедь, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, поливинилпирролидон (Новидон), гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу, крахмал и этил целлюлозу.
Смазки, которые можно использовать, включают стеарат магния или стеараты других металлов, стеариновую кислоту, тальк, воски, масла и коллоидную окись кремния, Могут быть также использованы отдушки, такие как перечная мята, винтергреновое масло, вишневая эссенция и т,п.
Желательно добавление красителя для придания дозировочной форме более эстетического вида или для облегчения идентификации продукта, Для внутривенных инъекций водорастворимая форма антибиотика может быть растворена в одной из обычно используемых для внутривенных инъекций жидкостей и введена в виде вливания. Например, могут быть использованы такие жидкости как: физиологический раствор, раствор Ринджера или 5 -ный раствор декстрозы.
Для внутримышечных препаратов стерильный состав соответствующей растворимой соли соединения, например, хлоргидрат может быть растворен и введен в фармацевтический растворитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор или 5% раствор глюкозы. Соответствующая нерастворимая форма соединения может быть приготовлена и введена в виде суспензии в водную основу или фармацевтически приемлемую масляную основу, например эфир длинноцепочечной жирной
5 кислоты, такой как этилолеат.
Для перорального введения особенно приемлемым является стерильный состав соответствующей соли антибиотика, например хлоргидрата в смеси в разбавителем, 10 таким как дистиллированная или деионизированная вода.
Единичная дозировка антибиотика может также представлять собой раствор антибиотика, предпочтительно в виде соли в
15 соответствующем разбавителе, заключенный в стерильную герметично запаянную ампулу. Концентрация антибиотика в единичной дозировке может меняться, например от 1 до 50% в зависимости от
20 конкретной формы антибиотика и его растворимости, а также от назначаемой врачом дозы.
Способ иллюстрируется следующими и римерами.
25 Пример 1, ВЭЖХ для А82846.
Нижеследующая аналитическая система ВЭЖХ применима для компонентов
А82846:
1. Колонка с катионообменной смолой
30 Носитель — Зорбакс SCX (колонка 4,6 х
150 мм).
Система — градиент вымывания А; В (4;1) к А:В (1:9) в 5 мин, удерживание 16 мин.
А-МеОН: 0,1 М МаНгР04 (1;9)
35 В-МеОН:0,9 M NaHzP04 (1:9)
Скорость потока — 1 мл/мин.
Детектирование — УФ при 225 нм.
Времена удерживания — зависят от концентрации, но примерные значения для;
40 А82846С вЂ” 6,6 мин, A82846B — 8,9 мин, А82846А — 9,5 мин.
2. Колонка с обращенными фазами.
Носитель — Зорбакс ODS (колонка 4,6 х
150 мм).
45 Система — градиент вымывания 1О/ (NH4) Н2РОд:СНзСИ {95:5) до (1;1) в 20 мин, Скорость потока — 1 мл/мин.
Детектирование — УФ при 25 нм, Времена удерживания: А82846А—
50 7,3 мин, А82846С вЂ” 7,6 мин, А82846В—
8,0 мин.
Пример 2, Получение антибиотика
А82846, использование культуры А82846, А. брожение культуры А82846 до
55 встряхиваемости сосуда, Культуру Косагб!а
orientalls NRRL 18098 либо в виде лиофилизованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в жидком азоте, используют для заражения посевной среды следующего состава:
1724015
1,0
2,0
0,5
0,5
0,1
35
Разбавление до 1 л
А82846,2
Посевная среда, (%):
Глюкоза
Растворимый крахмал
Дрожжевой экстракт
Ферментивный гидролизат казеина
СаСОз
Деионизированная вода
Разбавлениедо1л
Перед стерилизацией добавлением
NaOH доводят рН среды примерно до 7,5.
Добавлением к посевной среде 2,5% агара готовят скошенный агар или пластины. Зараженный скошенный агар инкубируют при 30 С от 10 до 14 дней. Вызревшую культуру на скошенном агаре соскребают стерильным инструментом с целью разрыхления спор, удаления и отделения мицелиальной пленки. Примерно четвертую часть полученных разрыхленных спор и культуры используют для заражения 50 мл посевной среды первой стадии.
Зараженную среду первой стадии инкубируют в колбе Эрленмейера на 250 мл в течение 24 — 48 ч при 30 С на качалке, вращающейся со скоростью 250 об/мин по кругу в два дюйма (5,08 см).
Полученную в результате инкубирования среду первой стадии (0,5 мл) используют для заражения 50 мл продуцирующей среды следующего состава, %:
Глюкоза 2,5
Соевая мука 1,5
Картофельный декстрин 3,0
СаСОз 0,25
Конечная меласса 0,3
Подвергнутый кислотному гидролизу казеин 0,5
Деионизированная вода Разбавлениедо1л
Перед стерилизацией добавлением
Na0H устанавливают рН 7,5, Зараженную продуцирующую среду инкубируют в широкогорлой колбе Эрлемейера на 250 мл при 30 С от 4 до 5 дней на качалке, вращающейся со скоростью 250 об/мин по кругу в 5,08 см.
Б. Брожение культуру А82846 в чане.
Для приготовления в большом объеме посевного материала 10 мл инкубированной среды первой стадии, и ригото ален ной согласно разделу А, используют для заражения 400 мл питательной среды второй стадии, имеющей состав, аналогичный составу среды первой стадии. Такую вегетативную среду второй стадии инкубируют при 30 С в течение примерно 48 ч в широкогорлой колбе Эрленмейера на 1 л на качалке, вращающейся со скоростью в
250 об/мин по кругу в 5,08 см.
Полученную в результате инкубированную вегетативную среду второй стадии (1000 мл) используют для заражения 100 л стерильной продуцирующей среды, приготовленной согласно разделу А за тем исключением, что добавляют противопенную присадку Р— 2000 (0,3 г/л). Зараженную продуцирующую среду оставляют бродить в перемешиваемом чане для брожения на
165 л при 30 С в течение от 90 до 100 ч.
Воздушный поток в перемешиваемом сосуде (80 об/мин) устанавливают так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял примерно 50%> от насыщения.
В, Другой вариант брожения культуры
А82846 в чане. Осуществляют способ раздела Б за исключением того, что соответствующим количеством вегетативной среды заражают примерно 3402 л продуцирующей среды, помещенной в чан брожения на 4536 л.
Пример 3. Получение антибиотика А82846 с использованием культуры
А82846.1.
Культуру Nocardia orientalis NRRL18099 либо в виде лиофилизованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в жидком азоте, культивируют согласно методике примера 2, за исключением того, что продуцирующая среда имеет следующий состав,%:
Глюкоза 1,0
Картофельный декстрин 2,0
Пептон 1,0
СаСОз 0,2
Конечная меласса 2,0
Деионизированная вода рН не устанавливают, Пример 4, Получение антибиотика
А82846 с использованием культуры
Культуру Nocardia orientalis NRRL 18100 в виде лиофилизованных таблеток, либо в виде суспензии, выдерживаемой в жидком азоте, культивируют согласно методике примера 2 за исключением того, что в качестве источника азота используют Амиказ, Пример 5. Получение сырого А82846.
Ферментационный бульон (4200 л) из бродильного чана на 4536 л, приготовленный по методике примера 2 раздел В, добавлением 5 N NaOH подщелачивают до рН
10,5, после чего добавляют 3 Целита 545 (фильтрующая добавка). Смесь фильтруют через пресс-фильтр и промывают водой, Объединенные фильтрат и промывочные во16
5
10 ды (4200 л) доводят до рН 7 добавлением 5 н НС! (или HzS04) и переносят на колонку, заполненную смолой Даузкс-XFS -3278 (NH4 ) (200 л фильтрата/10 смолы). Колонку вы мывают при скорости потока 750 мл/мин.
Фракции проверяют либо в биоиспытании с использованием Bacillus subtilis, либо с помощью ВЭЖХ.
Колонку промывают 5 колоночными объемами воды, собирая аликвоты до 100 л.
Активный материал вымывают со смолы
5 колоночными объемами 0,05 N ЙН4ОН с отбором фракций по 25 л. Содержание
А82846 фракции объединяют и концентрируют в вакууме примерно до 30 л. Полученный раствор наносят на колонку объемом
10 л, заполненную смолой Диаион HP-20 в воде. Колонку промывают 3 колоночными объемами воды при скорости потока
300 мл/мин, Промывные воды отбрасывают. Активный материал вымывают с колонки раствором Н20:изо-PrOH (95:5), содержащим 1 -уксусной кислоты, при скорости потока 100 мл/мин с отбором фракций по 4 л, которые проверяют в биоиспытании или с помощью ВЭЖХ. Содержание А82846 фракции (№ 6 — 14) объединяют, концентрируют в вакууме и сушат вымораживанием с получением 356 r сырого А82846.
Пример 6. Выделение А82846А и
А82846В.
А, Разделение обогащенных А82846А и
А82846В, В 500 мл воды .растворяют 30 г
В82846, приготовленного по методике примера 5 и переносят в находящуюся под давлением колонку из нержавеющей стали на
30 л, заполненную силикагелем LP-1/C
NH4H2PO4 (60 a) к смеси вода — ацетонитрил (88:12), содержащей 1 NH4HzPO4(60 m) при скорости потока 250 — 300 мл/мин (макс. давление 42,2 кг/см ) с отбором фракций по
4 л и их проверкой с помощью УФ-детектора при 254 нм. Отдельные фракции проверяют с помощью аналитической ВЭЖХ, Фракции, обогащенные А82846А (№6 — 9), и фракции, обогащенные А82846В {№ 10 — 17), объединяют и концентрируют в вакууме.
Б. Очистка А82846А, Концентраты, обогащенные А82846, из двух загрузок по 30 r, проведенных согласно описанию раздела А, обессоливают на колонке (1750 мл) Диаион
HP-20 SS промыванием водой, вымыванием смесью Н20.изо-PrOH (95:5), содержащей
0,5 уксусной кислоты, и контролем с помощью аналитической ВЭЖХ. Содержащие;
А82846 фракции объединяют, концентриру15
55 ют и сушат вымораживанием с получением
7,4 г препарата, обогащенного А82846.
Обогащенный А82846 препарат (8,2 г) растворяют в воде и переносят на препаративную ВЭЖХ колонку, заполненную силикагелем LP-1/С1в в 1 NH4HzPO4. Колонку проявляют градиентом 10 NH4HzPO4 к смеси 1 NH 48 мл/мин. После вымывания первых 10 л собирают фракции по 500 мл. Фракции, содержащие А82846А (№ 4-10), и фракции, содержащие А82846В {¹ 12-20), объединяют и концентрируют в вакууме. Концентраты А82846А из трех загрузок объединяют и для обессоливания наносят на колонку(1750 мл) Диаиона HP — 20SS, Колонку промывают водой и А82846А вымывают смесью HzO — изо-PrOH (95:5), содержащей 0,5 o уксусной кислоты. Вымывание контролируют с помощью ВЭЖХ. Содержащие А82846В фракции объединяют, концентрируют и сушат вымораживанием с получением 7,9 r очищенного А82846А. В. Очистка А82846В. Обогащенные А82846В фракции из 3 загрузок разделения А82846А и А82846В на препаративных ВЭЖХ колонках, приготовленных согласно методике раздела Б, объединяют и обессоливают на колонке (1750 мл) Диаион HP — 20 SS промыванием водой и вымыванием смесью HzO — изо-PrOH {95:5), содержащей 0,5 уксусной кислоты. Вымывание контролируют с помощью ВЭЖХ, фракции А82846В объединяют, концентрируют в вакууме и после высушивания вымораживанием получают 8,8 г очищенного А82846В. Г. Обессоливание, Обессоливание может быть также осуществлено использованием смолы Диаион HP — 20 SS и смеси МеОН:Н20 (4:1), содержащей 0,1 уксусной кислоты, для вымывания, Пример 7. Выделение А82846С, А, Отделение А82846, Бульон брожения (461 л), полученный из четырех загрузок по 165 л проведенных согласно разделу Б примера 2, подщелачивают 5 í. NaOH до рН 10,5 и фильтруют после добавления 3% Хайфло Супецеля (фильтрующая добавка), Фильтрат (30 л) подкисля:от добавлением 5 N HCI до рН 7 и переносят на колонку, заполненную 10 л смолы Дауэкс — XFS-3273 {NH4 ). Колонку промывают 50 л воды, активный материал вымывают 0,05 í.NH4OH (50 л) с отбором фракций по 4 л, Вымывание контролируют с помощью биоиспытания, Активные фракции (№ 1 — 7) объединяют, концентрируют в вакууме до 1724015 25 35 ходами, мг 55 объема примерно 1700 мл и после высушивания получают 283,9 r сырого А82846. Б. Разделение А82846А, В и С. Сырой А82846 (2 г), приготовленный по методике раздела А, растворяют в воде и переносят на колонку (5,08 х 115 см) из нержавеющей стали, заполненную 2110 мл силикагеля LP-1/С1в в 1% ЙН4НгРО4. Колонку проявляют использованием градиента от 1% ИН4НгРО4 до 1% МН4НгРО4 — ацетонитрил (92:8) при скорости потока 70 млlмин с отбором фракций по 400 мл и контролем с помощью УФ при 254 нм. Фракции, содержащие А82846А (№ 11-1), объединяют как продукт 1; фракции, содержащие А82846С (№ 16 — 20) объединяют как продукт 2; фракции, содержащие А82846В (№ 21 — 25), объединяют как продукт 3. B. Очистка А82846С. Продукт 2 концентрируют до объема примерно в 200 мл и с целью обессоливания переносят на стеклянную колонку (7 х 45 см), заполненную 1800 мл смолы Диаион HP 20. Активный материал вымывают смесью MeOH:НгО (4:1), содержащей 0,1% уксусной кислоты и при скорости потока 25 мл/мин отбирают фракции по 1 л. Содержание С фракции (№ 9-12) объединяют, концентрируют в вакууме и после сушки вымораживанием получают 662,2 мг полуочищенного А82846С. Полуочищенный А82846С (500 мг) подвергают дальнейшей очистке повторением операций ВЭЖХ с обращением фаз использованием колонки (2,5 х 122 см) из нержавеющей стали, заполненной 50 мл силикагеля LP — 1/С<в, и градиента от 1% NH4HzP04 до 1% NH 45 см), заполненной смолой HP — 20. Колонку вымывают смесью MeOH — Н20, содержащей 0,1% уксусной кислоты с отбором фракций по 100 мл и контроле вымывания с помощью аналитической ВЭЖХ в сочетании с УФ при 254 нм, Содержание А82846С фракции (№ 5 — 11) объединяют, концентрируют в вакууме и после сушки вымораживанием получают 127,3 мг А82846С. Продукт 1, содержащий А82846А, и продукт 3, содержащий А82846В, подвергают аналогичной очистке получением дополнительных количеств очищенных А82846А и А82846В. Г. Дальнейшая очистка А82846С. А82846С (70 мл) подвергают дальнейшей очистке использованием следующей методики препаративной хроматографии: Колонка — Зорбакс SCX (9,2 х 250 мм) катионообменная смола. Подвижная фаза — Линейный градиент от 0,15 M йаНгРО4 буфера, содержащего 10% МеОН, до 0,9 M йаНгРОа буфера, содержащего 10% МеОН, в течение 6 мин и удерживанием в течение 5 мин (без регулировки буфера). Скорость потока — 6,0 мл/мин. Детектирование — УФ при 280 нм Загрузка — Инъекцией по 6,0 кг в Н20. А82846С собирают применением автоматического отборника фракций, снабженного механизмом детектирования. пиков. Подвижную фазу подают.с помощью системы градиента ВЭЖХ М600, раствор образца впрыскивают с помощью автоматического прибора для ввода проб. Содержащие А82846С фракции объединяют, концентрируют до объема в 30 мл и переносят на колонку, заполненную HP — 20 (50 мл). Колонку промывают водой и вымывают смесью Н О вЂ” изопропанол (95:5), содержащей 0,5% АсОН, с отбором фракций по 25 мл. Содержащие А82846С фракции (№ 9 — 14) объединяют, концентрируют и лиофилизуют с получением 37 мг очищенного А82846С. Пример 8. Получение солей А82846. В каждом случае компонент А82846 (100 мг) растворяют вдеионизированной воде (10 мл). В полученном растворе устанавливают рН 3 добавлением 0 5 кислоты (HCI, Н2$04 и Н РО ). Раствор лиофилизуют с получением соответствующей соли. При понижении рН ниже 3 (например, до рН 2), происходит разрушение компонента. В результате получают соли со следующими выСоль А82846А А82846В HCI 93,8 мг 88,1 Н $0 92,5 мг 75,4 НзРО4 110,8 мг 105,7 Формула изобретения 1. Способ получения гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С или их солей, заключающийся в том, что штамм Nocardia orientalis МЯЯ1 18098, или штамм Nocardia orientalis МВВ1 18099, или штамм Nocardia orientalis NRRL 18100 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в аэробных глубинных условиях выделяют антибиотической комплекс из культуральной жидкости с последующей очисткой и хроматографическим разделением раствора комплекса на компоненты А82846А, А82846В и А82846С, при этом для получения компонентов комплекса в виде солей очи20 1724015 Таблица1 Среда А82846 агара А8246.1 1SP 1Г 2 P ИзобильныД Иэобильныя (шелушение поверхности) 57.I.Âã Отсутстаие Изобипьныд 58.m.Br Следы Оь 59.d Вг Вм:ИзобильныД/д Средне-серыд Ptm Теино-коричнеаыд пигмент - отсутстеие изменения РИ Саетло"коричнеаый Отсутствие Слабьл 92.у Белая Слабьл ь а Бельм Хороший 92.у Белал Обильный: а белыД IВР 1/ 3 P: Хороший О: 92.у Белая ВИ:Хорошид,а SeРнь Отсутствие Отсутствие Отсутстеие 1SP It Хороший 7/.m,syz Br Хороший: а белыц Отсутствие Изобильныи 47А By эВг Хороший: d светлосерыд Сзетло-коричнееыД Слэбьл 92. у Белая Слабьм: а Белья P Изосильньд О: 56 глубоко sr Вн: Иэобильньй а Бегыд Pn: Отсутствие P: Изобильньй О: 47 А.Ву zsr Внь Хороший гд светло-серыд Рп:Сееттю"корнчкеаыд Отсутстене Изобильный ч7А К> zsr Отсутствие 1SP B 5 Светло-коричнааыя Изобнльныд 59.d Вг Изобильнььз:d свет" ло-серия Тенко-коричневый пигмент Хороюня 78Л ysr Следы P: Изооильныд Оь 59А Br ВиьИзобнльныйь а Средне-серый Pn: Теино-корич-. пЕаыд пигиент отсутствие измерения рб 1SP II / Саетло"коричнеаьй пигмент Изоьильньл 56.глупоко Br Цзооипьныд: а белыд P: Изобильный О: 56.глубоко вг Внь Изобильньй: а Бельл Хороший 47À гу Вг Отаутстзие Среде Чапека Рн: ОтСутствие Красно-оранкееыд Саетло-красно-оранисеый Хорошиь1 58..щ.Вг Хорошид 7j.m.ó Вг P: Хороший Оь 5&zsr (от" дельные яятнз) Вм; Обильный: а Белья Рпь Отсутстене Глюкоза Асгырагин Отсутствие Отсутствие Отсутстаие Отсутствие упроюид (сморщенная алахная поверхность) Хорошнд (сморщенная епазмая поаеркность) Рь Изооильныя (шелуыение поверхности) 0l 21. Черноаато-красная Вм 10тсутстаие Рпь Глубоко красно-коричнеаьд Глюкоза дроаыееод экстракт 77.m.ysr 77.m.ysr Отсутствие Сзетло"цоричнеаыД Отсутстаие Отсутстаие Обильный 79 ° 1 ° Sy.ysr Слабый Отсутстеие Хароыий 76.l.óÂã Отсу гогене Отсутствие Питатальныд агар Изобильный 4/.d.sy.zsr Изобильный 57 ° I.Sr Тоиатная паста Оасяная нука Хорошийь d сеетло"серия Красно"коричнеаыд Следыьа бельм Отсутствие Хорошна 92. у Белый Хороший: а Белил Обильный 92. у Белыд Обильныз; d устрично"белыз Отсутствие Агар на еодопроеоднсд коде Отсутстаие Обильныд (без гидролиэа) 5/ 1 Sr Следы Сеетло-коричноаыз Хороший (гидропиэ) Иалат ь кальция 5б.ьпвг Отсутстаие Светло-коричнерыь П р и и е ч а н и е. Р РОст; О - обратная сторона; Вм - аоздуюныд ннцелий(Рп - растаоримыа пигмент, Инкубация е течение 21 дня при 30 С. щенный раствор комплекса подкисляют до рН на уровне 3,0. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают А82846А или его фармацевтически приемлемые соли. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают А828468 или его фармацевтически приемлемые соли. 4. Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL 18098 — продуцент гликопепP: Хорошия О: 45.1 dy zsr Вм:Отсутстзие РпьСеетло-«оричнеаыд Р: Изобильный О: 47.д Sy zBr ВмьОбильныд гд светло-сериа Рп:Темно-краснокоричнеаыд Рь Обильныд О: 92. у Белыд Ви:Обильныдь а 6епеА РпьОтсутстаие P: ОбильныД (без гидролиза) О: 57 1 ° Вг ВмэСледы Рп:Саетпо-коричнеаыд тидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С, 5. Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL18099 — продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С. 6. Штамм актиномицета Nocardia orientalis NRRL 18100- продуцент гликопептидных антибиотиков А82846А, А82846В и А82846С, 22 1724015 Таблица 2 А 82846.1 Свойство А 82846 Изобильная 5мм Мягкая Следы Светло-коричневый Фрагментация Размер колонии Поверхность колонии Воздушные гифы Цвет обратной стороны Растворимый пигмент Образование кислоты из этанола гликогена мелезитозы раффинозы салицина Минимальная 7мм Твердая Изобильные Темно-коричневый Усвоение а-Мегликозида гликогена мелезитозы сорбозы бутирата Меланои ные пигменты Таблица 3 9 8 7 6 5 4 3 2 1 О PPM * мг/кг х 2, дозы введены мышам подкожно, спустя 1 и 4 ч после заражения. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 РРМ Фиг.2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 О РРМ Фаа У Составитель Г. Смирнова Редактор М. Недолуженко Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор М, Максимишинец Заказ 1071 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 1.01
