Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам получения микроносителей для культивирования клеток животных. Цель изобретения - повышение адгезивных свойств микроносителя, упрощение процесса культивирования клеток и увеличение выхода клеточной массы. Для этого к 3,5-4,0%-ному раствору желатины добавляют 0,14-0.20% ДЕАЕ-декстрана, 10- кратного раствора Эрла до объемного соотношения 1 00:(2,6-3,0)хи глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08- 0,1 %. После формирования геля его замораживают при (-20)-(-25)°С, затем размораживают, дробят, отмывают и стерилизуют . Частицы микроносителя представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05-2,0 мм и размером ячеек 40-80 мкм. По сравнению с прототипом на 14% увеличивается адгезивность частиц микроносителя, выход клеточной биомассы увеличивается в 1,3 раза. Кроме того использование полученного микроносителя исключает необходимость подбора условий в начальный период культивирования клеток. 1 табл. сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ! ф (;

I QQ (21) 4820903/13 (22) 05.05.90 (46) 07.04.92. Бюл. N. 13 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (72) B,Ã,Ëèòoâ÷åíêî, Ю.Х.Хапчаев, Л.Л.Миронова, В.Д.Попова и Н.А.Семенова (53) 577.15 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1161548, кл. С 12 N 5/00, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микроносителей для культивирования клеток животных. Цель изобретения — повышение адгезивных свойств микроносителя, упрощение процесса культивирования клеток и

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения микроносителей(МН) для культивирования клеток животных с зависимым от прикрепления к твердой подложке ростом.

Использование MH для выращивания клеток животных поз юляет значительно оптимизировать процессы как получения биомассы самих клеток, так и продуктов, синтезированных ими, к примеру гормонов, вирусов и других биологически активных веществ. При этом достигается снижение трудоемкости биотехнологических процессов в результате того. что появляется возможность использовать для культивирования клеток ферментационног0 оборудования, и тем самым становится возможным осущест Ы 1724687 А1 увеличение выхода клеточной массы, Для этого к 3,5 — 4,0 -ному раствору желатины добавляют 0,14 — 0,20% ДЕАЕ-декстрана, 10кратного раствора Эрла до объемного соотношения 100:(2,6 — 3,0) и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08—

0,1%. После формирования геля его замораживают при (— 20) — (— 25) С, затем размораживают, дробят, отмывают и стерилизуют., Частицы микроносителя представляют ячеистую структуру с размером частиц

0,05-2.0 мм и размером ячеек 40 — 80 мкм. По сравнению с прототипом на 14 увеличивается адгеэивность частиц микроносителя, выход клеточной биомассы увеличивается в

1,3 раза. Кроме того использование полученного микроносителя исключает необходимость подбора условий в начальный период культивирования клеток. 1 табл, влять процесс в одном объеме культивационной среды, Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения желатиновых MH для культивирования клеток животных, предусматривающих формирование частиц MH путем диспергирования

10-25%-ного раствора желатины, содержащего 1,4 — 1,75% глютарового альдегида, в неполярном органическом растворителе с последующей отмывкой сформированных частиц МН и их сепарированием.

Однако получаемые в результате известной обработки желатины частицы MH обладают низкими адгезивными свойствами в отношении клеток животных, что значительно усложняет процесс их использования, 1724687 так как при.этом необходимы подбор режимов посадки клеток, а также требуется специальное оборудование для осуществления начальных этапов культивирования клеток.

Целью изобретения является повышение адгезивных свойств МН, увеличение выхода клеток и упрощение процесса культивирования.

Для этого в раствор желатины (3,5—

4,0%) вносят дополнительно ДЕАЕ-декстран (до 0,14 — 0,20 ), десятикратный раствор ЭРЛА (e объемных соотношениях

100:(2,6 — 3,0), а для полимеризации желатины в нее добавляют глютаровый альдегид (0,08-0,10 ), Полученную смесь охлаждают до образования геля, а гель замораживают при (-20)-(-25) С, После разморозки геля частиц MH формируют из него путем дробления.

В предлагаемом способе íà этапе полимеризации желатины органическая фаза заменена на водную с формированием МН с пористой структурой, Предлагаемая в способе совокупность признаков позволяет получить MH с адгезией достаточной для прикрепления клеток животных во взвесях, что обеспечивает равномерное распределение их на поверхности МН и увеличивает выход клеточной массы, Способ осуществляют следующим образом.

В 50 мл 3,5-4.0 -ного раствора желатины, приготовленного из пищевой желатины

I или ll сорта, вносят последовательно

ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации

0,14 — 0,20, десятикратный раствор ЭРЛА в объемных соотношениях 100:(2,6 — 3,0) и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0,08-0,10%, причем последний ингредиент добавляют к раствору желатины капельно, тщательно перемешивая. Последнее обстоятельство вызвано тем, что в нагретом до 50 С растворе желатины глютаровый альдегид вызывает неравномерное формирование геля с узелковыми уплотнениями темного цвета. Затем полученную смесь охлаждают до 4 — 20 С и выдерживают ее до образования геля (полимеризация), В последующем гель замораживают при (-20)-(— 25) C. Формирование частиц МН производят путем дробления геля в ножевом гомогенизаторе при скорости вращения вала с ножами 100250 об/мин в течение 5-7 мин. По своей форме частицы MH представляют ячеистую структуру с размером частиц 0,05 — 2,0 мм и размером ячеек 40-80 мкм.

Частицы МН в последующем отмывают последовательно в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Передисполь45 верхности клетками, обрабатывают смесью

50 0,25 -ного раствора трипсина и 0,02 -ного раствора Версена. взятых в равных объемных соотношениях, после чего подсчитывают количество ресуспендированных клеток в камере Горяева, Прикрепление клеток

55 4647 к поверхности МН к пятому часу инкубирования составляет 85,4-86, а прикрепление клеток FAF-28 к этому же сроку инкубирования составляет 87,9-95о . Прирост клеточной массы через 6 сут культиви5

40 зованием МН стерилиэуют автоклавированием, отмывают раствором Хенкса до достижения рН 7.2 — 74 с последующим ресуспендированием МН в питательной среде.

Пример 1, К 50 мл 3,5 -ного раствора желатины добавляют последовательно

ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации

0,14, десятикратный раствор ЭРЛА в соотношении к объему желатины, равном

100;2,6, и глютаровый альдегид до конечной концентрации 0 08 Полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 4 С до образования геля. Затем гель замораживают при — 20 С, оттаивают до комнатной температуры и гомогенизируют до образования частиц размером 0,05-2,0 мм. Полученные частицы отмывают также в избытке физио- . логического раствора и автоклавируют в этом же растворе при 121 С в течение 20 мин, Выход целевого продукта составляет.

45 г (масса влажных частиц МН). После автоклавирования MH отмывают раствором

Хенкса до рН 7,2-7,4 с последующим ресуспендированием его в питательной среде.

Пример 2. Процесс получения частиц

MH осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что конечную концентрацию ДЕАЕ-декстрана доводят в смеси до

0,20-",ь, содержание десятикратного раствора ЭРЛА — до 100:3,0, глютарового альдегида — до конечной концентрации, равной

0,10%, При этом смесь выдерживают при

22 С до образования геля, который в последующем замораживают при -25 С. Выход целевого продукта в этом случае составляет

47 г (влажная масса частиц).

Адгезивную способность МН для клеток животных, в частности для клеток 4647 (перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки) и клеток FAF-28 (перевиваемая линия клеток китайского хомячка 8 lid-ii

FAF-28 (клон 237S), исследует при культивировании упомянутых клеток в присутствии

MH во взвеси. Через 5 ч после начала культивирования клеток с носителем из культиватора берут пробу, центрифугированием удаляют культуральную среду, а осадок, содержащий МН с прикрепленными к его по1724687

Прирост клеточной биоКонцентрация клеток в

1 мл через 6сут культивирования, xl0

Концентрация клеток в 1 мл через 5ч культивирования, х10з

КоличестИсходная концентра ция клеток, х10З условия культивирования

Микроноснтель во прикрепившихся масси через 6 сут культивирования клеток, Постоянное перемешивание после внесения клеточной взвеси

7,3 0,4

1,2

0,6=0,02

6о нцитоларн (известньй) Постоянное перемешивание через

5 ч после начала культивирования

40,2+0,3 6,7

4,0 0,4

6о

Постоянное перемешивание сразу после внесения клеточной взвеси

Микроноситель,припотовленньй

52,220,25 8,6

6о 51,O o,5 86 по предлагаемому способу

Составитель В. Литовченко

Редактор И. Дербак Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А. Осауленко

Заказ 1150 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина, 101 рования для клеток 4647 является 8,6 — 8,7кратным, а для клеток FAF-28 — 8,9-9.1-кратным.

По сравнению с известным способом, где процент прикрепившихся клеток к поверхности желатиновых МН ("Цитолар") составляет через 5 ч инкубирования (в оптимальном для этого типа МН режиме, при периодическом кратковременном перемешивании МН с клетками в течение первых

5 ч инкубирования) 72, а количество прикрепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, увеличивается на 14 (. B одинаковых условиях культивирования. а именно в условиях постоянного перемешивания МН с клетками в течение всего срока культивирования, включая и период адгеэии, количество прикрепленных клеток к МН, получаемому с помощью предлагаемого способа, на 76 выше, чем при использовании "Цитолара".

Прирост клеточной массы при использовании предлагаемого MH в 7,1 и 1.3 раза по сравнению с "Цитоларом" выше соответственно при различных режимах культивирования.

Результаты исследований сведены в таблицу, 5 Формула изобретения

Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток животных, включающий полимеризацию раствора желатины с образование геля, 10 формирование частиц микроносителя с последующей их отмывкой, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения адгезивных свойств частиц микроносителя, увеличения выхода клеток и упрощения процесса их

15 культивирования, перед полимеризацией в

3,5 — 4,0 -ный раствор желатины дополнительно вносят ДЕАЕ-декстран до конечной концентрации 0,14 — 0,20, десятикратный раствор Эрла до объемных соотношений

20 100:(2,6 — 3,0). полимеризацию геля осуществляют добавлением глютарового альдегида до конечной концентрации 0,08 — 0,107,, гель эамораживают при (— 20)-+25) С и после замораживания иэ него формируют частицы

25 микроносителя дроблением,