Способ получения иммуностимулирующих тимусных полипептидов

 

Изобретение относится к получению биологически активных веществ из сырья животного происхождения, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение активности целевого продукта. Поставленная цель достигается за счет того, что тимус дикого северного оленя в возрасте до 3,5 лет гомогенизируют в растворе хлористого натрия, гомогенат выдерживают 12 - 18 ч при 2 - 6°С, удаляют осадок, нагревают до 80°С и выдерживают при заданной температуре 15 мин, удаляют осадок, охлаждают, надосадочную жидкость обрабатывают ацетоном, формируют приципитат, который высушивают, растворяют в трис-HCl буфере, ультрафильтруют через мембраны с номинальными пределами удержания по глобулярным белкам 6000 - 12000 дальтон, хроматографируют на сефадексе С-50, собирая фракцию с мол.м 1350 - 60000 дальтон. 2 табл.

Изобретение относится к получению биологически активных веществ из сырья животного происхождения, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии. Целью изобретения является повышение активности целевого продукта. Способ осуществляется следующим образом. Очищенный от жира и соединительной ткани тимус северного оленя от животных не старше 3,5 лет гомогенизируют в растворе 145 мМ хлористого натрия в соотношении 1:3, выдерживают в течение 12-18 ч при температуре 2-6^оС, ядра и осколки мембран удаляют центрифугированием при 1500-2000 g или фильтрацией через капроновый или бязевый фильтр. Супернатант прогревают до 80^оС и выдерживают при этой температуре 15 мин. Денатурированные белки удаляют центрифугированием или фильтрацией. Супернатант или фильтрат охлаждают до 0^оС и медленно по каплям добавляют при интенсивном перемешивании в 5-кратный объем охлажденного до -20^оС ацетона и оставляют при постоянном перемешивании и температуре -10-15^оС на 18-20 ч. После этого выключают мешалку и формируют осадок, который трехкратно отмывают ацетоном, декантируют и высушивают под тягой. Сухой ацетоновый порошок растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере, декантируют нерастворимый осадок центрифугированием, повторяют растворение и доводят концентрацию белка в супернатанте до 10 мг/мл. Полученный раствор фильтруют через мембраны типа РМ-10, УМ-10 (Амикон) или любую другую аналогичную по размеру пор мембрану либо используют полые волокна с номинальными пределами удержания по глобулярным белкам от 6000 до 12000 дальтон. Образовавшийся на мембране осадок трижды промывают буфером, фильтрат объединяют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат хроматографируют на колонке с гелем с разрешающей способностью от 1,3 до 30 кД (например, на сефадексе С-50, ультрагеле АсА 202) уравновешенным 0,05 мМ, трис-HCl буфером, рН 8,0 на 145 мМ хлористом натрии. Пептиды с мол.м. 1350-6000 дальтон собирают, лиофилизируют, обессоливают на сефадексе С-50, лиофилизируют и используют в тестах определения биологической активности. В азотиапрановом тесте изучалась активность ультрафильтрата и активность продукта на стадии хроматографического фракционирования на сефадексе С-50. Результаты сравнительного изучения активностей разных фракций препарата представлены в табл. 1. Результаты по выходу препарата по фракциям при нанесении на колонку с сефадексом С-50 препарата представлены в табл. 2. Результаты, представленные в табл. 1 и 2, показывают, что фракция 6000-1350 максимально активна и на ее долю приходится более чем на 65% от общей суммы фракций по выходу их на заключительном этапе. Сравнительный анализ активностей конечного продукта в изобретении и способе-прототипе в тесте определения биологической активности по восстановлению чувствительности Е-РОК селезенки тимэктомированных мышей С 57 В 1/6 показал, что активность целевого продукта, полученного по способу-прототипу, составила 10 мкг, а активность целевого продукта с мол.м. 1350-6000 дальтон, полученного по предложенному способу 0,5 мкг, т.е. = 20 - в двадцать раз выше. По данным исследований препарата "Олевил", проведенных Новокузнецким химико-фармацевтическим институтом по программе Фармкомитета на экспериментальных животных, он не обладает острой токсичностью при введении животным в дозе 100 мг/кг массы тела, не обладает пирогенностью, не являетcя аллергеном. В терапевтических дозах (1 мкг/кг) не влияет на анафилактические реакции, в дозе 5 мг/кг достоверно снижает проявления анафилактического шока. Препарат на тератогенен и не эмбриотоксичен в дозах, превышающих терапевтическую в 100 раз. Таким образом, выделяемые по способу пептиды обладают более высокой по сравнению с прототипом активностью (в 20 раз), являются более гомогенными (мол. м. 1350-6000 л) по сравнению с прототипом и могут быть охарактеризованы такими общими физико-химическими свойствами: водный (0,1%) раствор имеет максимум поглощения при 275 нм. Отношение оптических плотностей при 280 и 260 нм (характеризует относительное содержание пептидов и соединений нуклеотидной природы) находится в пределах 1,4-1,6. Удельный показатель поглощения Е₁^0,1% см для конечного продукта составляет 0,650-0,750. Удельное вращение 1% раствора препарат должно быть 75-85^о. Предложенный способ позволяет получить тимусные полипептиды аналогичного действия, что и прототип, но обеспечивает получение продукта с более высокой по сравнению с прототипом активностью.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ ТИМУСНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ, включающий гомогенизацию сырья в растворе хлористого натрия, центрифигурирование, нагревание недостаточной жидкости до 80^oС и инкубацию, удаление осадка, охлаждение, обработку ацетоном, формирование преципитата, его высушивание, растворение ацетонового порошка в трис-HCl буфере, центрифугирование, хроматографию на сефадексе супернатанта с последующим сбором фракций, содержащих целевой продукт, его лиофилизацию, тельфильтрацию, повторную лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве сырья используют тимус северного оленя, который забирают у животных в возрасте до 3,5 лет, перед центрифугированием гомогената проводят его аутолиз, а перед хроматографией супернатант ультрафильтруют через мембраны с пределом удержания по белку 6000 - 12000 дальтон, гельхроматографию проводят на сефадексе 6 - 50 и собирают фракции, содержащие целевой продукт с мол.м. 1350 - 6000 дальтон, относительным содержанием пептидов и соединений нуклеотидной природы 1,4 - 1,6, удельным показателем поглощения Е₁^0,1% см при длине волн 275 нм, равным 0,650 - 0,750, удельным вращением 1%-ного водного раствора от 75 до 85^o.

РИСУНКИ

Рисунок 1