Штамм бактерий rноdососсus rноdоснrоus - продуцент нитрилгидратазы

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нитрилгидратазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 обладает следующими признаками: грампозитивный, неподвижный, спор не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные слабоветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. Штамм Rhodococcus rhodochrous 926 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ммоль мг/мин в отношении изобутиронитрила , 220 ммоль/мг/мин в отношении ацетонитрила, 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4826513/13 (22) 17.05.90 (46) 07.05.92. Бюл. N -17 (71) Саратовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) А.С.Яненко, И,Н.Полякова, О,Б,Астаурова, В.Н.Пауков, С.В.Козулин, М.К.Синолицкий, Т.Н. Моисеева, С.П. Воронин и В.Г.Деба бов (53) 663.15 (088,8) (56) EP ¹ 0204555, кл. С 12 P 13/02, опублик. 1986.

Agric. Biolog. Chem., 1988, v, 52, N. 7, р. 1813 — 1816. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS

RHODOCHROUS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИД РАТАЗ Ы (57) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: получение нового штамИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью.

Нитрилгидратаза — фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот в амиды, Известны микроорганизмы, продуцирующие фермент нитрилгидратазу, относящиеся к родам Corynebacterium, Nocardia, Brevibacterium, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Pseudumonas, Rhodococcus.. Ж „, 1731814 А1 (st)s С 12 N 9/78, С 12 P 13/02 ма бактерий — продуцента фермента нитрилгидратазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм

Rhodococcus rhodochrous BKllMS — 926 обладает следующими признаками: грампозитивный, неподвижный, спор не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18 — 20 ч образуют длинные слабоветвящиеся нити, которые через 48 — 72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. Штамм Rhodococcus

rhodochrous 926 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ммоль мг/мин в отношении изобутиронитрила, 220 ммоль/мг/мин в отношении ацетонитрила, 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила, Штамм Rhodococcus

rhodochrous BKllMS 926 может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот. 3 табл.

Одним из примеров использования этого фермента является получение акриламида из акрилонитрила.

Известны штаммы, способные к трансформации акрилонитрила в акриламид:

Corynebacterium N 771, Corynebacterium N 774, Nocardia N 775, Pseudomonas chlororophis

В23, Rhodococcus rhodochrous 1-1.

Недостатком данных штаммов является низкая ферментативная активность нитрилгидратазы, В случае штамма

Corynebacterium N 774 удельная активность нитрилгидратазы не превышала 38,5 ед, 1731814

Известен штамм Pseudomonas

chlororaphis В23, который при выращивании на среде, содержащей аминокислоту

L-цистеин (2 г/л), проявлял ферментативную активность 105,7 ед, Недостатком данного штамма является использование в культуральной среде дорогостоящей аминокислоты, Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм

Am-324, мутант Pseudomonas chlororaphis

В23, который обладает удел ь ной нитрил гидратазной активностью 141 ед, Недостатками данного штамма являются использование в среде культивирования дорогостоящих аминокислот L-пролина и 1= цистеина, дробное введение индуктора— метакриламида.

Целью изобретения является получение штамма с более высокой нитрилгидратазной активностью, не требующего использования аминокислот при выращивании, культивирование на простой синтетической среде, Заявляемый штамм Rhodococcus

rhodochrous М8 депонирован под номером

S-226 и характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками, Морфологические признаки: штамм грамположительный, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18 — 20 ч образуют длинные по 20 мкм, слабо ветвящиеся нити, которые через 48 — 72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы.

Палочковидные клетки имеют размеры

0,9-1,2 х 2,0-20,0 мкм. Деление клеток происходит как по раскалывающемуся, так и по сгибающемуся типу. В протоплазме клеток видны внутриклеточные включения в виде зерен (гра нуля р ность и ротоплазмы).

Культуральные свойства; при росте на мясопептонном агаре штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм (48 — 72 ч), поверхность сухая, матовая, розового цвета. При росте на мясопептонном бульоне образует пленку и осадок. Лакмусовое молоко не изменяет.

Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород, Штамм оксида за отрицательный, каталаза- и фосфатазаположительный. Растет при рН 6 — 9, оптимальное значение рН 7,0, при температуре 5 — 45 С, оптимальное значение температуры 30 С, В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты, 5

Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, сорбите, манните и глицерине. Газообразование ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника углерода использует инозит, маннит, мальтозу, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, не использует рамнозу, галактозу. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и твин 80 гидролизует.

Аденин не утилизирует.

Химический состав клеток; в клеточной стенке содержится meso-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза. Содержится липид А (LCN), характерный для родо ко кко в.

Чувствительность к антибактериальным препаратам; штамм чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ампициллину, пенициллину, мономициину, тетрациклину, рифампицину.

Патогенность: штамм непатогенный.

Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот, За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль амида в одну минуту, содержащегося в 1 мг сухого веса клеток.

Штамм Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 обладает более высокой активностью нитрилгидратазы (150 ед.) по сравнению со штаммом прототипом Am-324 (141 ед.) и не требует использования в культуральной среде дорогостоящих аминокислот, Пример 1. Выделение штамма

Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926.

Заявляемый штамм был выделен из почвы с производства акрилонитрила. Навеску почвы 1,0 г ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и отстаивали в течение 1 ч, Надосадочную жидкость в количестве 2 мл вносили в среду следующего состава, г;

К2Н РО4 0,5

КНОРР Оа 0,5

Mg S04 7Н20 0,5

FeSO4 7Н20 0,01

Глюкоза 1,0

Изобутиро нитрил 1,0

Вода водопроводная,мл 1000 рН 7,2":0,2

50 мл суспензии инкубировали в 300 мл колбе Эрленмейера при 28 — 30 С, при круговом перемешивании (число качаний

180 — 200 мин "). Через двое суток отбирали

1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высе1731814

1000

7,2:"0,2 вали на чашки Петри с агаризованной средой (1,5/ агар-агара) вышеуказанного состава. Посевы инкубировали 48-72 ч при

28 — 30 С, после чего отбирали наиболее крупные колонии, которые использовали в 5 дальнейших исследованиях. Колонии пересевали на чашки Петри с мясопептонным агаром. Выделенные культуры изучали на способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. 10

Микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде выделения, отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, ресуспендировали 15 в 2 мл буфера того же состава, содержащего акрилонитрил в концентрации 1 г/л. Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 н.

HCI. Количественное определение акриламида осуществляли методом газожидкост- 20 ной хроматографии на хроматографе

ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором. B качестве неподвижной фазы использовали Reoplex 400.

В результате была выделена культура 25

Rhodococcus rhodochrous М8 с высокой нитрилгидратазной активностью.

Пример 2. Использование штамма

Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 для трансформации изобутиронитрила в 30 изобутирамид.

Полученный штамм Rhodococcus

rhodochrous М8, ВКПМ S-926 предкультивировали в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/10 часть бульоном Хоттингера в 35 течение суток, на качалке (число качаний

120 мин ") при 30 С. Культуральную жидкость в объеме 10 мл инокулировали в 1,5 л ферментер. Состав среды, г:

Kz HP0< 0,5 40

KHzP04 0,5

Mg SO4 7Н20 0,5

СОС12 7H20 0,02

Глюкоза 10,0

Изобутирамид 2,5 45

Дистиллированная вода, мл рН

Условия культивирования:

Объем культуральной 50 среды, мл 1000

Скорость перемешивания, об/мин 600

Аэрация, мин 1:2

Температура, С 30 55 рН 7,2

Ферментацию вели при контролируемом значении рН. Подтитровку осуществляли 1 н. HCI и 1 н, КОН.

Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности, Концентрацию клеток определяли фотокалориметрически при длине волны

540 нм, толщине слоя 5,07 мм.

Акт IBHOCTb нитрилгидратазы оценивали следую:цим образом.

1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Буферную емкость и значение pH подбирали экспериментально.

Клетки ресуспендировали в буфере указанного состава до значения оптической плотности 0,2 — 0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной взвеси в фосфатном буфере добавляли изобутиронитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20 С в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н, HCI.

Бактериальные клетки отделяли центрифу-гированием. Концентрацию изобутирамида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.

Удельная активность нитрилгидратазы в отношении изобутиронитрила достигала

140 ед.

Пример 3. Использование штамма

Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 для трансформации ацетонитрила в ацетамид.

Штамм Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли ацетонитрил в количестве 25 мкл.

Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед.

Пример 4. Использование штамма

Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 для трансформации акрилонитрила в акриламид.

Штамм Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации как в примере 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2, В качестве субстрата добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл.

Изменение ферментативной активности в зависимости от стадии роста клеток представлена в табл. 1.

Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 150 ед.

Пример 5, Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма

Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926.

Бактерии Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 выращивали в течение 70 ч и подготавливали к трансформации по приме1731814

Таблица 1

Указанные величины оптической плотности промеряли после соответствующих разведений. ру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах.

Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии.

Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в табл. 2.

Таким образом нитрилгидратаза из штамма Rhodococcus rhodochrous М8, В КПМ S-926 обладает более высокой термостабильностью, чем аналогичный фермент из Pseudomonas chlororaphis В23 (температурный оптимум 20 С) и Rhodococcus sp. N

774 (температурный оптимум 35 С).

Пример 6. Индукция нитрилгидратазы при росте штамма Rhodococcus rhodochrous

М8, ВКПМ S-926 на мочевине.

Штамм Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 предкультивировали в колбах

Эрленмейера, содержащих бульон Хоттингера в течение суток на качалке при 30 С.

10 мл культуральной жидкости инокулировали в колбы Эрленмейера, содержащие

200 мл синтетической среды с различным количеством мочевины. Состав синтетической среды, г:

К2Н Р04 0,5

Na Н2РО4 0,5

Mg SO< 7HzO 0,5

СоС(г 6Н О 0,004

FeSO4 7HzO 0,005

Глюкоза 10,0 — 20,0

Дистиллированная вода, мл 1000

Клетки растили втечение 72 ч при 30 С.

Активность нитрилгидратазы определяли по примеру 2, Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от концентрации мочевины в среде представлено в табл. 3, Результаты табл. 3 показывают, что уровень индукции нитрилгидратазы возрастает с ростом концентрации мочевины в среде и удельная активность достигает максималь5 ного значения при концентрации мочевины

16 г/л.

Заявляемый бактериальный штамм М8, ВКПМ $-926 на основании таксономического изучения отнесен к виду Rhodococcus

10 rhodochrous. Штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды, Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus

15 rhodochrous М8 на минеральной среде с ионами кобальта, содержащей в качестве источника азота и индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например изобутиронитрил или изобутирамид, а в качестве

20 источника углерода — глюкозу. Максимальная активность нитрилгидратазы (удельная активность 300 и общая активность 2400) наблюдается при использовании в качестве источника азота и индуктора мочевины ко25 мерчески доступного соединения, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Еще одним важным технологическим преимуществом испол ьзования штамма Rhodococcus rhodochrous М8

30 в качестве катализатора при гидролизе нитрилов является высокая термостабильность нитрилгидратазы, Максимальная активность фермента (1000 ед.) наблюдается при

53 С.

35 Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилгидратазы и использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов кар40 боновых кислот.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhodococcus

rhodochrous ВКПМ S-926 — продуцент нитрил гидратазы.

10

1731814

Таблица 2

Таблица 3

15

Составитель С.Козулин

Техред М.Моргентал Корректор М,Пожо

Редактор Л.Гратилло

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1557 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5