Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм F-436 получен из штамма Penlclllium canescens 20171 (ВКПМ F-178) путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и отбора в селективных условиях. При глубинном культивировании на питательной среде, содержащей 3% свекловичного жома, 5% белково-витаминного концентрата и 2,5% однозамещенного фосфорнокислого калия, через 120-144 ч роста при 30°С штамм ВКПМ F-436 накапливает в культуральной жидкости внеклеточную ft -галактозидазу, активность которой составляет: 100-130 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 30°С), 140-160 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 37°С), 62-68 ед./мл (гидролиз лактозы при 30°С). От известных продуцентов той же тоаксономической группы штамм ВКПМ F-436 отличается рядом культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков. 2 табл. Ё

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (69) (!!) (s<)s С 12 N 9/38, 1/14

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4836096/13 (22) 08.06.90 (46) 07.06.92. Бюл. № 21 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Е. С. Морозова, В. В, Иванова, Я.— В. В. Флях и О. Б. Беккер (53) 577.18(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1509402, кл. С 12 N 9/38, 1987.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1120700, кл. С 12 N 9/38, 1983.

Авторское свидетельство СССР № 1362014, кл.. С 12 N 9/38. 1985. (54) ШТАММ ГРИБА P INlClLLIUM

CANESCENS — ПРОДУЦЕНТ -ГАЛАКТОЗИДАЗЦ (57) Использование: биотехнология. Сущ, ность изобретения: штамм F —.436 получен иэ

Изобретение относится к микробиологической промышленности в частности к производству ферментов, аименно к штамму- продуценту внеклеточной /3 — галактозидазы.

Фермент Р -галактозидаза, получаемый на основе микробиологического синтеза. находит применение в ряде отраслей пищевой промышленности для гидролиза лактозы, а также используется в медицине и фармакологической промышленности.

Известны применяемые в качестве продуцентов Р -галактозидаэы различные виды бактерий, актиномицетов, дрожжей и мицелиальных грибов. Последняя группа микроорганизмов наиболее перспективна для промышленного использования, по2 штамма Penlcllllum сапезсепз 20171 (ВКПМ

F-178) путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и отбора в селективных условиях. При глубинном культивировании на питательной среде, содержащей 3% свекловичного жома, 5 .áåëково-витаминного концентрата и 2,5 однозамещенного фосфорнокислого калия, через 120-144 ч роста при 30 С штамм

ВКПМ F — 436 накапливает в культуральной жидкости внеклеточную Р -галактозидазу, активность которой составляет:: 100-130 ед,/мп (гидрппиз ОНФГ при 30 С), 140 — 160 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 37 С), 62-68 ед./мл (гидролиз лактозы при 30ОС). От из- . вестных продуцентов той же тоаксономической группы штамм ВКПМ F 436 отличается рядом культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков. 2 табл. скольку продуцируемая грибами Р -галактозидаза проявляет свою активность при низких значениях рН среды, что соответствует условиям ее применения.

Известны также грибные продуценты

Paecilomyces varlotl. Sclегоtium sp.

Cortlcium rolfsll, Chaetomella .raphlgera, Ф

Alrarnarla ramnls, Culrularla Inaqualls. ие. ) п сколько видов аспергиллов: А. oryzae, А.

niger, А. foetldus. А. awamorl, а также ряд видов пенициллов: Penlcllllum terel, Р.

cltrinum, P. сапезсепз, P. multicolor.

Недостатком этих продуцентов р -галактозидазы является низкая активность штаммов.

Известен штамм Реп!сИЦов canescens

20171 (ВКПМ F — 178), выделенный иэ при1738854 общее происхождение, способность проду- цировать фермент при росте на средах.с доступным непищевым сырьем) является штамм Pentcllllum canescens 20171 (ВКПМ

F-178). Штамм F-178 при культивировании на средах со свекловичным жомом и БВК, с тыквенными или томатными выжимками и дрожжами образует соответственно 42 или

65-70 ед./мл Р -галактозидазы.

Недостатком известного штамма F-178 является низкий уровень активйости.

Цель изобретения — повышение уровня накопления Р -галактозидазы в культуральной жидкости.

Поставленная цель достигаеТся созданием штамма Penlcllllum canescens ДГ—

86/18. Новый штамм Penlcllllum canescens

ДГ-86/18 при росте на жидкой питательной среде, содержащей свекловичный жом и белково-витаминный концентрат, при 30 С в течение 120-144 ч накапливает в культуральной жидкости Р -галактозидазу с активностью 134 ед./мл при определении по гидролизу ОНФГ при 30 С, что составляет

160 ед./мл при определении тем же методом при 37 С.

Предлагаемый штамм Penlcllllum

canescens ДГ-86/18 получен в результате многоступенчатой селекции с Применением мутагенных факторов и отбора на средах с

2-дезоксиглюкоэой из природного изолята— штамм Penlcllllum canescens 20171 (ВКПМ

F-178). Штамм P. canescens ДГ-86/18 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института

ВНИИгенетика под номером ВКПМ F — 436.

От известных продуцентов штамм ДГ86/18 отличается высоким уровнем накопления Р -галактозидазы при росте на жидкой питательной среде с непищевым сырьем, а также рядом культурально-морфологических и физиолого-биохимических . признаков.

Культурально-морфологические признаки.

Сусло-агар(10 сут роста, 29 С). Диаметр колоний равен 7,5-7,8 см. Поверхность и край колоний ровные. Воздушный мицелий белый, вокруг центра плотно переплетенный, ближе к периферии колоний пушистый.

Конидиеобразование в центре колоний скудное и более обильное на периферйи колоний. Конидии серо-голубого цвета. Обрат5 ная сторона колоний темно-коричневая. Агаризованная среда Роулен-Тома с сахарозой и добавлением кукурузного экстракта(10 сут роста, 29 С). Диаметр колоний

6,2-6,5 см. Край колоний ровный, Воздушный мицелий в центре колоний пушистый, родной среды и способный в процессе роста на жидкой питательной среде с соевой мукой и минеральными солями продуцировать внеклеточную Р -галактозидазу в количестве 18-20 ед./мл культуральной 5 жидкости. Активность фермента определена путем гидропиаа О-нитрофенип- f Dгалактопираноэида (ОНФГ) при 30 С в течение 15 мин.

Известны способы увеличения продук- 10 тивности штамма 20171 при его культивировании на средах иного состава, в частности, предлагается среда, содержащая свекловичный жом и белково-витаминный концен- 15 трат (БВК), на которой продуктивность штамма 20171 за 96 ч роста достигает 42 ед./мл. Замена в среде свекловичного жома тыквенными или томатными выжимками позволяет увеличить активность штамма до 20

65-70 ед. /мл.

Недостатком штамма 20171 является низкий уровень его активности.

Известен продуцент Р -галактозидазы

Реп!с!1Иав гпцЫсо!ог KU-0 — 132 (FERM — 25

Р4375, АТСС 20539), образующий в условиях глубинной ферментации в течение 72 ч роста на питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов рисовые отруби и муку из семян хлопчатника, а также 30 минеральные соли, 140 ед./мл Р -галактозидазы (активность фермента определена путем гидролиэа ОНФГ при 37 С).

Штамм P. multicolor KU-0-132 среди известных грибных продуцентов обладает на- 35 иболее высокой активностью Р

-галактозидазы, однако она достигается при культивировании штамма на среде с мукой из семян хлопчатника, котОрая является трудно доступным сырьем, и проявляется 40 при более высокой температуре реакции оп-. ределения (37 С).

Известен также штамм P. canescens

ТК-85, представляющий собой мутант, пол-ученный под действием ультрафиолетовых .45 лучей из штамма 20171. Штамм ТК-85 характеризуется быстрым ростом на агаризованных средах и слабым замедленным конидиеобразованием. При культивировании на жидкой питател ьной среде с соевой 50 мукой и.-минеральными солями в течение.

72 ч активность внеклеточной Р-галактозидазы штамма ТК-85 составляет 60 ед,/мл культуральной жидкости (гидролиз ОНФГ при 30 С), ..., 5

Недостатком штамма P. canescens ТК85 является низкий уровень синтеза Р -галакт.озидазы, Наиболее близким к предлагаемому по совокупности признаков (вид продуцента, 1738854

5,0

5 далее стелющийся. Конидиеобразование умеренное, Конидии светло-серые с голубо-. ватым оттенком, по краю колоний голубые. 5

Образуются равномерно по всей.поверхности колоний. Обратная сторона колоний складчатая, темно коричневая.

Агаризованная среда Чапека с глюкозой и добавлением кукурузного экстракта 10 (10 сут роста, 29 С). Диаметр колоний равен

5,0-6,0 см. Воздушный мицелий пушистый; местами приподнимающийся. Край колоний.ровный. Конидиеобразование, кроме края, слабое. Конидии палевого оттенка, по 15 краю колоний голубые. Обратная сторона колоний слабо складчатая, темно-коричневая.

Агаризованная среда Роулен — Тома c сахарозой (10 сут роста, 29 С). Диаметр кола- 20 ний 4,0-4,5.см. Край колоний ровный.

Воздушный мицелий войлочный. Конидиеобразование скудное, Конидии кремового оттенка, по краю колоний голубые, Обрат ная сторона колоний слабо складчатая, 25 светло-желтого цвета.

- Агаризованная среда Чапека с глюкозой (10 сут роста, 29 С). Диаметр колоний равен.1,8 — 2,0 см. Край колоний неровный, лопастной. Поверхность колоний выпуклая, 30 гладкая. Воздушный мицелий белый, плотно переплетенный. Конидии темного сероголубого цвета, образуются в основном по краю колоний. Обратная сторона колоний не складчатая или имеет слабо намеченные крупные складки, не окрашена.

Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, растет при 25-37 С, оптимальная температура роста 29 С. Желатину разжижает слабо, молоко полностью не коагулирует вплоть до 30 сут инкубации. Нитраты восстанавливает полностью к 10 сут роста.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает моно-, ди- и полисахариды, в том числе глицерин и крахмал, При росте на глюкозе, фруктозе. сахарозе, мальтозе, Дà — 86/18 накапливает в культуральной жидкости j3 — галактозидазу, активность которой составляет 100-130 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 30 С) или 140-160 ед./мл (гидролиз ОНФГ при 37 С).

Наряду с Р -галактозидазой, штамм P.

canescens ДГ-86/18 при культивировании на указанной выше среде синтезирует ряд других внеклеточных гликозидаз с активностями, ед./мл:

Карбоксиметилцеллюлаза 32-35

Целлобиаза:: 5-9 а -Амилаза 2-3

Глюкоамилаза .: 0.7-1,2

Пример. Для получения исходного посевного материала культуру штамма ДГ86/18 и известного штамма 20171 выращивают на скошенной агаризованной среде

Роулен — Тома C добавлением 1% кукурузного экстракта W/V) при 28-30 С в течение

4-5 сут, после чего выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 сут.

Засев ферментационной .среды.осуществляют либо водной суспензией конидий, содержащей (2-5) х10 конидий/мл, либо кусочком культуры на скошенном агаре размером 1 см, Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 50 мл жидкой питательной среды следующего состава, мас.%:

Размельчен ный свекловичный жом 3,0

Белково-витаминный концентрат

Фосфорнокислый однозэмещенный калий 2,5

Водопроводная вода рН среды после стерилизации натуральный;

Питательную среду засевают одним из указанных выше способов и инкубируют при 30 С на круговой качалке, вращающей-. ся со скоростью 240-250 об/мин. маннозе, глицерине образует ярко-желтый или коричневый пигмент.

Отношение к источникам азота. Хорошо усваивает аммонийный азот, пептон, мочевину, кукурузный экстракт.

Генетические особенности (ауксотрофность) — прототроф. Штамм непатогенен, Сравнение культурально-морфологиче55 ских и физиолого-биохимических признаков нового штамма Реп!сИИиа canescens ДГ86/18 и известного шта чма Penlclllium

canescens 20171 приведено в табл. 1.

При культивировании на среде со свек-ловичным жомом, БВК и КН2Р04 в глубинных условиях через 120-144 ч роста штамм

Полученную культуральную жидкость для отделения мицелия и твердых остатков среды центрифугируют. Активность . j9-га- . лактозидазы определяют в супернатанте.

Оценку активности Р- галактозидазы осуществляют обычным методом, используя в качестве субстрата ОНФГ.

Реакционную смесь, содержащую 1,5 мг

ОНФГ в 4 мл 0,15 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,2, и 1 мл супернатанта в соответствующем разведении. инкубируют 15 мин при 30 или 37 С, после чего к 1 мл реакционной смеси добавляют 1 мл 1 М рас1738854

7 твора карбоната натрия и 1 мл дистиллированной воды.

Интенсивность окраски полученного раствора О-нитрофенола определяют при длине волны 420 нм.

За единицу активности P -галактоэидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата 1 мкмоль 0-нитрофенола s 1 мин при данных условиях реакции.

В табл. 2 приведены уровни активности

j3-галактоэидазы после 120 и 144 ч культивирования в равных условиях штаммов

Pentct! t turn сапезсепз ДГ-86/18 и 20171 при температуре реакции определения 30 С.

Средние активности Р -галактозидазы тех же культуральных жидкостей штаммов

ДГ-86/18 и 20171 в условиях определения при 30 С соответственно составляют 134,0 и 87,0 ед./мл, а при 37 С 160.0 и 98,0 ед./мл.

Указанные выше уровни активностей

Р-галактоэидаэы предлагаемого штамма

5 Penlctlllum canescens ДГ-86/18 (ВКПМ F436) и известного штамма Pentcllltum

canescens 20171 (В КПМ F-178) показывают, что штамм F-436.является более активным и более экономичным, поскольку он обеспе10 чивает в единичном процессе выход фермента на стадии культивирования в 1,5 раза выше, чем известный штамм F.— — 178, что, в свою очередь, определяет соответствующую экономию сырьевых, энергетических и

15 трудовых ресурсов в производстве, Формула изобретения

Штамм гриба Penlcilllum canescens

ВКПМ F-436 — продуцент Р-галактозидазы.

Таблица 1

Штамм Дà — 86/18

F — 436

Среда

Штамм 20171

F — 178

Диаметр колоний 18-20 мм; колонии выпуклые, гладкие; воздушный мицелий белый, плотно переплетенный; край колоний неровный; конидии темного серо-голубого цвета, расположены в основном по краю колоний; обратная сторона колоний гладкая или слабо складчатая, не окрашена

Хорошо усваивает моно-ди — и полисахариды, в том числе глицерин, крахмал; при росте на глицерине, фруктозе, сахарозе глюкозе, мальтозе, маннозе образует желтый или коричневый пигмент

Полностью не коагулирует вплоть до 30 сут роста

Обезжиренное молоко

Разжижает слабо

Разжижает слабо

Нитраты восстанавливает полностью к 10 с т оста

Среда Чапека с глюкозой, 10 сут роста

Среды с различными углеводами

Желатина, 20ф

Среда с нитратом натрия

Диаметр колоний 36-38 мм; воздушный мицелий в центре пушистый, далее стелющийся; край колоний ровный; конидиеобразование обильное; конидии серые, по краю колоний темно-голубые; обратная сторона колоний складчатая, не окрашена

Хорошо усваивает моно-ди — и полисахариды, в том числе глицерин, крахмал, при росте на глицерине, фруктоэе. сахарозе образует желтый пигмент

Коагулирует полностью к 12 сут роста

Нитраты восстанавливает полностью к 25 с оста

1738854

Таблица 2

Составитель E. Морозова

Техред М.Моргентал Корректор А. Осауленко

Редактор В. Петраш

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1978 1 ираж .. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытйям при ГКНТ СССР

113035; Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы Штамм гриба реniсilliuм canescens - продуцент @ - галактозидазы 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, частности к получению нового продуцента фермента β - галактозидазы

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения об-галактозидазы генноинжеиерньи путем

Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к биологическим средствам борьбы с вредоносными членистоногими и предназначено для использования в сельском хозяйстве для борьбы с зоофильными мухами на животноводческих фермах и других объектах

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению нового продуцента фермента а -галактозидазы

Изобретение относится к микробиологической промышленности, может быть использовано для производства биопрепарата триходермина против фитопатогенных грибов и представляет собой новый штамм для получения триходермина

Изобретение относится к биотехнологии, касается способов безотходной переработки вторичного растительного сырья спомощью микроорганизмов и может быть использовано на предприятиях консервной, СОКОВОЙ и винодельческой отраслей промышленности, а также на заводах по произ'- вЬдству пектина

Изобретение относится к биотехнологии и касается штаммов, рекомендуемых для производства пищевого~красного красителя - аналога шток розы

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к средам для культивирования вегетативных тканей (мицелия) грибов класса Basigllomycetes - продуцентов биомассы пищевого назначения, а также биологически активных веществ, например ферментов

Изобретение относится к биоте хнике и защите растений от болезней, в частности к способам получения инфекционного материала грибов с целью создания искусственного инфекционного фона при селекции хлопчатника на устойчивость к черной корневой гнили

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при получении инсектицидного препарата боверина, используемого для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и леса
Наверх