Способ оценки биологической совместимости материала с роговицей

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии. Цель изобретения - повышение точности способа. Для осуществления способа используют культуру роговичного эндотелия человека (КРЭЧ), твердый материал заливают суспензией КРЭЧ в среде культивирования и инкубируют в течение 3 сут, а жидкий материал помещают на монослой КРЭЧ и инкубируют в течение 40 мин, затем монослой отмывают и заливают средой культивирования. 2 з.п. ф-лы.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4769914/14 (22) 13.12.89 (46) 15.05,92. Бюл. N 18 (75) В,Н.Каспаров. Ч,Дж.Джурулла-заде, М.Ю.Писцов и Н.В.Ермаков (53) 612,015 (088.8) (56) Офтальмологический журнал, 1985, N 5, с.303 †3. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

СОВМЕСТИМОСТИ МАТЕРИАЛОВ С РОГОВИЦЕИ

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмохирургии, Цель изобретения — повышение достоверности способа за счет большей его физиОЛОГИЧНОСТИ, Способ осуществляют. следующим образом;

Источником роговичного эндотелия слу>кат 20-36-недельные эмбрионы человека.

Эндотелий роговиц энуклеированных глаз соскабливают скальпелем, помещают в ячейки планшета и инкубируют в культурной среде 2 — 3 сут. Прикрепившиеся в виде монослоя клетки промывают и в дальнейшем смену среды производят через день. Получают конфлуентный (плотный) монослой культуры роговичного эндотелия человека (КРЭЧ) с плотностью (в среднем) 2000 кл./MM соответствующей норме для взрослого человека. Для получения суспензии с

2 ,> см поверхности монослоя снимают примерно 2 млн,клеток и пассируют через 7 — 10 дн. раствором трипсина с коэффициентом пересева 1. 10. После 2-3-го пассажа суспензию используют для опыта, . Ж 1732975 А1 (я)5 А 61 F 9/00//С 12 N 5/00 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, Цель изобретения — повышение точности способа. Для осуществления способа используют культуру роговичного эндотелия человека (КРЭЧ), твердый материал заливают суспензией

КРЭЧ в среде культивирования и инкубируют в течение 3 сут, а жидкий материал помещают на монослой КРЭЧ и инкубируют в течение 40 мин, затем монослой отмывают и заливают средой культивирования. 2 з,п. ф-лы.

Образец испытуемого твердого материала диаметром 5 мм закрепляют на дне чашки Петри (35 мм в диаметре) с помощью силиконовой смазки, После этого в каждую чашку наливают по 4 мл суспензии КРЭЧ в среде культивирования и помещают в СО2инкубатор при 37 С на 3 сут. Начиная с 4-х суток, с помощью фазоконтрастного микроскопа в динамике оценивают совместимость материала с эндотелием путем подсчета количества прикрепившихся к образцу клеток, количества и размера образовавшихся островков клеток. выявления наличия или отсутствия распластывания клеток.

При испытании жидких материалов из чашки Петри с монослоем КРЭЧ удаляют среду культивирования и наливают жидкий испытуемый материал в количестве, позволяющем полностью покрыть монослой. 3атем образец помещают в СО2-инкубатор при 37 С на 40 мин. Испытуемый материал сливают, монослой дважды промывают средой культивирования и заливают последней (если испытуемый материал прозрачен, то (Л

C ! (гд ! к

1Ю

|у а

1732975 микроскопию можно проводить, не удаляя его). Оценку совместимости материала с эндотелием роговицы производят с помощью фазоконтрастного микроскопа на основе подсчета потерь плотности клеток и выявления качественных изменений монослоя.

Пример 1. Образец полиметилметакрилата диаметром 5 мм закрепили на дне чашки Петри с помощью силиконовой смазки. В чашку налили 4 мл суспензии КРЭЧ в среде культивирования и поместили в СОгинкубатор при 37 С на 3 сут, Начиная с 4-х суток, с помощью фазоконтрастного микроскопа "М1сon" оценивали взаимодействие эндотелиальных клеток с испытуемым образцом, На 4-е сутки отмечалось прикрепление и распластывание эндотелиальных клеток на поверхности образца (до 16 — 18 кл./мм ), Затем продолжали инкубацию. К б-7-му дню эндотелиальные клетки располагались на поверхности образца, образуя островки монослоя по 8 — 10 кл. (в среднем до 20 островков на 1 мм поверхности полг и летил метакрилата).

Пример 2. Образец силикона диаметром 5 мм закрепили на дне чашки Петри с помощью силиконовой смазки. В чашку налили 4 мл суспензии КРЭЧ в среде культивирования и поместили в С02-èíêóáàòoð при 37 С на 3 сут. Оценку взаимодействия

""-ндотелиальных клеток с образцом проводили, начиная с 4-х суток, с помощью фазоконтрастного микроскопа "Nicon". На 4-е сутки отмечалось прикрепление эндотелиальных клеток к образцу, однако количество их было значительно меньшим, чем в случае с образцом полиметилметакрилата (5 — 6 кл./мм ), кроме того, не отмечалось расплаг стывания клеток. К 7-м суткам обнаруживались редкие (6-7 на 1 мм ) небольшие (4-5 г кл.) островки монослоя эндотелия, Приведенные примеры свидетельствуют о меньшем влиянии силикона на роговичный эндотелий по сравнению с полиметилметакрилатом (и, следовательно, о большей биосовместимости силикона с роговицей), что полностью соответствует данным, полученным в результате клинических исследований.

Пример 3, После подсчета плотности г эндотелиальных клеток (2030 кл./мм ) из чашки Петри. с монослоем КРЭЧ удалили среду культиsèðования и монослой залили жидким протектором эндотелия "Хилон".

После инкубации при 37 С в течение 40 мин (среднее время хирургической операции на глазу) испытуемый препарат слили, дважды промыли средой культивирования и залили последней, Взаимодействие препарата с монослоем оценивали с помощью фазоконтрастного микроскопа "Nicon". В качестве контроля использовали интактный монослой КРЭЧ, при микроскопии которого были видны четко очерченные удлиненные клетки

5 с хорошо видимым ядром.

При микроскопии монослоя эндотелия после удаления "Хилона" плотность эндотелиальных клеток осталась неизменной(2030 кл./мм ). Отмечалось незначительное набег

10 хание отдельных клеток (до 50 кл. на 1 мм ).

Пример 4. После подсчета плотности эндотелиальных клеток (1950 кл,/мм ) из г чашки Петри с монослоем КРЭЧ удалили среду культивирования и монослой залили

15 протектором эндотелия "Хонсурид". После инкубации при 37 С в течение 40 мин провели оценку взаимодействия препарата с эндотелием с помощью фазоконтрастного микроскопа "Nicon". В качестве контроля

20 использован интактный монослой КРЭЧ.

При микроскопии монослоя с "Хонсуридом отмечалось уменьшение плотности клеток до 1820 кл,/мм". До 0% сохранившихся клеток отечны, границы их размыты.

25 Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отрицательного действия на роговицу препарата "Хилон" и о наличии некоторого токсического влияния на эндотелий препарата "Хонсурид", что полностью

30 подтверждается данными клини«еских наблюдений, Предлагаемый способ в силу своей физиологичности позволяет с большой точностью проводить количественную и качест35 венную оценку биологической совместимости как твердых, так и жидких материалов с роговицей глаза.

Формула изобретения

1, Способ оценки биологической совме40 стимости материала с роговицей путем совмещения испытуемого материала с культурой ткани роговицы, культивирования в питательной среде с последующей оценкой совместимости микроскопическим методом

45 по изменению клеточной культуры, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения достоверности способа за счет большей pro физиологичности, используют культуру роговичного эндотелия человека.

50 2. Способ по и 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения специфичности способа, твердый материал заливают суспензией культуры роговичного эндотелия человека в среде культивирования и ин55 кубируют в течение не менее 3 сут, а оценку совместимости проводят на основе подсчета количества прикрепившихся к образцу клеток, количества и размера образовавшихся островков клеток, выявления наличия распластывания клеток, 1732975

15

25

35

45

Составитель Н,Ермаков

Техред М,Моргентал Корректор С,Шевкун

Редактор А.Огар

Заказ 1615 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5.

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

3. Способпоп1,отличающийся тем, что, с целью расширения возможностей, повышения специфичности при работе с жидкими материалами, помещают их на монослой культуры роговичного эндотелия человека и инкубируют не менее 40 мин, а оценку совместимости производят на основе подсчета потерь плотности клеток и выявления качественных изменений

5 монослоя.