Способ культивирования неспорообразующих бактерий

 

. СОЮЗ СОВЕТСЙИХ (ОИ Л ЮП %64

РЕСПУЬ ЛИК (g))g С 12 К 1/00, 1/38

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

AO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНР1ЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4131 l 23/ l 3 (22) 24,08.89 (46) 07.06.92. Бюл. и 21 (71). Научно-исследовательский конктрукторско-технологический институт биологически активных веществ Научнопроизводственного объединения "Вектор." и Институт катализа СО АН СССР. (72) В.А. Гусев, Т.В.. Шильникова, С.А. Пушкарев и P.À. Шкрабина (53 ) 663 1 (088. 8), (56) Авторское свидетельство СССР

N 1280006, кл. С 12 Я- 1/20, 1985.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к биотехнологии культивирования неспорообразующих микроорганизмов, и.может быть использо" вано в микробиологической и медицинской промышленности.

Внедрение биотехнологии в производство биологически активных веществ требует. оптимизации развития бактери альных популяций и максимального использования культуральных сред. Ин тенсификация процессов культивирования может быть достигнута за счет уменьшения эффекта ингибирования роста клеток продуктами метаболизма.

Известно, что развитие. микроорганизмов в культуральной жидкости прекращается задолго до полного исчерпания субстрата вследствие накопления промежуточных продуктов метаболизма, ингибирующих их рост.В результате в..SU< „, 173 847 А1

2 (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НЕСПОРООБ".

РАЗУ}0ЩИХ БАКТЕРИЙ (57) Использование: микробиология,биотехнология. культивирования неспорообразующих микроорганизмов, Сущность изобретения: клетки неспорообраэующих микроорганизмов. выращивают в жидкой питательной среде в присутствии шари- . ков из активной окиси алюминия в g-иодификации с удепьной площадью поверхности 140-312 м /г в соотношении

50:1. Шарики помещают в перфорированную емкость, выполненную из химически инертного материала, и располагают в потоке аэрирующего газа.каждом цикле ферментации теряется до

503 и более исходного органического. субстрата. Кроме того, сброс отработанной культуральной жидкости, .содержа" щей продукты метаболизма, способствует нарушению экологического баланса микрофлоры окружающей среды.

Известен диализный способ удаления продуктов метаболизма, ингибиторов роста из культивируемого объема..Способ позволяет продлить активное размножение клеток в экспоненциальной фазе, в результате чего достигается более высокая плотность популяции.

Однако повышение выхода биомассы с единицы культивируемого объема требует большого расхода культурал ной жидкости. Вследствие этого увеличение количества биомассы отрицательно сказывается на суммарном количестве использованной культуральной среды. Вви123884 ду сложности осуществления в промышленности способ практического применения не находит, Наиболее близким к предлагаемому является способ выращивания неспорообразующих бактерий, предусматривающий инокуляцию микроорганизмов в жидкой питательной среде с внесенным в нее высокодисперсным кремнеземом, со- 1О держащим на поверхности ОН-группы, в концентрации 0,1-1,0 мг/мл. В результате выход биомассы бактерий повышается на 20-7U3.

Недостатком. известного способа является малый прирост биомассы по сравнению с контролем, Цель изобретения - повышение выхода биомассы эа счет оптимального ис" пользования ресурсов питательной сре- 20 ды.

Поставленная цель достигается тем, что выращивание клеток микроорганизмов осуществляют в жидкой питательной среде в присутствии шариков из актив- Zg ной окиси алюминия в -модификации с удельной площадью поверхности 140

312 и /r в соотношу чи 50:1, которые помещают в перфорированную емкость,выполненную из химически инертного материала, и располагают в потоке аэрирующего газа.

Активная окись алюминия в II -модификации, обладая амфотерными свойствами и развитой поверхностью, при нейтральных значениях рН способна выполнять функцию буферной среды и обеспечить удаление scex кислых продуктов метаболизма, ингибирующих рост микро" организмов. Отсутствие неконтролируемых примесей, неизбежно присутствующих в сорбентах природного происхождения, позволяет проводить процесс куль.тивирования .без изменения отработанных режимов ферментации.

Экспериментальные данные по культивированию клеток Е.coli на минималь.ной среде с добавлением различных образцов -окиси алюминия, отличающихся площадью поглощающей поверхности

S, показывают, что при использовании сорбентов .с S g, уравной 140 и

312 м /г, концентрация жизнеспособных клеток повышается в 5 и 17 раз соответственно по сравнению с контролем.

Соотношение среда:сорбент 50:1 обеспечивает сорбцию продуктов метаболизма и при этом не изменяет усло7 вий аэрации и перемешивания в рабочем объеме ферментера, обеспечивая мас соперенос между сорбентом и культуральной жидкостью. При соотношении более 50:1 происходит неполное удале" ние продуктов метаболизма микроорганизмов за счет недостатка сорбцион- ных цен ров сорбента. При соотношении менее 50:1 вносится избыточное коли.чество сорбента, требующее повышения интенсивности аэрации и активного перемешивания, что привоДит к механическому измельчению сорбента.

Способ осуществляют следующим об-. разом.

В ферментер заливают питательную среду и в перфорированную емкость из химически инертного материала помещают сорбент. Затем устанавливают режимы термостатирования, аэрации и перемешивания и вносят посевную дозу клеток.

Культивирование микроорганизмов прово-. дят в течение 6-7 ч, контролируя оптическую плотность культуральной жид" кости и определяя число жизнеспособных клеток.

Пример 1, В ферментер объемом

1 л помешают 800 мл глюкозы - минеральной среды И 9, вносят инокулят t клеток Е.coli. штамм К-12 в посевной дозе 1:100. Культивирование проводят при 37 С в течение 6-7 ч.

Перемешивание и аэрацию осуществляют с помощью мешалки и путем подачи стерильного воздуха с интенсивностью, необходимой для поддержания нормального роста клеток микроорганизмов.

Число жизнеспособных клеток составляет (2,9+0,4) ° 101мл

Определение динамики роста числа жизнеспособных клеток проводят путем отбора проб через 30 мин с их последо- вательным разведением и высевом на поверхность агаризованной питательной среды. Подсчет выросших колоний проводят через 18 ч после инкубирования ! при 37 С.

Пример 2, Культивирование клеток Е.coli проводят, как в примере .

1, кроме того, что в ферментер помещают перфорированную емкость из химически. инертного материала, заполненную

11-окисью алюминия в форме шариков с

Spy, равной 140 м /г. Соотношение объемов сорбента и суспензии 1:50.

Аэрацию осуществляют путем подачи воздуха через сорбент. Число жизнеспоФормула изобретения

Г

Корректор M. Самборская

Составитель Л. Юшкова

Техред М.Моргентал

1-едактор В. Петраш

Заказ 1977 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета ао изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035 Москва, I-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

173884 собнух клеток составляет (1,6+0 1)х

Х10 мл у j

Пример 3. Культивирование кле»;, ток проводят, как в примере 2, но 5 используют сорбент с S, равной

312 м /r. Число жизнеспособных клеток

2 .составляет (5,1+0,9)- 10 мл 1.

Пример 4, Культивирование проводят подобно примеру 3, но при соот- 10 ношении объемов сорбента и суспензии

1:20 и для поддержания частиц сорбен. та во взвешенном состоянии увеличивают интенсивность аэрации и перемешивания культуральной суспензии. Это приводит к нарушению оптимума аэрации, измельчению сорбента и появлению мутности суспензии уже через 2 ч после начала . культивирования и невозможности конт" роля за ростом клеток.

Пример 5. Культивирование проводят подобно примеру 3, но при соотношении ббьемов сорбента и суспензии

1 .60. Недостаток массы сорбента не обеспечивает полного удаления продуктов метаболизма. Число жизнеспособных клеток не выше, чеи в примере 1.

Пример 6. Культивирование проводят подобно примеру 3, но сорбент помещают непосредственно в ферментер.

7 б

При перемешивании сорбента происходит механическое измельчение сорбента, ввиду чего невозможен спектрофотометрический контроль за ростом клеточной популяции.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оптимально использовать ресурсы питательной среды, повысить выход биомассы в 5-17 раз и обеспечить полное удаление кислых продуктов метаболизма сахаров, ингибирующих рост клеток.

Способ культивирования неспорообразующих бактерий в жидкой питательной среде в присутствии твердой фазы в условиях аэрации, о т .л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения выхода, в качестве твердой фазы используют шарики из активной окиси алюминия в g -модификации с удельной площадью поверхности 140-312 м /г в соотношении 50:1, помещенные в перфорированную емкость, выполненную иэ химически инертного материала, и располагают их в потоке аэрирующего газа.