Способ очистки трипсина

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способам получения протеолитических ферментов из сырья животного происхождения, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, в медицинской и научно-лабораторной практике. Цель изобретения - повышение производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента. Для этого в качестве сорбента используют JL -аргинин-1,6-диаминогексан-сферон или Ј - аминокапроил-1,6-диаминогексан-сферон, а злюцию целевого продукта проводят раствором 1,3-1.5 М NaCI вЗО%-ном изопропиловом спирте. Сорбционная емкость носителей составляет 8- 12 мг/г сорбента, степень очистки фермента 10-18 раз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (l (} (51)5 С 12 N 9/76

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4692676/13 (22) 16.05,89 (46) 23.06.92. Бюл, N 23 (71) Институт биохимии им. А.В. Палладина (72) Л.Д. Таран. С.А. Кудинов, А,P, Шевченко и Л.M. Çïøòåéí (53) 577.15.07(088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1209229, кл. А 61 К 35/39, 1984.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1273392, кл. С 12 N 9/76, 1985. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРИПСИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения проИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения протеолитических ферментов из сырья животного происхождения, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, в медицинской и научно-лабораторной практике.

Среди известных методов очистки протеолитических ферментов наиболее прогрессивным является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, Известен способ очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых рыб на сорбенте 1,6-диаминогексан— полимер — бумага. Сорбцию в этом случае осуществляют в буферной смеси 0,05 — 0,07

М трис-НО, содержащей 0,05 — 0,1 M NaCI теолитических ферментов из сырья животного происхождения, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, в медицинской и научно-лабораторной практике. Цель изобретения — повышение производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента.

Для этого в качестве сорбента используют. L--аргинин-1,6-диаминогексан-сферон или ааминокапроил-1,6;диаминогексан-сферон, а элюцию целевого продукта проводят раствором 1,3 — 1,5 М NaCI в 30 -ном изопропиловом спирте. Сорбционная емкость носителей составляет 8 — 12 мгlг сорбента, степень очистки. фермента 10 — 18 раз. при рН 7,8 — 8,0, промывку проводят последовательно указанной смесью.и 0,03 — 0,05

M раствором глицина при рН 10,3 —. 10,6, а десорбцию 0,05 — 0,2 М раствором лизина при рН 10,4 — 10,6.

Выход трипсина по активности составляет всего 24 — 27% от исходной, а удельная активность увеличивается по сравнению с .исходной в 4 раза. Сорбционная емкость также довольно низкая и составляет 1,2 мг фермента на 1 r сорбента.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки трипсина на сорбенте 1,6-диаминогексан — целлюлоза. из экстракта пилорических: придатков лососевых рыб. Этот способ очистки включает следующие операции.

Экстракция 0,01 M фосфатным буфером рН 6,0 — 6,2, а затем аффинная хроматография на сорбенте 1,6-диаминогексан-целлюлоза путем сорбции в 0,01 М фосфатном буфере (рН 6,0 — 6,2) и десорбции целевого

1742329

20 спирте, Существенным отличием предлагаемо- 25 гексан-сферон и 1=аргинин-1,6-диаминогексан-сферон, Новые лиганды — аргинин, 30 наряду со "спейсером" — 1.6-диаминогексанам обеспечивают достижение нового ре- 35

50 продукта 307;-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,0 — 1,5 NaCL Выход по общей активности 84,5 — 90$, удельная активность повышается в 10 — 12 раз по сравнению с исходной.

Недостатком известного метода является низкая сорбционная емкость сорбента (1,0 мг/г), что отрицательно сказывается на производительности способа.

Целью изобретения является. повышение производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента.

Для достижения цели согласно способу очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых рыб путем хроматографии на биоспецифическом сорбенте—

1,6-диаминогексан-носитель с последующей элюцией целевого продукта в качестве сорбента используют аргинин-1,6-диаминогексан-сферон,или е -аминокапроновая-1,6диаминогексансферон. а элюцию целевого продукта проводят раствором 1,3 — 1,5 М хлорида натрия в 30 -ном изопропиловом го способа по сравнению с известными является использование новых сорбентов, E- аминокапроновая кислота - 1,6 - диаминоявляющийся специфическим субстратом трипсина, и E. -аминокапроновая кислота (аналог специфического субстрата лизина) зультата — десятикратное увеличение сорбционной емкости по сравнению с существующими аналогами при сохранении достаточно высокого увеличения удельной активности. Сорбционная емкость сорбента =аргинин-1,6-диаминогексан составляет 8 мг на 1 r сорбента, а сорбента — е -аминокапроновая кислота — 1,6-диаминогексансферон — 12 мгlг, При этом выход целевого продукта s обоих случаях составляет 100ф от сорбированного материала, а увеличение удельной активности по сравнению с исходной в 10 -12 раз в случае сорбента е -аминокапроновая, кислота

1,6-диаминогексан-сферон и в 16 — 17 раз в случае сорбента L-аргинин-1.6-диаминогексан-сферон.

П р и м е-р 1. Синтез сорбента L-аргинин-1,6-диаминогексан-сферон, 5 г сферона, промытого тщательно водой и отфильтрованного на стеклянном фильтре, смешивают с 17 мл гидразингидрата и нагревают нв водяной бане 1,5 ч, затем переноевт нв стеклянный фильтр и промывают 1,5 л воды, К хорошо промытому сорбенту приливают 150 мл 2 н. раствора соляной кислоты, охлаждают во льду до 3 С и приливают охлажденный до 3 С 120 мл

2 -ного раствора NaN02 (нитрита натрия).

Через 20 мин отмывают носитель 1 л холодной воды и переносят в охлажденный раствор 1,6-диаминогексана (9 r

1,6-диаминогексана в 50 мл воды). На следующий день осуществляют перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывают сорбент водой на стеклянном фильтре и помещают в 1%-ный .раствор трис-оксиметиламинометана на 2 ч при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке для забивки остаточных.аминных групп, Полученный сорбент промывают водой, спиртом и сушат на воздухе. 5 r L-аргинина-гидрохлорида. растворяют в 50 мл воды, концентрированной соляной кислотой рН доводят до значения 4,8 и добавляют к этому раствору 5 г сорбента.

К полученной смеси при постоянном перемешивании в течение 10 мин по каплям приливают спиртовый раствор дициклогексилкарбодиимида (С = 0,5 г! мл) в количестве

5 r и промывают последовательно: 100 мл спирта, 50 мл спирта + 50 мл воды, 250 мл спирта, 50 мл спирта + 50 чл воды, 50 мл

0,001 н, раствора соляной кислоты, 50 мл воды, 50 мл 0,1 н. ЙаНСОэ и 100 мл воды.

После промывки носитель суспендируют в

10 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,8).

Пример 2. Синтез сорбента е -аминокапроновая кислота-1,6-диаминогексансферон. г

5 г сферона промывают тщательно водой, отфильтровывают на стеклянном фильтре и смешивают с 17 мл гидразингидрата.

Нагревают на водяной бане 1,5 ч, затем переносятна стеклянный фильтр и промывают

1,5 л воды. К хорошо промытому сорбенту приливают 150 мл 2 н. раствора солянсй

5 кислоты, охлаждают во льду до 3 С и приливают 120 мл 2%-ного раствора нитрита натрия, охлажденного до 3 С. Через 20 мин отмывают носитель 1 л холодной воды и переносят в охлажденный раствор 1,6-диаминогексана (9 г 1,6-диаминогексана в 50 мл воды). На следующий день осуществляют перемешивание еще 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывают водой на стеклянном фильтре и помещают в 1%-ный

5 раствор трис-оксиметиламинометана на 2 ч при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке для забивки остаточных аминогрупп. Полученный сорбент промывают водой, спиртом. сушат на

1742329 рипсинподобная активность. Промывку коДесорбцию целевого продукта осуществляют 30 -ным изопропиловым спиртом, соля. Выход целевого продукта от сорбированного 100 . Удельная активность раз выше по сравнению с исходной активностью. В конечном продукте не обнаружена примесь химотрипсина. Определение эстеразной активности проводят по методу

Шверта и Такенаки.

30 кций, измеренных при длине волны 247 или

253 нм в момент начала реакции и в момент окончания реакции; 5 — время реакции, мин; а — количество белка в исследуемой пробе, мг.

Способ очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых рыб, левого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента, в качестве сорбента используют L-аргинин-1,6-диаминогексан-сферон воздухе, 5 г о -аминокапроновой кислоты хов лососевых; Эстеразная активность исрастворяют в 50 мл воды. Концентрирован- ходного препарата 123 ед/мг белка (субной соляной кислотой рН доводят до значе- страт БАЭЗ) — трипсинподобная активность ния 4,8 и добавляют к этому раствору 5 r и 315 ед/мг белка (субстрат БТМЗ) — химотсорбента. 5

Кполученнойсмесиприпостоянномпе- лонки осуществляют 0,05 М фосфатным ремешивании в течение 10 мин по каплям буфером (рН 7,8), содержащим 0,1 M NaCI. приливают спиртовый раствор дициклогексилкарбодиимида (С = 0,5 г/мл) в количестве

5 г и промывают последовательно: 100 мг 10 держащим 1,3 М NaCI. Сорбционная спирта, 50 мл спирта + 50 мл HzO, 250 мл емкость колонки составляет 12 мгlг носитеспирта, 50 мл спирта + 50 мл Н20, 50 мл

0,001 н. раствора соляной кислоты, 50 мл воды, 50 мл 0,1 н. ИаНСОз, 100 мл воды. (субстрат БАЭЗ) — 1438ед/мг белка, что в 12

После промывки носитель суспендируют в 15

10 мл 0,05 M фосфатного буфера (рН 7,8).

Пример 3, Получение экстракта.

Навеску лиофильно высушенных пилорических придатков лососевых гомогенизируютдважды на микроизмельчителетканей К 3 мл 0,0005 М субстрата (БАЭЭ или

PT-2 (или иной марки) со скоростью 5 тыс. БТМЭ) прибавляют 0,2 мл ферментного расоб/мин до получения однородной массы твора, содержащего от 20 до 50 мкг белка. при 4 С. К гомогенату прибавляют три объ- Измеряют экстинкцию поглощения на спекема охлажденной дистиллированной воды, трофотометре СФ-26 при длине волны 247 перемешивают и оставляют на холоде на нм(для БАЭЭ)или253нм(для БТМЭ) пробы ночь, послечего центрифугируютна центри- (инкубация 5 мин) против контроля (эта же фуге со скоростью 6000 об/мин при 2 С. смесь Т = 0 мин). Реакцию проводят при

Содержание белка определяют спектрофо- 25 С. тометрическим методом. Расчет удельной активности фермента

Пример 4. На колонку, заполненную проводят по формуле:

2 мл сорбента 1-аргинин-1,6-диаминогексан-сферон, уравновешенную 0,05 М фос- E фатным буфером (рН 7,8), наносят 200 мл 5 0001 ° а водного экстракта сублимированных пило- где Š— разница между значениями экстинрических придатков лососевых. Зстеразная 35 активность исходного препарата 20 ед/мг белка (субстрат БАЭЭ-бензоил-L-аргинилэтиловый эфир) — трипсинподобная активность 113 ед/мл белка (субстрат БТМЭ— бензоил-L-тирозин-метиловый эфир) — хи- Сопоставление известных способов мотрипсинподобная активность. Промывку очистки трипсина из экстракта пилоричеколонки осуществляют 0.05 М фосфатным ских придатков лососевых показывает пребуфером (рН 7,8), содержащим 0,1 М хлори- имущества предлагаемого способа, которые стого натрия. Десорбцию целевого продук- заключаются в значительном увеличении та осуществляют 30 -ным изопропиловым сорбционной емкости предлагаемых сорспиртом, содержащим 1,5 M NaCI. бентов: в случае сорбента L-аргинин-1,6-диСорбционная емкость колонки состав- аминогексан-сферон увеличение в 7 — 8 раз. ляет 8,2 мгlгсорбента, выход целевого продукта от сорбируемого 100, удельная Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я активность(субстрат БАЭЭ) -357 ед/мл, что в 17 раз выше по сравнению с исходной активностью. В конечном продукте не обна-. ружена примесь химотрипсина. - включающий хроматографию экстракта на

Пример 5. На колонку, заполненную носителе, содержащем 1,6-диаминогекса2 мл сорбента е -аминокапроновая кислота 55 новые группы с последующей элюцией це— 1,6-диаминогексан-сферон, уравновешенную 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8) наносят 30 мл водного экстракта протеолитического комплекса пилорических придат-

1742329

Составитель И.Ошарова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор А.Осауленко

Редактор И.Дербак

Заказ 2262 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 или о -аминокапроил-1,6-диаминогексансферон. а злюцию целевого продукта проводят раствором 1,3 — 1,5 M NaCI в 30 -ном изои ропиловом спирте.