Перхлорат 1-(2-гидроксиэтил)-2,6-ди-(п-нитрофенил)-4- фенилпиридиния в качестве красителя колоний шигелл зонне

 

Использование: в качестве красителя колоний шигелл Зон не. Сущность изобретения: продукт формулы С25Н2оОдМзС1; С 54,89; Н 3,77; N 7,75; CI 6.54; выход 76,9%; т.пл. 305-306°С (с разл.). Колонии шигелл Зонне на мясо-пептонном агаре с красителем окрашиваются в же.лтый цвет. 5 табл. V Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

NO2

СНг

СН20Н

С1О„

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4747527/05 (22) 11.10.89 (46) 07.07.92. Бюл. N. 25 (71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены . (72) Л;Н.Чернавская, А.П.Шепелев и

А.В;Коблик . (53) 547.632.2 (088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим .методам исследования.

/Под ред. М.О.Биргера.— М.: Медицина, 1967, с. 219.

Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. /Под ред..К;И.Матвеева.— М.: Медицина, 1973, с, 161.

Dlmroft К. и an.— Justus Llebigs Clnn.

Chem., 1963, 661, 1.

Lombard R. et cet.— Bull. soc. chem.

France, 1960, р. 1528.

Изобретение относится к 1-оксиэтильным производным 2,6-ди-(n-нитрофенил)замещенных солей триарилпиридиния, а именно перхлорату 1-(2-гидроксиэтил)-2;6ди-(n-нитрофенил)-4-фенилпиридиния фор. мулы

„„5U„„1745725 А1 (я>s С 07 D 487/04, С 09 В 9/00//С 12

N 1/02

2 (54) ПЕРХЛОРАТ 1-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)2,6-ДИ.-(n-НИТРОФ ЕН ИЛ)-4-ФЕНИЛПИРИДИНИЯ В КАЧЕСТВЕ КРАСИТЕЛЯ КОЛОНИЙ ШИГЕЛЛ ЗОННЕ (57} Использование: в качестве красителя колоний шигелл Зонне. Сущность изобрете-, н ия; продукт формулы Сг5Нго09йзС1; С

54.89: H 3,77: N 7,75; С! 6,54; выход 76,90,; т.пл. 305 — 306 С (с разл.). Колонии шигелл

Зонне на мясо-пептонном агаре с красите лем окрашиваются в желтый цвет. 5 табл, ° впй . обладающему способностью окрашивать колонии дизентерийных микроорганизмов, а именно шигелл Зонне, и может быть использовано в диагностике дизентерии для . (Л дифференциации шигелл Зонне и Флексне- . 4 ра.

Известны красители: метиленовый си- (Я ний, зозин, конго красный, бромкрезоловый пурпурный.

Однако на средах с этими красителями все патогенные микробы семейства кишечавЪ ных(куда входят и Я;sonnei и $.flexnerl) растут в виде прозрачных бесцветных колоний. т.е. дифференцировать оба вида шигелл (S.sonnei и $ flexneri) с помощью этих красителей нельзя.

1745725

10 (Il) р „ ио, рЬЛ! Арь (!!!)

СН2СН20Н

6,57

Ояко

20

30

40

+H N-CH СН вЂ” ОН вЂ”

2 2 2

Ph

0 Н сн м02

2 . 1 2

СН20Н !

55 питательную среду

Реакция на образование индола также не является дифференцирующим тестом для S.sonnei и S,flexneri, так как $.flexneri индол не образует.

Наиболее близкими по строению к предлагаемому являются соединения форМУЛЫ Р1„

Однако известные соединения не окрашивают колонии шигелл Зонне.

В ряду I-оксиэтильных 2,6-ди(п-нитрофенил)замещенных солей триарилпирилия не известны соединения, проявляющие способность окрашивать колонии шигелл Зоннее.

Целью изобретения является получение нового соединения, обладающего новым для этого ряда свойством окрашивать в желтый цвет колонии, микроорганизмов шигелл Зонне при их выращивании на среде несложного состава {мясо-пептонном агаре) и не окрашивать шигеллы Флекснера, от которых их необходимо дифференцировать.

Эта цель достигается новой химической структурой, описываемой формулой (i).

Способ получения заключается в кипячении перхлората 2,б-ди-(n-нитрофенил)-4фенилпирилия (IV) с моноэтаноламином (V) в спирте:

0211 1чО, Ч с!о

Пример 1, Получение перхлората

1-(2-гидроксиэтил)-2,б-ди-(n-нитрофенил) пиридиния.

Смесь 2,5 г (0,005 Monb) перхлората 2,6ди-(п-нитрофенил)-4-фенилпирилия и 0,3 мл (0,005 моль) моноэтаноламина в 20 мл спирта кипятят в течение 1 ч. Выпавший осадок очищают переосаждением из ацетона эфиром. Выход 2,7 r (76,9%). Продукт представляет собой кристаллы песочного цвета, т.пл, 305-306 С (с разл.).

Найдено, %: С 54,89; Н 3,77; N 7,75; CI

6,54.

С25Н2009йзС!

Вычислено, %. С 55,3; Н 3,72; N 7.38: С!

ИК-спектр, см, 1620 (катион пиридиния); 1580 (ароматические кольца); 1080 (C I Q4 ); 3490 (О Н).

ИК-спектр снят на приборе Specord

1R-75 в суспензии вазелинового масла, призма — MaCI.

Исследование красящей способности проводят на среде следующего состава; мясо-пептонный агар (МПА) 0,54 — 0,53 г; дистиллированная вода 16.0-16.5 мл;.соединение (!) 4800 мкг. .Пример 2. Приготовление питательной среды..К 16,0 мл растопленного и осту-. женного до 56 С мясо-пептонного агара добавляк>т 4800 — 4850 мкг соединения (I) из расчета 300 MKI на 1 мл среды. Агар выливают в чашку Петри и после застывания среды ее подсушивают в термостате и используют для лосева.

Красящую способную исследуемого соединения определяют по отношению к следующим микроорганизмам: Shigelia sonnei

2517 (музейный штамм),. 1762, 6497, 7230, 2287, 6762, 1222, 1848, 1328, 4617, 2625, 5445, 5147, 5406, 111, 5420, 2316,(Выделенные от больных), Shigeila flexneri 170 2а (музейный штамм), 4999, 4899, 5553. 1756, 4559, 4873, 2548, 1220, 1963, 5553 (выделенные от больных).

Все культуры обладают характерными видоспецифическими свойствами. Культуры микробов выращивают на мясо-пептонном скошенном агаре в течение 18 ч, эмульгируют в изотоническом растворе хлорида натрия и доводят концентрацию до 5000 микр. тел (м.т.) в 1 мл по оптическому стандарту мутности. На поверхности питательной среды наносят пипеткой 0,1 мл микробной взвеси (500 м.т,) и растирают стеклянным шпателем. Результаты опытов учитывают через 16 — 18 ч роста посевов культур в термостате при 37 С.

Пример 3. Определение оптимальной дозы соединения (!) для внесения в плотную

В растопленный и остуженный до 56 С

МПА вносят соединение (!) из расчета 200, 300, 400 и 500 мкг на 1 мл среды. Агар-агар разливают в чашки Петри, подсушивают и вносят по 0,1 мл взвеси бактерий (500 м.т.) 1.745725 и растирают шпателем по поверхности среды. Чашки с посевами инкубируют 1820 ч при 37 С и затем учитывают рост культур.

Рост Shigella sonnei 2517 на плотной питательной среде (МПА) в зависимости от дозы соединения (!) приведен в табл, 1.

Как видно из табл. 1, оптимальной дозой соединения (1) является доза, равная

300 мкг на 1 мл среды. Диаметр колоний шигелл Зонне такой же, как и в контроле. цвет колоний желтый.

Пример 4, Определение избирательных свойств соединения для шигелл Зонне. . Для определения степени избирательности соединения (I) используют плотную питательную среду с соединением. (1) (300 мкгlмл), которую засевают штаммами шигелл — как музейными, так и . свежевыделенными Shlgella sonnei 2517 (музейный штамм), 7230, 1222, 1848, 6497, Sh!geIla Иехпег! 1702а (музейный штамм), 6969, 4843, 1220, 2548; Густота взвеси по оптическому стандарту мутности составляет 5000 м.т. в 1 мл. Мерной пипеткой по

0,1 мл (500 м.т.) суспензии бактерий вносят на поверхность агара и растирают стеклянным шпателем. Контролем служат чашки с

МПА без соединения (1). Чашки ставят:в термостат на 20-48 и 72 ч при 37 С. По истечении срока инкубации просматривают посевы и учитывают характер роста колоний (табл. 2). Как видно из табл. 2, колонии шигелл

Зонне на МПА с соединением (1) окрашиваются в желтый цвет, а колонии шигел Флекснера — бесцветные. С увеличением срока наблюдения цвет колоний шигелл Зонне усиливается и переходит в ярко-желтый, колонии шигелл Флекснера остаются,бесцветные.

П р и.м е р 5. Определение воспроизводимости (точности) способа отбора колоний шигелл Зонне.

Для определения воспроизводимости (точности) способа отбора колоний шигелл Зонне íà МПА с соединением (!) (300 мкг/мл) используют культуры шигелл

Зонне и Флекснера, выделенные от больных дизентерией. Готовят суспензию бактерий на изотоническом растворе хлористого

02N

Сн ИО !

СН2ОН Е>О, 50 в качестве красителя колоний шигелл 3онне.

Таблица 1 натрия, составляющую 5000 м,т. в 1 мл и. затем мерной пипеткой по 0,1 мл наносят на . опытные и контрольные (MllA без соединения 1) питательные среды. Учет результатов

5 посевов представлен в табл. 3 и 4.

Как видно из табл. 3 и 4, колонии шигелл

Зонне на среде с соединением (1) дают окрашенные колонии, а колонии шигелл Флекснера — бесцветные, 10 Пример 6, Изучение идентичности культур шигелл Зонне и Флекснера, выросших на среде с соединением (I) и без него.

Изучают морфологические (окраска

15 мазков по Граму), культуральные (характер роста колоний на поверхности среды), биохимические (способность ферментировать сахары и спирты в "пестром ряду", а также агглютинабельность (реакция агглютинации

20 со специфическими сыворотками) свойства (табл. 5), Таким образом, предлагаемое в качестве красителя соединение (1) не изменяет свойств шигелл, характерных для данного:

25 вида. четко окрашивает изолированные колонии шигелл Зонне в желтый, цвет, не окрашивая при этом изолированные колонии близкородственных шигелл Флекснера, что позволяет испольеовать этот краситель для

30 дифференциации шигелл Зонне и Флекснера уже на 2-е сутки хода бактериологического исследования. Предлагаемый краситель" проявляет свои свойства в обычной питательной среде — МПА; которая по своему

35 составу является несложной и широко распространенной питательной средой; Время роста колонии обычное (18-20 ч).

Формула изобретения

Перхлорат 1-(2-гидроксиэтил)-2,6-ди-(n40 нитрофенил)-4-фенилпиридиния формулы

1745725

Таблица

-желтые; ж — желтые; я/ж — ярко-желтые; б/ц — бесцветные.

Таблица

Таблица

Та бл

К вЂ” ферментация до кислоты; "-" — отсутствие ферментации; ф — положительная реакция агглютинации.

У

Составитель Т.Калинина

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор H.Êoðoëü

Редактор И.Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2363 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5