Рекомбинантная плазмидная днк @ frblv @ f6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент слитого белка оболочки бактериофага @ и белок оболочки @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота
Изобретение относится к микробиологической промьнвлеми0Ји. и белковой инженерии, 6«e ejroe H0f«w. Целью изобретения являете получение слитного белка оболочки fr и бегишфц 51 вируса лейкоза крупнот рогатого евета и создание штамма Es-herteW евМ иеерцега «лазмиду pFRBLVsF6, иодирукш синтез указанного белка. Изобретение т себя конструирование йлазммди i FR BLVsF6, заключающееся 09 в велении фрагмента Sgll-Eco 781 ДНК пяазмиды Д HU1 в плазмиду pFR 20. У никаяьн ееайты рестрикции: BspMII, pStl, Scat. Hpal, MStlt, Sac). Aval. Продуктивность штамму 5% целевого про-, j дукта от общего кяетом«вп5§еякэ, Плазмида вводится трансформацией 8 клети E.colf к 802 с последующим отбором штамма-продуцента рекомбинантногв белка i.coli ВКПМ В-4983. 3 с.п.ф-лы, t тйВя. сл с ё
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР Ф ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ . 1, (21) 4728855/13 (22) 10.08.89 (46) 30.06.92. Б»рлЛФ 24 (71) Институт органического синтеза А Н Лате.СССР (8Щ. Отдел медицины (Щаритф Университета Гум6ольдта (Берлин) ЦМф . P2) Р@Фйф. YJtbpofx, Хельга Сйаккет, Вфа»6 лил ГЬатцер, Зинаида Розенталь; Хаме4щ- . фред. Розенталь (ОО), Т.M.Кезаевекае, И.S.Сеюаеиская. Д.З.Дрвйлина, 1О.A.Оарае, A.ÌËóINï». »»Л 1.Пумпен и Э,Я.Грен (3Щ . (53) 575.И4.2. 577.2 (56) Netlngh АЯ.. and Кеп S,S.H. IrI обмайееа Ииг1гиа мвеагсЬ, 1988, v 34, р. 65. Козловская ТМ. и др. Докл. AH СССР, 1986, 287. стр. 452. NyaIIafura Е. е а! Fola biotogici 1985, v 31 с. 116. (54) г»ЕКОМЬИНАНТНАЯ ПЛАЭМИДИАЯ ДНК pFRBLVsF6, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК ОБОЛОЧКИ БАКТЕРИОФАГА FR И SE JI0K ОБОЛОЧКИ 6 Р51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТ, СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ SAKТЕРИИ ESCHERICHIA C0LI-ПРОДУЦЕНТ ъ . Изобретение относится к микробиологической промышленности генной и белковой инженерии, биотехнологии. Цель изобретения — получение полипептида с активностью белка оболочки бактериофага fr и белка оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Сконструирован рекомбинантный ген fr. СР-В:Ч 51 Sh, кодирующий синтез соответствующего белка и плазмиды pFPB YsF6 для его экспрессии, а также штамма-проду-. цента, Е.соИ (pFRB LVsF6)... Ж, 1 7441 10A1 СЛИТОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ БАКТЕРИОФАГА FR И БЕЛОК ОБОЛОЧКИ 6 Р51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУГ НОГО РОГАТОГО СКОТА (57} Изобретение относится к микробиологической промывленмдатз», авнмвй и белковой инженерии, 6арйипвад@Фев. Целью изобретения являете ййа»унеймЕ ®литного белка оболочки Ь и 6аааа цу 51 аируса лейкеза крупного por37@r@ @Вмм 3Ô @@здание штамма Е з-ЬегМЫа@а@. йеВуфй и йаазмиду pFRBLVsF6, кодируащр9 еинт@э указанного белка. ИзобрвтЕниВ ажФйчаем В@е6в конструированме»тлаЗзамдм pHt8LVsF6, заключающееся ве веждами фрагмента ВЯИ-.Есо 781.ДИК щйк@йцр4 л..тЩ1 в плазмиду pFR 20. УникааьнмЕ4Эйтыраатрикции: вврМ11, рай, Seal. НраК М34И, Зэс1, Aval. Продуктивность юиамй4 Вф цеавеого щадукта от общего клеевом© 6 6елка. йлазмида ввбдв4тся трансфщижацм6@ В южтй E.ñoll K 802 с последующим етбцам щтамма-продуцента рекомбинаитнаа белка ф.сей ВКПМ 8 4983. 3 с.п.ф-лы, 1 табл. Рекомбинантная плазмида рЕЯВ ЧЗР6 состоит из следующих элементов: ДНК плазмиды pFP20, которая несет полный ген БО fr и имеет делецию в гене тетра ци клин — устойчивости, В@И вЂ” Есо781 фрагмента ДНК А HV1, кодирующего участок посйедовательности др51 (9 аминокислот), соответствующий 5664 аминокислотам зрелого gp51 и содержащего иммунологический эпитоп-сайт узнавания моноклональных антител mAK14. В состав ДНК рекомбинантной плазмиды рЕРВЕЧЗР6 входят гены: 1744110 20 40 50 ген fr СР-BVL51sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка; ген b4, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Ген fr СР-81 Ч51 sh находится под контролем промотора Perp. Плазмида pFRBLVsF6 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, нвконьюгативна. Сущность способа конструирования плаэмиды pFRBLVsF6 состоит в том, что фрагмент гена gp51 вируса лейкоза, соответствующий нейтрализующему эпитопу с прилежащими аминокислотами (аминокислоты 65-103), выщепляется из плазмиды рРЯВЫзР6„содержащей 56-103 аминокислоты gp51, с сохранением 56-64 аминокислот g р51, соответствующих сайту узнавания моноклональных антител mAK14, и образованием рекомбинантного гена СР-8 51. Штамм-продуцент fr СР— BLV51 sh получают трансформацией клеток Е=соИ К802 рекомбинантной nnaçìèäíoé ДНК pFR B Ls F6. Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, граммотрицательные. Кул ьтурал ьн ые и риз на хи. Клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины. Физико-биохимические признаки, Оптимальная температура культивирования 37 С,опгимумрН 7,0 — 7,4. В качестве источника углерода," используют углеводы, в качестве источника азота — минеральные соли, а также органические соединения в виде пептона",триптона, аминокислот. Устойчивость к антибиотикам, Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды, Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину. Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ 8-4983. Пример 1, Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVs — F6, 20 мкг ДНК плаэмиды, содержащей BgfflBamH1 фрагмент ор51 и выделенной стандартным методом. расщепляют 50 ед, рестриктазы Bg6I и 50 ед, рестриктазы 8amH1 в 100 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-HCf, рН 7,5; 50 мМ КаС и 10 мМ MgCfz, в течение 2 ч при 37 С. Рестриктаэы инактивируют 15 мин прогреванием при 65 С, После очистки ДНК 8gtlI-8amH1 фрагмента на агарозном геле известным методом ДНК растворяют в 20 мкл Н О, Заполнение концов проводят в 100 мкл раствора Ь, содержащего 50 мМ трис НС, рН 7,5; 10 mM MgCfz, 10 мМ дитиотрейтол, 25 М NaCf, 100 мМ. dATP, dCTP, dTTP u dGTP и 10 ед. ДНК-полимеразы E,coll (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12 С, После переосаждения этанолом ДНК растворяют в 10 мкл HzO (ДН К 1), 2 мкг плаэмиды pFP20 расщепляют 3 ед.рестриктазы EcoRV в 25 мкл раствора В, содержащего 10 мМ т рис-H CI, рН 7,5; 50 мМ NaCl и 10 M МоС!г, в течение 1 ч при 37 С, наносят инкубационную смесь на 1,5 -ный агарозный гель, фрагмент, соответствующий линеаризованной плазмиде pFP20, выделяют из агарозного геля (ДНК.2). 0,1 мкгДНК 1 и 0,1 мкгДНК 2 зашивают Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCI2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 Ы АТР и 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4 С, Фрагмент инактивируют нагреванием при 65ОС в течение 15 мин, К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.coll RR1, обработанных 100 мМ CaCI2 (конечная концентрация — 5 х 10 клеток/мл), для трансформации клеток. Отбор клонов осуществляют путем экспресс — выделения ДНК и ее рестрикционного анализа, а также секвенирования. Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование pFPBLV-F6, Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рЕРВЮзР6, 2 мкг плазмиды pFPBLV-F6, выделенной стандартным методом, расщепляют 3. ед, растриктазы Есо781 и 3 ед. рестриктазы Ssp1 в 25 мкл раствора А, содержащего 100 мМ трис-HCI, рН 7,5; 50 мМ йаО и 10 мМ MgCI, в течение 1 ч при 37 С. Рестриктазы инактивируют 15 мин. прогреванием при 65ОС.. Заполнение липких концов проводят в 200 мкл раствора Б, содержащего 50 М трис-HCI, pH 7,5; 10 мМ МцС12, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ NaCI, 100 мМ dATP, dCTP, dTTP u dGTP и 5 ед, ДНК-полимеразы Е.coll (фрагмент Кленова) в течение 1 ч при 12 С; После очистки на агароэном. геле ДН К растворяют в 20 мкл Н20 (ДН К 3) 0 05 мкг ДНК 3 зашивают в >4 ДНК-лигазой в 20 мкл раствора Г, содержащего.. 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 10 мМ MgCIz, 10 мМ дитиотрейтол, 50 MM ATP и 10 ед, Т4 ДНКлигазы, в течение 12 ч при 4 С. Фермент инактивируют нагреванием при 65 С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток E.coll RR1, обработанных 100 мМ СаС12 (конечная концентрация— 5 х 10О клеток/мл), для трансформации клеток, Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной экспресс-методом, и секвени1744110 рования. Плазмида с ожидаемой нуклеотид.ной последовательностью получает наименование pFP BLVsF6. Штамм-продуцент Е,coll К802 (pFPBLVsF6), Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е.coll К802 рекомбинантной плазмидой pFP BLVsF6. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казами-. новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0,02 до оптической плотности ОПТ 4-5. Определение gp51- и fr активности методом иммуноблотинга. Для имщуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный . гель по Лэммли, содержащего 2%-ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный Р-меркаг тоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2 — 4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидной, градиентный гель (12-18%) размером 150 х 150 х 0,75 мм. Злектрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 m А. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу HANIP. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-gp51 антителами mAK14 в разведений 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 7,5; 0,15 M NaCI; 0,1% тритон Х вЂ” 100; 1% БСА, в течение 15 ч.при 20 C: После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 200С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:500. Фильтры отмывают буфером TBS (3-5 раз) и проявляют диаминобензидином. В параллельной постановке фильтры инкубируют с анти-frCP антителами кролика в разведении I:200 на буфере TBS втечение 15 ч при 20 С. После двукратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 200С с конъюгатом пероксидаэы с белком А S.aureus. Лизаты клеток штамма — продуцента обнаруживают в обоих случаях специфические зоны окраски, соответствующие белку с молекулярной массой 14,7 КД (или длиной 140 аминокислот), что соответствует ожидаемо-. му по схеме конструирования. Определение титра fr CP-BLV51shweтодом РИД. Титр определяют с помощью радиаль-. ной иммунодиффузии по Ухтерлони. Для этого готовят двукратные серийные разве10 55 рЕРВЫзР6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага fr и блок оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 5297 п.о. и мол.м. 3,39 моль,.содержащая плазмидную ДНК pFP20 размером 5268 п.о. и мол.м. 3,38 моль: В91Н-Ecо781— фрагмент ДНК il НHVИ1, размером 29 п.о. и мол.м. 0,01 моль, кодирующий аминокислотную последовательность белка gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота с 56 по 64-ю аминокислоту; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: ВЯрМП (Π— начало координат), PSt1 (1947), Sca 1 (2182)- Нра1 (3640), MSt Н (3885). Sacl (4451), AVal (4672); гены, генетические маркеры; регуляторные участки: ген fr CPBLVgp51 Sh, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка fr CP-BLVgp51 Sh; ген bla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; промотор триптофанового oneрона — Ptrp из Е.coll, под контролем которого находится ген fr CP-BLVgp51 Sh неконъютатив на. . 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pFPBLVsF6, кодирующий слитый белок оболочки бактериофига fr — и белок оболочки ор51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, заключающийся втом,что Bgfll — ВатН1фрагмент Д Н К A. HV1 обрабатывают ДН К— полимеразой Е.coll. и встраивают в ДНК плазмиды pFP20 по сайту для эндонуклеазы рестрикции ЕсоР. отбирают клоны, содержащие плазмиду pFPBLV-F6, из которой выщепляют участок ДНК, находящийся между сайтами для рестриктаз Есо781 и SSp11. обрабатывают ДН К-полимеразой Е.соИ и отбирают клоны, содержащие плазмиду рЕРВ ЫlзЕ6 и синтезирующие белок fr CP=BLVgp51 Sh. 3. Штамм бактерий Е.coll ВКПМ В-4983продуцент рекомбинантного слитного белка оболочки бактериофага fr и белок оболочки gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. дения клеточного лизата и титруют против анти-fr CP антител кролика. В качестве стандарта используют очищенный frCP, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл). Результаты титрования frCP— ВО/51зп активности методом РИД приведены. в таблице. Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК Титр в РИД Белок., мг!мл БО fr, мг/мл ОПТ Штамм 4,0 1:156 20,0 1.0 5,0 Составитель С.Бандрин Редактор М,Недолуженко Техред М,Моргентал Корректор M.Ïîæî Заказ 2169, Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР . 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 E.соИ К802 FPB LVsF6 1744110 с Вывод прокта, 
