Адъювант для вакцины против ящура

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Целью изобретения является снижение реактогенности адъюванта, снижение вязкости и повышение стабильности полученного на его основе вакционного препарата. Указанная цель достигается тем, что адъювант содержит в качестве эмульгатора аленилсукцинимид при следующем соотношении компонентов, мас.алкенилсукцинимид 3-5, кремнийорганический полимер 95-97. 5 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к масляным адъювантам, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве средств специфической профилактики ящура у различных видов сельскохозяйственных животных. При изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение в основном следующие адъюванты: минеральные сорбенты и сапонин для изготовления сорбированных вакцин и масляные адъюванты для эмульсионных. Исследования свидетельствуют о преимуществах и перспективе использования эмульсионных препаратов на основе масляных адъювантов. Изготовление эмульсионных препаратов является результатом смешивания для взаимно нерастворимых фаз: масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антигены (антиген) путем их энергичного перемешивания (эмульгирования). При смешивании масляных адъювантов и антигенов получаются эмульсии различного типа: воды в масле (обратная), масла в воде (прямая) или вода масло вода (множественная). Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широкое применение нашли эмульсии множественного и обратного типов. Известен масляный адъювант, создающий при смешивании с ящурным антигеном множественную эмульсию и содержащий оксиэтилированную олеиновую кислоту со степенью оксиэтилирования 3-10 моль окиси этилена на 1 моль кислоты, смесь моно- и диэфиров полиэтиленгликоля с молекулярной массой 250-350 и олеиновой кислоты и минеральное масло при следующем соотношении компонентов, мас. Оксиэтилированная олеи- новая кислота со степенью оксиэтилирования 3-10 моль окиси этилена на 1 моль кислоты 2-15 Смесь моно- и диэфиров полиэтиленгликоля с моле- кулярной массой 250-350 и олеиновой кислоты 2-15 Минеральное масло До 100
Недостатками препарата являются низкая иммуностимулирующая активность и нестабильность при хранении, а также непродолжительность сроков иммунитета вакцины на его основе. Для получения стабильных препаратов, способных создавать у животных продолжительный иммунитет, нашли применение масляные адъюванты, при смешивании которых с антигеном образуются обратные эмульсии типа воды в масле. Адъюванты такого рода известны, мас. 1. Минеральное масло
Байоль 85
Арлацел А (неполный
адъювант Фрейнда) 15
2. Минеральное масло 85
Безводный ланолин 15
3. Минеральное масло 84-89
Безводный ланолин 10,0-14,0
Холестерин 1,0-2,0
В качестве масляной основы обычно используют вазелиновое, парфюмерное, вакционное масло и масло для противоящурных биопрепаратов, изготовленное по ТУ 38-101884-84. Общими недостатками вышеуказанных адъювантов являются сильная реактогенность для крупного и мелкого рогатого скота и высокие показатели вязкости (свыше 2000 мм²/с) и температуры застывания (свыше 8^оС) иммунизирующих препаратов, полученных с их использованием. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату при использовании является адъювант, содержащий в качестве масляной основы кремнийорганический полимер и эмульгатор Спан-80 при следующем соотношении компонентов, мас. Кремнийорганический
полимер 85-95
Эмульгатор 5-15
Недостатки прототипа состоят в том, что: вязкость иммунизирующего препарата с адъювантом-прототипом хотя и существенно ниже, чем с адъювантом Фрейнда (180 против 22000 мм²/с), однако остается достаточно высокой. Кроме того, полученный на его основе эмульсионный препарат обладает недостаточной устойчивостью и относительно высокой реактогенностью. Целью изобретения является снижение реактогенности адъюванта, снижение вязкости и повышение стабильности полученного на его основе вакцинного препарата. Для этого адъювант, содержащий кремнийорганический полимер и эмульгатор, в качестве эмульгатора содержит алкенилсукцинимид при следующем соотношении компонентов, мас. Алкенилсукцинимид 3-5
Кремнийорганический
полимер 95-97
В качестве эмульгатора используют алкенилсукцинимид общей формулы
R- где R углеводородный радикал с молекулярной массой 1000. Он представляет собою густую темно-коричневую маслянистую жидкость с характерным запахом, хорошо растворимую в углеводородных маслах и вышеуказанном полимере, химически инертную и взрывобезопасную. Известно использование алкенилсукцинимида в качестве средства, обеспечивающего пожаробезопасность гидравлической жидкости. В качестве масляной основы используют кремнийорганический полимер общей формулы
R_aR_3-a-Si--O----O--O-SiR_a-Rʹ_3-a где R R' C₂H₅; m 0; n 2-5; a 0. Известно также использование указанного полимера в приборо- и станкостроении в качестве антифризных присадок к минеральным маслам и в легкой промышленности в качестве пластификатора. Сущность изобретения пояснена примерами его осуществления, что не ограничивает его объем. П р и м е р ы. Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта подготовили четыре смеси ингредиентов, две из которых показали оптимальные результаты (см. табл.1). Оптимальный состав предлагаемого адъюванта в результате изучения физических свойств полученных на его основе иммунизирующих эмульсий из вируса ящура А₂₂. Адъювант готовят следующим образом. Берут навеску алкенилсукцинимида, растворяют в кремнийорганическом полимере в оптимальных соотношениях. Полученный раствор стерилизуют известными методами: либо нагреванием в сушильном шкафу до 120-130^оС в течение 2 ч, либо путем стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок "СФ" EКS, VAM-150 и т.п. при комнатной температуре. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светло-коричневого цвета, допускается слабая опалесценция. Адъювант разливают в стерильные флаконы и хранят при комнатной температуре до момента использования. Эмульсии получают путем смешивания водной (антигена) и масляной (адъюванта) фаз в соотношении 1:1 в размельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин при 5000 об/мин. В качестве масляной основы при изготовлении адъюванта используют кремнийорганический полимер. В качестве водной фазы используют антиген вируса ящура А₂₂. Вязкость эмульсионных вакцин определяют с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-2 при 20^оС и выражают в мм²/с. Устойчивость эмульсионных препаратов определяют путем визуального наблюдения за расслоением 20 см³ образца эмульсии при 37^оС. Устойчивость характеризуют временем ее хранения до начала выделения водной фазы. Кроме того, определяют устойчивость эмульсии центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Оценку текучести препаратов при 1-8^оС проводят визуальным методом. Реактогенность адъювантов определяют количественным методом на белых мышах и качественным на свиньях и крупном рогатом скоте. Белым мышам массой 20±1 г в область подошвы одной из задних конечностей вводят образцы адъювантов в дозе 0,05 мл. На каждый образец используют не менее 10 мышей. Через 10 дн. животных забивают, обрезают лапки по скакательный сустав и взвешивают. Реактогенность определяют как процент прироста массы лапки в результате воспалительной реакции и определяют по формуле
Реактогенность 1100% где М_о сумма масс опытных лапок;
М_к сумма масс контрольных лапок. Реактогенность животных оценивают по наблюдениям за клиническим состоянием, температурой тела и по результатам патологоанатомического исследования через 10 дн. после введения вакцин, содержащих различные адъюванты, в дозе 6 мл на крупном рогатом скоте и через 18 дн. в дозе 1 мл на свиньях. Крупному рогатому скоту препараты вводят в область шеи подкожно, свиньям внутримышечно в шею в область уха. Адъювантную активность оценивают в опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных качественным и количественным методами. Эффективность предлагаемого адъюванта в сравнении с прототипом и аналогами проверена в ряде опытов в составе эмульсионной противоящурной вакцины А₂₂. Сведения о выборе оптимального состава предлагаемого адъюванта путем оптимизации важных физических (вязкость, устойчивость, текучесть) свойств полученной на его основе иммунизирующей эмульсии приведены в табл.1. Из табл. 1 следует, что оптимальный состав предлагаемого адъюванта следующий, мас. Алкенилсукцинимид 3-5
Кремнийорганический
полимер (образцы 2 и 3) 95-97
В этом случае устойчивость эмульсий сохраняется в течение 5-6 мес. Устойчивость эмульсий, содержащей адъювант прототип 3 мес. Вязкость эмульсии на основе предлагаемого адъюванта при 20^оС в 1,7-1,8 меньше вязкости эмульсии, на основе адъюванта прототипа (образец 7) и более, чем в 200 раз меньше по сравнению с эмульсией на основе неполного адъюванта Фрейнда (образец 6). Кроме того, эмульсионные препараты на основе предлагаемого адъюванта сохраняют в отличие от эмульсий на основе адъювантов-аналогов текучесть при 1-8^оС. Содержание алкенилсукцинимида в растворе кремнийорганического полимера менее 3% и более 5% приводит к снижению устойчивости эмульсионного препарата (образцы 1 и 4). Отмечена устойчивость эмульсионной вакцины с предлагаемым адъювантом к центрифугированию. В табл. 2 и 3 приведены результаты оценки реактогенности предлагаемого адъюванта и эмульсионной вакцины на его основе в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Как видно из данных табл.2 и 3, предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают значительно меньшей реактогенностью, чем известные. Из опытов на мышах (см. табл.2) следует, что реактогенность предлагаемого адъюванта в 1,3 раза ниже, чем у адъюванта прототипа, и в 1,8 раза ниже реактогенности неполного адъюванта Фрейнда. Данные табл.3 свидетельствуют о том, что вакцина с предлагаемым адъювантом вызывает на месте введения у крупного рогатого скота и свиней значительно меньшую воспалительную реакцию, чем вакцины с известными адъювантами. Кроме того, оно не вызывает образования абсцессов, повышения температуры тела и изменения клинического состояния животных. Таким образом, можно сделать заключение о возможности применения предлагаемого адъюванта в составе вакцин для крупного рогатого скота и свиней. Иммуногенную активность противоящурных эмульсионных вакцин из вируса А₂₂ оценивали в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных путем установления 50%-ной иммунизирующей дозы (ИмД₅₀) на взрослых белых мышах (21 день после прививки) и качественным методом на свиньях массой 30-35 кг через 10 дней после иммунизации. Результаты опытов представлены в табл.4 и 5. Данные табл.4 и 5 свидетельствуют о высокой иммуностимулирующей активности предлагаемого адъюванта, так как значение ИмД₅₀ вакцины на его основе в опыте на мышах несколько ниже, чем у вакцин с известными адъювантами, а в опытах на свиньях получена полная защита животных после иммунизации препаратом с предлагаемым адъювантом. Предлагаемый масляный адъювант обладает рядом преимуществ по сравнению с прототипом:
использование смеси кремнийорганического полимера и алкелинсукцинимида в качестве адъюванта позволяет получать стабильные эмульсии типа воды в масле;
предлагаемый адъювант обеспечивает получение низковязких эмульсионных препаратов (до 120 мм²/с), что значительно снижает трудоемкость при использовании;
предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают низкой реактогенностью для лабораторных и сельскохозяйственных животных. Экономический эффект от использования предлагаемого адъюванта будет прежде всего складываться:
их уменьшения потерь мяса ввиду незначительных изменений на месте введения препаратов, изготовленных с его использованием;
из повышения производительности труда при проведении массовой вакцинации за счет уменьшения вязкости вакцины;
из уменьшения потерь вакцины в связи с ее высокой стабильностью и низкой вязкостью.

Формула изобретения

АДЪЮВАНТ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА, содержащий кремнийорганический полимер и эмульгатор, отличающийся тем, что, с целью снижения его реактогенности, а также снижения вязкости и повышения стабильности в качестве эмульгатора алкенилсукцинимид при следующем соотношении компонентов, мас. Алкенилсукцинимид 3 5
Кремнийорганический полимер 95 97

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3