Способ получения гибридного полипептида, содержащего нв @ а @

 

Использование: генетическая инженерия , получение бифункциональных антигенов , клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие HBsAg, получают в результате культивирования штаммов Saccharomyces cerevislae 1044C или ДС5, трансформированных плазмидами pRIT 12573 или pRIT 12574, выделяют и очищают целевой продукт . 7 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/51, 15/30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ф

М (21) 4355055/13 (22) 26.01.88 (31) 009.325 (32) 30,01,87 (33) US (46) 07.07.92. Бюл. М 25 (71) Смит Клайн-Рит (BE) (72) Тереза Кабезон (С1 ), Мишель Де Вильд (BE) и Нигель Харфорд (NZ) (53) 575.224.2 (088.8) (56) Nature, 298. 347-350, 1982.

ЕР N. 0201416, кл. А 61 К 39/29, 12.11.86.

ScIence. 1984, 225, 593-599, Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению бифун- . кциональных антигенов, клонированию генов, которые кодируют зти антигены в дрожжах.

Известен способ приготовления гибридного полипептида HBsAg-Herpes симплекс I вирус гликопротеин Д (HSV-Ig0) при экспрессии последовательности, кодирующей гибрид Н$Ч-190 Pre S2-S белок, в дрожжах.

Наиболее близким к изобретению является способ получения гибридного полипептида, содержащего Н 8sAg. заключающийся в том, что осуществляют конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей слитый полипептид; трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces, cerevlsiae, выделение и очистку целевого продукта.

Способ заключается в том. что 64 кодона ДНК последовательности, кодирующей повтсряющийся эпитоп циркумсиорозоит,!Ж„„1746887 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО

ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО HBsAg (57) Использование: генетическая инженерия, получение бифункциональных антигенов, клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие HBsAg, получают в результате культивирования штаммов Saccharomyces

cerevislae 1044С или ДС5, трансформированных плазмидами pRIT 12573 или pRIT

12574, выделяют и очищают целевой продукт. 7 табл. ного белка (С$) Plasmodium falclparum и восемь кодонов CS кодирующей последовательности Pre S2 белка встраивают в вектор, экспрессирующийся в дрожжах, причем он состоит из репликона или последовательности Pre $2- Я белка и соответствующей регуляторной области. Оба вектора экспрессии, а именно один, содержащий последовательность из 64 кодонов, и другой, содержащий

CS последовательность из 8 кодонов, каждый трансформируют в клетки дрожжей-реципиентов и анализируют экстракты таких трансформированных клеток на наличие

HBsAg эпитопов и CS эпитопов на той же молекуле.

Новые последовательности, кодирующие Pre $2 и Pre S2 — S белок HBV, получают из adNI субтипа HBV. который был выделен из плазмиды pRIT10616. Последовательности, кодирующие Pre S2-S белок, извлекают с помощью традиционных процедур рекомбинантной ДН К из плазмиды р IT10616. Pre

S2 область последовательностей характери1746887 зуется следующей аминокислотной последовательностью: -so

Мет=G In-Тгр-Asn-Ser-Thr-A a-Phe—

His — Gln-Ala-Leu-Gin-Asp-Pro-Arg gal-
Г9 Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser о

-Ser-Ser-Gly Thr-Val-Asn-Pro-Ala-ÐãÞAsn-Ие — Ala-Ser-His-Ие-Ser-Ser-Ser-Ser

- Ala -Arg Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.

Функциональным производным Pre

S2-S согласно предлагаемому способу является производное, у которого аминокислота аланин (GCT) в положении 45 модифицирована с помощью сайт-специфического мутагенеза на треонин (АСТ).

Рекомбинантная плазмидная ДНК состоит из последовательности, кодирующей

Pre $2 и Pre S2-S белок, лигированной с регуляторной областью.

Пример 1, Конструкция плазмиды

pR IT10167.

В качестве исходного материала используют плазмиду рбу, содержащую фрагмент 2.1 кЬ Hldn III дрожжевой ДНК, кодирующий ген TD НЗ, клонированный на

pBR 322. Фрагмент Hind III дрожжевой ДНК клонируют в pBR 322, в которой сайт Есой разрушают и получают рЮТ10164.

ДНК pRIT10164 очищают путем центрифугирования в градиенте CS CI-этилбромид. 150 мкг pRIT10164 ДНК обрабатывают

75 единицами эндонуклеазы Xbal, экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают этанолом в ДНК, ресуспендируют в 0,01 М трометамин-HCI-буфере при концентрации

1 мкг/мкл, 20 мкг ДНК, обработанной Xbal, гидролизуют Bal31 для удаления 61 п.о.

ДНК между ATG кодоном и сайтом Xbal.

Обработку Bal31 осуществляют при ЗО С в течение 1 — 3 мин в буфере, содержащем 600 ммоль хлористого натрия, 12 ммоль хлористого кальция, 12 ммоль хлористого магния, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕО ТА), 20 ммоль трометамин-НС!, рН

3,1 с использованием одной единицы нуклеазы Ва!31 на 20 мкг ДНК в конечном реакционном объеме 200 мкл.

Реакцию останавливают путем добавления этилен-бис(оксиэтиленэмтрило)тетрауксусной кислоты (EGTA) с получением конечной концентрации 20 ммоль и образцы экстрагируют эквимоляриыми объемами фенола, эфира и осаждают этанолом. Каждый образец ДНК ресуспендируют в 2!1,мкл

10 мМ буфера трометамин-KCI, рН 7,5.

Степень гидролиза Bal31 измеряют путем обработки 2,5 мкг образца ДНК эндонуклеаэой Hpal и путем сравнения размера фрагмента Hpal-Xbal с фрагментом 335 Ьр

Н ра!-Xbal из рЮТ10164, Двухминутный гидролиз Ва!31 удаляет 41-88 нуклеотидов из фрагмента ХЬа!-Нра! плазмиды pRIT10164..

5 мкг ДНК обрабатывают эндонуклеаэой BamHI, проводят экстракцию фенолом

5 и осаждение этанолом. Эту ДНК обрабатывают 5 единицами, Т4 полимеразы в присутствии дезоксинуклеотида трифосфатов для того, чтобы заполнить BamHI и Bal31 концы, экстрагируют фенолом и извлекают

10 осаждением этанолом. 2,3 мкг этой ДНК обрабатывают 5 ед. Т4 ДНК лигазы и половину сшитой ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12 штамма

ММ294. 1 мл трансформированной популя15 ции Е,соИ разбавляют в 350 мл L-бульона с

200 мкг/мл ампициллина и общую плаэмиду

ДНК очищают иэ полученной культуры.

80 мкг этой плазмиды ДНК обрабатывают 75 ед. Hind III эндонуклеазы и 96 ед.

20 BamHI эндонуклеаэы.

Целевые фрагменты Hind III-BamHI, соответствующие размерам 1100-1000 bp, на препаративном 1 -ном агароэном геле выделяют из геля в два среза, причем один

25 соответствует ДНК с размером около 1070

bp, другой — 1030 Ьр. ДН К извлекают из двух агарозных гелевых срезов с помощью циклов замораживания и оттаивания, после чего проводят центрифугирование агарозы с .

30 высокой скоростью. Верхний слой жидкости отфильтровывают с помощью фильтров и

ДН К извлекают с помощью двух циклов этанольного осаждения и ресуспендирования в

20 мкл 0,01 M трометамин-НС! буфера с рН

35 7,5, Анализ агароэного геля электрофореэом и сравнение гидролизованной Hind IIIXbal плазмиды pRIT10164 ДНК и с фрагментами из Hind !И EcoRI фага АДНК

40 показывает, что получают два различных фрагмента Hind III — BamHI, один размером

1070 Ьр, а другой размером около 1030 Ьр, в сравнении с 1120 Ьр Hind III-Xbal фрагментом плазмиды pRIT10164. Около 100 нг

45 фрагмента 1030bp Hind ill-BamН! лигируют с 200 нг плазмиды pUC9, которую обрабатывают Hind III u BamHI эндонуклеазами и щелочной фосфатазой. Полученную ДНК используют для трансформации клеток E.coll

50 штамма JM103 с селекцией на устойчивость к ампициллину, Получают около 400 устойчивых к ампициллину колоний на 1 мл и 98 колоний и испытывают в среде, содержащей Х-gal, 55 Плазмиды из трансформированных колоний получают после амиплификации плазмид путем добавления спектиномицина (150 мкгlмл) к растущим культурам.

Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5;(,-ной акриламидном геле после

1746887

40 препарат обрабатывают эндонуклеаэой ми

Clal, ДНК pRIT10158 гидролизуют эндонук- об леазами С!а! и НаИИ и фрагмент 1150 Ьр Н

С!а-Hall!i. несущий область окончания ок транскрипции arg . гена. извлекают путем 55 ф препаративного электрофореза на агароз- фр ном rene и злектроэлюированием. Этот уч фрагмент лигируют с ДНК плазмиды

pRIT10158, обработанной EcoRI, Т4 ДНК (и полимеразой, Clal. и лигированную смесь ш гидролиза с AVail u BamHI зндонуклеаэами и сравнивают с 450 Ьр фрагментом AVallXbal, включающим промотор-N-концевую кодирующую область pRIT10164, и с Hpall фрагментом ДНК плазмиды pBR322. AVall- 5

BamHI фрагмент присутствует в 35 из 36 плазмид, Три нлазмиды выбирают для дальнейших исследований. Плаэмидную ДНК выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности CSCI-этилбромид и 25 мкг 10

ДНК гидролизуют EcoRI. EcoRI концы метят у-P ATP.

Пример 2. Конструкция векторной

p R IT10172.

1050 Ьр Hind III-BamHI ТОНЗ ДНК 15 вставки иэ pRIT10167 клонируют на челночном векторе УЕр13 и получают рекомбинантную плазмиду pRIT12059, ДНК плазмиды рй!Т12159 гидролизуют

Xbal u BamHI эндонуклеазами и фрагмент 20

1650 Ьр лигируют с фрагментом XbalBamHI, содержащим стимулятор arg на плаэмиде pRIT10774. Плазмида pRIT10774 включает репликон УЕр13, из которого удалены сайты BamHI u Xhol путем манипуля- 25 ции in vitro с фрагментом 1470 ba Hind

II!-BamHl, включающим область стимулятора arg, и фрагментом 1150 Ьр BamHI-Hind

Ill, включающим arg область окончания транскрипции. Замена стимулятора arg на 30

pRIT10774 на стимулятор Т0Н3 дает плазмиду pRIT10172, которая содержит единст венный сайт BamHI, расположенный при кодоне ATG стимулятора TDH3 и предшествует сигналу окончания транскрипции на 35

1150 Ьр BamHI-Hind ill arg ДНК фрагменте.

Чужеродную ДНК можно клонировать в этом сайте.

Пример 3. Фрагмент 1050 bp. Н!пб

И!-EcoRI из pRIT10167 и Hind И!-BamHI

TDH3 фрагмент, содержащий стимулятор, вместе с частью BamHI Smal-EcoRI полилинкера pUC9 клонируют между сайтами

Hind III u EcoRI плазмиды pBR322. в которой предварительно удаляют сайт BamHI путем заполнения полимеразой Т4 ДНК и лигируют.

Плаэмидную ДН К pRIT 10158 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI и полимеразой

Т4 ДНК для заполнения EcoRI-концов, Этот 50 используют для трансформации клеток

Е.coll штамма ММ294. Иэ трансформированных колоний выделяют плазмиду, в которой фрагмент Clal-Haelll окончания транскрипции arg вставлен между сайтами

ClaI, сайт Есой! заполнен и восстановлен.

Плазмидную ДНК pRIT10162 обрабатывают

EcoRI и Pst! эндонуклеазами. смесь лигируют и используют для трансформации клеток

Е.coll К12 штамма ММ294. Извлекают плазмиду pRIT12208, в которой большой фрагмент 4630 Ьр EcoRI-Pst I иэ pRIT12176 лигируют с фрагментом 1930 bp EcoRI-Pst из рЮТ10162, в котором arg область окончания сшивается со стимулятором Т0Н3.

Фрагмент 2200 bp Hind И! из pRIT12208 клонируют в сайт Hind ill производной плазмиды pBR322, в которой сайты EcoRI u

ВатН! удаляют путем заполнения полимеразой Т4 ДНК.и лигированием. В обеих плазмидах pRIT12208 и pRIT12290 фрагменты стимулятора TDH3 и arg окончания транскрипции разделены сайтами BamHI, Smal и EcoRI, и области стимулятора и окончания транскрипции могут быть вырезаны .вместе на фрагменте 2200 Ьр Н!пб, III.

Сайт BamHI полезен для клонирования, так как он расположен при ATG кодоне гена

TDH3 и может быть применен для слияния других генов со стимулятором Т0Н3.

Пример 4, Конструкция плазмид

pRIT10677, pRIT10909 и pRIT10158. а) pRIT10677.

BamHI фрагмент 1372 Ьр клонированной HBsAg ДНК вырезают из pRIT10616 и лигируют с вектором PBR327, обработанKblM эндонуклеазой BamHI. Этот фрагмент

BamHl содержит часть области предшественника HBsAg. Получают плазмиду

pRIT10677, которая имеет BamHI фрагмент

HBV, вставленный в сайте BamHI вектора в такой ориентации, что сайт Xbal в HBV ДНК расположен близко к сайту Sall вектора

pBR327.. в) рй!Т10909.

HInd И! фрагмент 3300 bp из плаэмиды рМС200 клонируют в производную плаэмиды pBR322, в которой EcoRI сайт удаляют путем заполнения полимеразой Т4 ДНК, и повторным лигированием отбирают плаэду pRIT10158, в которой Hind !И имеет 3 ласть arg гена. Фрагмент 1150 bp Clafael l l извлекают из pRIT10158, он содержит ончания транскрипции гена arg . Этот рагмент 1150 bp лигируют с Clal-Hpal агментом ДН К плазмиды р ЮТ10677. Iloa ают плаэмиду pRIT10909.

Il р и м е р 5. Сайт BamHI рй!Т10167 ример 1), расположенный в области предественника HBs Ag гена, иэ HBV вируса

1746887

adW серотипа, клонированного на

pRIT10616, находится в одинаковой трансляционной рамке считывания. Источником

НВЧ ДНК фрагмента является плазмида

pRIT10909. Фрагмент 2085 Ьр EcoRI-BamHI выделяют из pRIT10909 и встраивают в сайт

EcoRI u BamHI плазмиды pRIT10909 и получают плаэмиду pRIT10911, Фрагмент 3134

bp Hind П1 из pRIT10911, содержащий сигналы транскрипции дрожжевой ДНК и ДНК

HBsAg, встраивают в челночный вектор

УЕр13 с получением плазмиды pRIT10912.

Пример 6. Сконструированы плазмиды, у которых удалены избыточные нуклеотиды из 5 конца фрагмента ДНК, кодирующего N-терминальную часть при родной HBsAg.

1225 bp FnUD II фрагмент HBV ДНК из

pRIT10616 и кодирующий HBsAg ген вырезают из этой плазмиды и лигируют с EcoRI, фрагмент клонируют в EcoRI сайт вектора рАСУС184 с получением pRIT10679. Получают 125 Ьр EcoRI-Xbal фрагмент, который содержит терминальную область HBsAg предшественника. HBsAg ATG кодон и 90 Ьр

-HBsAg кодирующую последовательность.

Этот 125 Ьр EcoRI-Xbal фрагмент встраивают в сайты EcoRI u Xbal pRIT 10158. Полученная плазмида pRIT 10903 содержит единственный

i сайт EcoRI, расположенный при стыке между, arg ДНК и НВЧ ДНК и единственный сайт Xhol„ расположенный в области стимулятора.

150 мкг pRIT10903 плазмидной ДНК, которую получают с помощью центрифугирования в градиенте плотности CsCI этиленбромида, обрабатывают 80 ед. зндонуклеаэы EcoRI, после чего экстрагируют фенолом, осаждают зтанолом и вновь суспендируют при концентрации 1 мкг на 1 мкл в 10 мМ буфере трометамин-HCI (рН 7,5).

ДНК разделяют на три образца по 50 мкг и инкубируют в течение 50, 75 и 90 с с нуклеазой Ва!31 при 30 С. К50мкг EcoRI обработанной pRIT10903 ДНК, добавляют 2,5 ед. нуклеазы Bal31 в конечном объеме из 500 мкл. Реакцию останавливают путем добавления EGTA к 20 мМ конечной концентрации, охлаждают на льду, экстрагируют эквивалентным объемом фенола и осаждают этанолом, Образцы ДНК, обработанные

Ва131, берут в 50 мкл 10 мМ буфера трометамин-HCI и 2,5 мкг дополнительно обрабатывают зндонуклеазой Bst Ell. выделяют

285 bp фрагмент нуклеазой в течение 75 с при 30 С, уменьшает размер фрагмента,Есо

Rl-Bst Ell на 10-60 основных пар. Удаление на 29 основных пар из Fnud П сайта удаляют весь HBsAg предшественник ДНК и HBsAg

ATG кодон.

5 мкг pRIT10903 ДНК обрабатывают в течение 75 с Bai31, гидролизуют 8 ед. Xhol нуклеазы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Эту ДНК затем инкубируют с .

5 ед, Т4 ДНК полимераэы в присутствии диоксинуклеотидтрифосфата дпя заполнения сайтов Xbal и Bal31. обрабатывают фенолом и осаждают зтанолом. Затем ДН К инкубируют с 5 ед. Т4 ДНК лигазы в течение

16 ч при 16 С и смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12

l0 штамма ММ294. Около 2000 колоний, устойчивых к ампициллину, на 1 мл извлекают после посева, выделяют плазмиды из 47 индивидуальных колоний.

Одну плазмиду, содержащую фрагмент

Xhol-Xbal размером 95-100 основных пар.

15 выбирают для исследований. ДНК этой плазмиды очищают с помощью центрифугирования с градиентом плотности CSCI-этиленбромид и 25 мкг такой ДНК гидролизуют

140 ед. эндонуклеазы Xbal.

Концы Xbal метят y- P ATP и меченую

ДНК обрабатывают 15 ед, эндонуклеазы

Hind Пl. Фрагмент 765 Ьр Hind III — Xbal изолируют акриламидным гелевым электрофорезом и электроэлюированием, после че25 го осаждают этанолом. Нуклеотидную последовательность вокруг сайта Xhol определяют последовательным анализом этого фрагмента от меченого конца Xbal. Данные о последовательности показывают, что сайт

Ппазмиду pRIT12209 очищают центрифугированием с градиентом плотности смеси CS CI-этилбромид и 50 мкг pRIT12209

ДНК гидролизуют с 90 ед. эндонуклеазы

BamHI и 60 ед. Xhol зндонуклеаэы дпя удаления 990 bp периферической ДНК между стимулятором TDH3 и HBsAg кодирующей областью и затем экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. 16 мкг этой ДНК инку55

Xhol расположен на первой основе второго кодона HBsAg кодирующей последовательности;

Xhol, 35 CTCGAGAAC, HBsAg нуклеотидов, Пример 7. Плазмиду pRIT10911 используют в качестве носителя для дальнейших манипуляций. Плазмиду гидролизуют

40 эндонуклеазами BamHI и Xbal, и этот фрагмент замещают на фрагмент 2275BamHIXbal из плазмиды рЯIТ10158, Получают плазмиду рЯ1Т12211.

Плаэмиду pRIT12211 обрабатывают эн45 донуклеазами Xhol и Xbal, и удаляют фрагмент 1600 bp, Этот 94 Ьр фрагмент очищают акриламидным гелевым электрофорезом, эпект роэлюируют соответствующий гелевый срез и извлекают ДНК этанопом дпя

50 осаждения, 1746887

1 бируют в течение 30 мин при 30 С с 20 ед.

Мунг Бин нуклеазы в объеме 125 мкл.

Буфер, используемый для инкубирования, представляет собой 30 ммоль ацетата натрия (рН 4,6), 250 ммоль хлористого на- 5 трия,.1 ммоль хлористого цинка и 57, глицерина. Реакцию останавливают добавлением додецилсульфата натрия с получением

0,2 -ной конечной концентрации, проводят экстрагирование эквивалентным объе- 10 мом фенола, после чего осаждают этанолом.

Аликвоту 0,5 мкг этого образца инкубируют

2 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16 ч. при 16 С и затем проводят обработку 2 ед. эндонуклеазы BamHI для разрушения каких-либо 15 векторных молекул. Зту смесь используют для трансформации клеток Е.coll К12 штамма ММ294. извлекают около 2000 устойчивых к ампициллину колоний.

Четыре плазмиды берут для дальнейше- 20 го исследования. ДНК каждой плазмиды переваривают Xbal эндонуклеазой и метят

P-ATP, после чего гидролизуют эндонукзг леазами Hind III и выделяют меченый 1190

bp фрагмент Hind.ll! — Xbal с помощью алек- 25 троэлюирования и этанольного.осаждения с последующим акриламидным гелевым электрофорезом. Последовательность каждого . фра мгнта определяют методами химической модификации-Максама и Гильберта. 30

Две плазмиды имеют точную последовательность ATGGAGAAC для полного слияния области стимулятора TDH3 с HBsAg геном.

Одную из этих плазмид (pRIT12230).используют в дальнейших манипуляциях. ДН К этой 35 плазмиды (pRIT12230) гидролизуют зндонуклеазами Hind III и 300 bp фрагмент, содержащий HBsAg кодирующую последовательность, слитую-с TDH3 стимулятором, лигируют с челночным вектором УЕр13. 40.

Полученной плазмидой pRIT12265 транс.формируют дрожжевой штамм DC5 (МАТа, leu 2-3; leu 2-112, his 3, can 1 — 11).

П р и.м е р 8. 25 мкг ДНК pRIT12230 гидролизуютс эндонуклеазами Асс! и Есой!, 45

pRlT12230 содержит единичный сайт Accl, расположенный в S-ген кодирующей после- довательности за 7 нуклеотидами перед

ТАА стоп-кодона. Проводят электрофорез гидролизацией ДНК на 1 -ном агарозном 50 геле и извлекают векторный фрагмент 4200

Ьр из геля с помощью электроэлюирования и этанольного осаждения. Молекулы, связывающие искусственную ДН К, составленные из 12-член ного (12-mer) витка и 14-член ного (14-вег) линкера со следующими последовательностями синтезируют для вставки между Accl и Есо1;!!.центрами pRIT12330;

5 ATACATTAAGG 3, 12 mer.

3 TGTAAATTGCTTAA 5, 14 mer.

100 пмоль синтетического 12 mer и 100 пмоль синтетического 14 mer линкера смешивают вместе в конечном объеме 10-20 мкл. нагревают при 70 С в течение 15 мин. медленно возвращают к комнатной температуре в течение 3 ч и обеспечивают обжиг двух витков вместе с их комплементарными последовательностями. К этой отожженной смеси добавляют 0 15 пмоль (400 нг) 4200 Ьр

Accl-EccRI фрагмента pRIT12230 10-кратно концентрированного буфера для лигирования и.2 ед. Т4 ДНК лигазы.

Зту смесь инкубируют в течение 4 ч при

16 С перед добавлением дополнительных 2. ед. Т4 ДНК лигазы и затем инкубируют в течение ночи на льду. Смесь после лигирования используют для трансформации компетентных клеток штамма ММ294.

Выделяют плазмиды из 12 или более индивидуальных колоний, Плазмиду со вставкой Accl-EcoRI гидролизуют,эндонуклеазами EcoRI и обрабаты- вают щелочной фосфатазой. Фрагмент 2650

bp Hind III pRlT10162,клонируют в сайте

Hind III pBR327 векторной плазмиды, получают плазмиду pRIT12288.

Из pRIT12288 получают фрагмент 1180

bp EcoRI, который несет arg. транскрипционную терминационную область. Зтот фрагмент клонируют в сайт EcoR1 производной

pRIT12230, которую обрабатывают щелочной фосфатазой.

Выделяют 2900 bp. Hind III-фрагмент из

pRIT12322.

Пример 9. Плазмида pRIT12322 содержит 2900 Ьр Hind И! фрагмент;со всеми необходимыми сигналами для экспрессии

HBsAg из TDH3 стимулятора. Этот фрагмент лигируют с челночным вектором для введения в клетки дрожжей.

ДНК челночного вектора УЕр13 обрабатывают эндонуклеазой Hind И! и щелочной фосфатазой и используют в качестве реципиента для введения Hind И! фрагмента из

pRIT12322. Получают плазмиду pRIT12329„ которая состоит из репликона УЕр13 вместе с 2900 bp Hind !!! модульным фрагментом. . Пример 10. Плаэмиду WP201 получают в результате введения Есой! фрагмента из ilmPfl в вектор pUC8. Фрагмент плазмиды WR201, содержащий CS белковую кодирующую последовательность минус первый

52 Ьр. очищают электроэлюировэнием из

7,5®-ного полиакриламидного электрофоретического геля. Зтот фрагмент обрабатывают Sau ЗА. BamHI плазмиды pRIT10911, расположенный при ATG кодоне инициации, находится в фазе с sau 3A сайтами CS

1746887

Plasmodium falc!parum, ДНК плаэмиды

pRIT10911 обрабатывают с BamHI эндонуклеазами, щелочной фосфатаэой. экстагируют фенолом и извлекают осаждением этанолом. 0,2 мкг этой ДНК смешивают с 0,2 мкг Sau 3A обработанного Stu I-RSal CS гена, обрабатывают Т4.ДН К лигазой, и лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12 штамма ММ294. Получают 32 плазмиды иэ индивидуальных трансформантных колоний после амплификации плаэмиды путем .добавления спектиномицина (300 мкг на 1 мл) для выращивания культуры. Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5%ном акриламидном электрофоретическом геле, после гидролиза с эндонуклеазами

BamHI и Xbal, HInd 111 фрагменты pRIT12572 и

pRIT12571, содержащие стимулятор TD НЗ, С$-HBsAg гибридную кодирующую последовательность и atg область терминации, з вновь клонируют в УЕр13 и получают плазмиду pRIT12574 и pRIT12573, Плазмиды pRIT10912; pRIT 12574 и

pRIT12573 вводят в S.cerevisiae дрожжевой штамм ДС-5(а, Ieu 2 — 3, leu 2-112. his 3, Can

1- i) и в S.cerevlslae дрожжевой штамм 10

$44С (рер 4-3. Ieu 2-3, leu 2-112) трансформацией клеток. обработанных ацетатом лития.

Плаэмидную ДНК pRIT12572 или

pRIT12571 гидролизуют BamHI эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатазой.

1215 Ьр Stul — RSal фрагмент плазмиды

WR201 обрабатывают Sau ЗА эндонуклеазой и выделяют 192 Ьр и 24 bp фрагмент. Эти фрагменты смешивают с pRIT12572 или

pRIT12571 векторами, которые предвари. тельно обработаны BamHI, щелочной фосфатазой и ТН ДНК лигазой, трансформируют клетки E.coll К12. Проводят скриннинг плазмид из трансформантных колоний. Наличие BamHI сайта на таких плазмидах подтверждает введение 192 Ьр или 24 Ьр Sau ЗА фрагмента в точной ориентации для слияния при ATG кодоне.

Плаэмида pRITI2309 состоит из Ьр 2 микронной ДНК последовательности из дрожжей, клонированных в EcoRI сайте плазмидного вектора pBR327, 6318 Ьр 2 микронную ДНК последовательность получают иэ плазмиды рС V19.

2850 Ьр Clal — Sall фрагмент, содержащий TD НЗ вЂ” arg и расположенные Моку последовательности pBR322 из pRIT12290, клонируют в векторе pRIT12309 между сайтами Cia al и Sall, Полученную плазмиду

pRlT12314 гидролизуют с Sail эндонуклеазой и лигируют с 2218 bp Sall-Xhol фрагмен10

15 рина, 4% SDS, 6 М мочевины и 10% 2-меркаптоэтанола. Пос;е инкубирования в

30 течение 5 мин при 100 С образец делят по35

40 желатиной в PBS. Фильтр последовательно промывают пять раз в течение 5. мин каждый . раз PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и одние 1 ч при комнатной температуре смесью

45 пяти моноклональных антител против CS белка в PBS 1% желатины, Другую половину пластины обрабатывают моноклональным антителом против HBsAg, Неру TAS 12. в

PBS, 1% желатина. Фильтровальные пла50 стины промывают 5 раэ в течение 5 мин каждый раэ с P BS, 0,1% Теин-20 и добавляют биотинированные антитела овцы к IG мышцы в РВ$1% желатины в течение 1 ч при комнатной температуре, Пластины снова

25 том иэ УЕр13, содержащего дрожжевой I eu

2 ген.

Плаэмиду pRIT12544 получают из колоний, в которых плазмидную ДНК содержит

2218 Ьр Sal 1-Xhol фрагмент с leu 2 геном, который введен в сайт Sall.

3328 bp Hind 111 фрагмент pRIT12574, а также ДНК УЕр13 клонируют на pBR322

hBamHI плазмиде и получают pRIT12608

2550 Ьр BamHI Sall фрагмент из рВТ12608, содержащий CS HBsAg, arg3 область терминации транскрипции pBR322 последовательность, клонируют между

BamHI u Sall сайтами pRIТ12544 и получают плазмиды pRIT12658.

Пример 11. Трансформируют дрожжевые (Saccharomyces cerevisiae) штаммы

DC5 и 10 S 44С каждой иэ плазмид

pRlT10912, pRIT12573, pRIT12574 или

pRIT12659, или плазмид pRIT12329, pRIT10172 и выращивают в жидкой среде с недостатком лейцина (VNB или VNB + 80 мкг/мл гистидина) с последующим сбором культуры в средней лог-фазе. Клетки в культуре 1 или 2 мл отбирают путем центрифугирования и суспендируют в 50 мкл 0,125 М трис-НО (рН 6,8), содержащих 20% глицеполам и обе половинки подвергают электрофореэу через 12 5% разделяющий гель, 5% слоистый гель согласно методу Лаемли.

HBsAg u CS белковую последовательности идентифицирую с помощью методики иммуноокрашивания белка

После нанесения белков на нитроцеллюлоэном фильтре фильтр предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37ОС с 3%,ну половину пластины обрабатывают в течепромывают PBS, 0.1% Твин-20, 5 раз в течение 5 мин каждый раз и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре с . комплексом стрептакидинбиотинсодержащей пероксидаэой хрена (HRP), Пластины снова промывают 3 раза пп.5 мин;каждый

1746887

5

15

20 ге. Отобранные фракции испытывают на присутствие HBsAg u CS антигенов.

25 Анализ на иммуноокраску градиентных

35

40 трацией.

50 Окончательно очищенный от клеточного экстракта 10$44С pRI 712574 дает один основной пик на колонке HPZC TSK-300(ЛКВ), который содержит антитела HBsAg u CS.

Электрофорез на SDS полиакриламидном

55 геле с последующим окрашивэнием свребраз PBS, 0,1% Твин-20, и инкубируют с 30 мкл Н202 и HRP-содержащими 4-хлоролнафтола. 30 мг в 10 мл метанола, в 50 мл

P BS.

Молекулярный вес антигенов оценивают с помощью предварительно окрашенных белковых маркеров, овальбумина, альфахимотрипсиногена, бета-лактоглобулина, лизоцима, цито хрома C(B И ().

Оба дрожжевых штамма DC5 и 10$44

С, трансформированные с pRITI2573, синтезируют антиген, реагирующий как C анти-CS. так с анти-H8s Ag антителами, и их молекулярный вес составляет 30000 килодальтон (И). Оба дрожжевых штамма ОС5 и

10S 44С, трансформированные pRITI2574 или с pRITI2658, синтезируют антиген, способный реагировать как с анти-CS, так и с анти-HBsAg антителами и молекулярный. вес белка составляет 3?000 kd, Эти результаты показывают, что гибридный белок ожидаемого молекулярного веса. содержащий как CS, так и HBsAgпоследовательности, синтезируется в дрожжах, трансформированных плазмидой, содержащей

С$ кодирующую последовательность, слитую с кодирующей последовательностью Pre S2HBsAg.

Пример 12. Дрожжевые (Saccharomyces cerevlsiae) штаммы DC5 или . 10S 44С, содержащие.или pRIT10172, pRIT12329, pRIT12573.или pRIT12574, виращивают в селективной среде (200 мл VNB или VNB + 80 мкг/MR гистидина) до конца лог-фазы. Клетки отбирают центрифугированием и вновь суспендируют в 10 мл 50 мМ буфера из фосфата натрия (рН 7,4), содержащего 0,5% Твин-20 (полиоксиэти-. ленсорбитанмонолаурат), 1 ммоль PMS (фенилметилсульфонилфторид) и 2,5% изопропанола, Клетки разрушают путем пропускания через французский пресс при 20000 . PsI (1,38х10 Па). Суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 30000xg.

Измеряют общую концентрацию белка 4 в верхнем слое жидкости (сырой клеточный экстракт) использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Наличие HBsAg определяют с помощью радиоиммунного испытания. Наличие С$-по-. следовательностей в HBsAg частицах испытывают в ELISA тестах, Соответствующие разбавления образцов, которые испытываются (в PBS, содержащем О;2% BSA), позволяет проводить реакцию (в течение ночи при комнатной температуре) в твердой фазе анти-HBsAg. Связанные HBsAg частицы инкубируют в течение 1 ч при 370С

1/10000 разбавлением (в РВ$, содержащем

О,Щ BSA) смеси пяти моноклональных антител, причем первое антитело к CS белку, и затем инкубируют с 1/500 разбавлениями (в PBS, содержащем 0,1% 8$Я) биотин содержащего анти-мышиного Jg овцы в качестве второго антитела в течение 1 ч при

37 С. Инкубируют с 1/1000 разбавлением (s .

PBS, содержащем 0,1% BSA) комплекса стрептавидин-биотинсодержащей пероксидазы хрена и хромоген в течение 30 мин при

37 С.

Измеряют концентрацию белков и активность в сырых клеточных экстрактах.

Плазмида pRIT12574 показывает более чем в десять раз меньшую активность.

Активность AUSRIA в сырых клеточных экстрактах приведена в табл.1.

Опыт ELISA показывает, что pRIT12573 и pRIT12574 кодируют HBsAg u.CS зпитол, 1 мл сырых клеточных экстрактов смешивают с 1.5 М CsCI в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,4) и центрифугируют в течение 40 ч при 40000 g в ультрацентрифуфракций подтверждает результаты

RtA/ELISA. HBsAg и/или CS-последовательности обнаруживают только в тех фракциях, которые не реагируют в испытаниях

RIA/ELISA (табл.2).

HBsA9 и CS эпитопы, присутствующие в антигенах, связанных с иммобилизованными анти-HBsAg антителами приведены в табл.2;

Эти результаты указывают, что гибридный протеин, получаемый при экспрессии рй1Т12573 и pRIT12574, объединяется в частицы, подобные 22 нм частицам HBsAg npu синтезе в клетках дрожжей.

Пример 13. Неочищенный клеточный экстракт дрожжевого штамма 10S 44С, содержащий pRIT12574, осветляют осаждением полиэтиленгликолем (PEG) 400 и концентрируют ультрацентрифугированием.

Дальнейшую очистку гибридных частиц проводят CsO центрифугированием, гидроксиапатитной хроматографией и гель-фильром дает одну основную полосу молекулярного веса 37000 kd. Данные электронной микроскопии после окрашивания уранилацетатом дают примерно такие же значения

1746887

16 размеров и формы частиц, что и для HBsAg, полученным из дрожжей.

Серые дрожжевые экстракты получают разрушением дрожжевых клеток в присутствии равного веса 50 MM натрийфосфатного буфера для экстракции (рН 8,1), дополненного 4 мМ Titrlplex III, 1 f, Твин-20;

4 мМ PMSF и 10 )(, изопропанола, Клеточные осколки удаляют центрифугированием при

11000 g в течение 90 мин, 50 мл отцентрифугированного экстракта доводят до рН 7,2

1 н. уксусной кислотой и перемешивают в течение ночи при 4 С в присутствии 10 г коллоидной двуокиси кремния. Затем суспензию центрифугируют при 3,500 g в течение 1 ч и полученный осадок промывают. трижды 150 мл 0,15 М NaCI, дополненного 2

MM PMSF и 5 мМ ЕДТА в течение 15 мин.

Элюируют 250 мл 10 мМ фосфатного буфера (pH 9,5), содержащего 2 Твин-20 при 370С в течение 3 ч. К десорбату добавляют по каплям 1М раствор CaClz до окончательной концентрации 30 мМ СаС!2 и устанавливают

pH = 7. Полученный раствор оставляют на ночь при 4 С и центрифугируют при 6500 g в течение 15 мин, Надосадочную жидкость подвергают диализу (2x51x10 мМ трис-НС!, рН 7,1) при 4 С и затем разбавляют 4 раза диализным буфером.

После добавления 30 мМ СаС!г и 1М

NaCI разбавленный раствор антигена с рН

7,1 пропускают над колонкой 150 мл с фенил-сефарозой. уравновешенной тем же

CaCIz(NaCI, содержащим трис-буфер со скоростью потока 30 см/ч. Последовательно колонку. промывают равновесным буфером до тех пор пока 00280 нм (оптическая плотность) не снижается до О, и элюируют с той же самой скоростью потока 6М мочевины в

10 мМ трис-HCI рН 9.

В другом варианте деалиэованный и разбавленный в четыре раза раствор антигена дополняют 20;(NH

CS-HBsAg частицы имеют плавучую плотность 1,23 г/см .

Пример 14, Гибридные частицы, выделенные из S.serevisiae штамма 10S

44С рр!!12574, инокулируют лабораторным

10 животным в чистом виде или с адъювантом алюминий гидроксидом.

Мышей штамма С57В1/6 (6-8 недель), морских свинок и кроликов иммунизуют подкожно и внутрибрюшинно в 1, 21 и 49 дни. Кровь отбирают на 7, 28, 56 и 84 день.

Кровь. оставляют до свертывания при 4 С в течение ночи, а полученную сыворотку выделяют и хранят при -70 С до применения.

Кролики (2 группы по 2 кролика в каждой) получают 10 мкг гибридного С$ — HBsAg протеина в дозах по 1,0 мл с добавлением или без добавления гидроокиси алюминия при каждой иммунизации. В качестве конт15 роля 2 к!2оликов иммунизируют 10 мкг Нерата Vax В .. Мыши и морские свинки в группах по 5 животных получают по 1 и 5 мкг гибридного протеина соответственно, в дозах по

0,5 мл при каждой иммунизации, Неиммуни20 .зированные животные служат в качестве контроля.

Для определения реакции антител сыворотку, полученную от мышей, собирают для каждой группы, тогда как выворотку от

25 морских свинок и кроликов анализируют индивидуально. Анти-CS-антитела тритры измеряют анализом ELISA, используя рекомбинантный CS протеин Я32тет32 в качестве антигена. Анти-Н BsAg титры опреде30 ляют, используя.AUS АВ набор и WHO для сравнения.

Ни у морских свинок, ни у мышей не вырабатываются антитела к HBsAg, несмотря на повторные инъекции. Напротив, оба

35 вида животных вырабатывают анти-CS антитела, и это усиливается при повторах. Поглощение 1.,0 .в анализе ELISA достигают при сывороточных разбавлениях в 1600 раз (мыши) и 9000 раз (морские свинки). Имму40 ногенность гибридных частиц не воэрастатет при адсорбции на гидроокиси алюминия.

Кролики вырабатывают антитела. как к

С$, так и к HBsAg. Обратные титры при

45 поглощении 1,0 в анти-С$Е! !$А анализе дают значения между 800 и 3200 Mu/1 мл..

Анти-HBsAg титры, полученные для гибридных частиц, адсорбированных на гидроокиси алюминия, находятся между 4000 и 20000

50 ма 1/мл, тогда как для кроликов, иммунизированных Нерта Vax, титры имеют значения от 10 до 10 ми 1/мл. Адсорбирование гибридных частиц на алюминийгидроксиде повышает иммунную реакцию (табл.3).

55 CSP реакционная способность и процент ингибирования вторжения спорозоитов ($ ISI) HepG2-А 16 гептомы клеток дана в табл.3.

Пример 15. Вакцину получаютследующим образом. К буферированному водно17

1746887

18 му раствору 3 -ной гидроокиси алюминия (10 MM раствор фосфата, 150 мМ NaCI, рН

6,8. стерилизовано фильтрованием) добавляют полученные частицы в аналогичном буфере при перемешивании до конечной концентрации 100 мкг/мг полипептида и 0,5 мгlмл алюминия (А! ). рН поддерживают з

6,8, Смесь оставляют на ночь при температуре около 0 С. Добавляют Thimersoi до конечной концентрации 0,005%, Проверяют и устанавливают рН при 6,8.

Пример 1.6, Плазмиду pRIT12290 модифицируют введением BamHI-EcoRI синтетического адапторного фрагмента, кодирующего N-терминальные аминокислоты

pre S 2 участка между TDH3 промоторными

APG3 терминаторными фрагментами.

Плазмиду pRIT12290 расщепляют

BamHI è EcoRI ферментами и дефосфорилируют щелочной фосфатазой. 20 пмоль фосфорилированного синтетического адаптера:

Gin Trp

Ham HI 5 GATC CAG TGG 3 EcoRI

3 GTC АССТТАА 5 связывают с 0.1 пмоль BamHI-EcoRI фрагментом дефосфорилированной плаэмиды

pRIT12290, используя 1 ед. (u) Т4 лигазы, и используют для трансформации Е.coll штамма ММ294. Один трансформант, содержащий целевую плазмиду с синтетическим адаптором, включенным между BamHI и EcoRI сайтами, идентифицируют.

30 пмоль (120 мкг) pRIT12621 ДНК обрабатывают 120V BamHI. После удаления рестрикционного фермента экстракцией фенолом плазмиду осаждают этанолом и ресуспендируют в соответствующем буфере для обработки BamHI нити и 280 ед. (V) нуклеазы фасоли золотистой. Нуклеазу удаляют фенольной экстракцией с последующим осаждением этанолом. Обработанную таким образом плазмиду повторно суспендируют в буфере для лигирования и рециркулируют 10 ед. Т4 лигазы.

Препарат, содержащий сшитую ДНК, обрабатывают фенолом, осаждают этанолом, ресуспендируют в соответствукпций буфер и расщепляют EcoRI ферментом. После удаления EcoRI сайта, 0,05 пмоль (0,2 мкг) ДНК суспендируют в буфере (для лигирования с 0,4 пмоль (0,2 мкг) EcoRI фрагмента размером 838 п.о„выделенного из рЯ1Т12581, который содержит полный Gтерминальный кодирующий участок pze S2.S протеина. Вектор pUC9 расщепляют

EcoRI эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатаэой, Плазмиду рЮТ10616 (ATCC 39131) расщепляют EcoRI ве Ассб рестрикционными эндонуклеазами и 826

EcoRi-Accl ôðàãìåíò, содержащий часть per

S2-S выделяют с помощью препаративного акриламидного гель-электрофореза и электроэлюирования. Около 0,4 пмоль (0,2 мкг)

5 этого фрагмента смешивают с примерно 10 пмоль следующего синтетического адаптора:

Tyr Пе Stop

5 АТАCATTTAAG 3

10 ACCI EcoRI

3 TGTAATTGCTTAA 5 и полученную смесь обрабатывают Т4 ДНК лигазой и расщепляют EcoRI рестрикционной эндонуклеазой, К обработанной таким

15 образом смеси добавляют около вектора pU

С 90,2 мкг EcoRI эндонуклеазы и щелочной фосфатазы и полученную смесь обрабатывают Т4 ДНК лигазой и используют для трансформации компетентных клеток Е.coll

20 К12, устойчивых к ампициллину.

Колонии исследуют на присутствие плазмиды, содержащей фрагмент 2650 bp

pUC9 вектора с EcoRI фрагментом 838 bp

EcoRI, содержащим 826 bp EcoRI-Accl pre

25 S2 — S фрагмент, вместе с 12 bp Accl — EcoRI синтетическим линкером. Правильность конструкции проверяют путем определения последовательности ДН К.

Смесь, содержащую плазмиду ДНК

30 pRIT12621 и 838 bp EcoRI фрагмент

pRIT12581, используют для трансформации

Е.соИ штамма. ММ294. Трансформант, содержащий плазмиду с ЕсоЮ фрагментом в правильной ориентации, идентифицируют

35 как pRIT12662.

Пример 17. ДН К плазмиды pRIT12309 расщепляют Sall эндонуклеазой и лигируют с 2218 bp Xhol-Sall фрагментом ДНК с LEU

2 геном. Лигированную смесь используют

40 для трансформации клеток Е.coll К12 штамма J А221.

Идентифицируют плазмиду pRIT12377 из колонии трансформатов. Эта плазмида содержит 2218 Ьр Е02ХЬо!-Sall фрагмент, 45 встроенный по Sall сайту pRIT12309, Hind III фрагмент размером 3050 пар оснований из pRIT12662 кодирующий pre

$2-S белок, очищают электрофореэом на акриламидном геле, обрабатывают Т4 пол50 имеразой и лигируют с pRIT12377; предварительно обработанной BamHI ферментом и вновь сшитой Т4 полимеразой. Этот препарат используют для трансформации штамма Е.соИ ММ294, устойчивого к ампи55 циллину, Плазмиду pRIT12660 используют для трансформации двух штаммов S.cerevlslae, т,е, штамма ДС5 с!г и штамма 10$44Сс)г".

П р и и е р 18. Участок pre $2 плаэмиды

pRIT12662 ееквенкируют, при этом обнару20

1746887

10

30

40

55 живают, что имеются изменения четырех пар оснований, которые приводят к изменению трех аминокислот при сравнении с другим вирусом adW 2 серотипа. Аланиновый остаток вместо треонинового остатка в положении 45, фенилаланин вместо лейцина в положении 34 и сериновый остаток вместо изолейцинового остатка в положении 11.

Пример 19. Дрожжи (S.cerevlslae) штамм ДС5 clr или 10S 44С ciro, содержащие плазмиду pRIT12660 или плазмиду. рй)Т12363 (пример 16) выращивают в селективной среде (200 мл YNB + 80 мкг/мл гистидина ДС5с!г или YNB/10S44Cclr и log фазе), Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 50 мМ натрийфосфатэ, рН 8,0 с содержанием 0,5% Твин-20 (полиэтиленсорбитанмонолаурат), 1 мМ

PMSF (фенилметилсульфонилфторид) и

2,5 изопропанола, Клетки разрушают, 20 пропуская дважды через пресс давлением

20000 пси (1,38х10 Па). Эту суспензию цен-. трифугируют в течение 30 мин при 30000 g, Определяют полную концентрацик} протеинэ в надосадочной жидкости (неочищенные клетки в экстракте) с применением бычьей сыворотки в качестве стандарта. Наличие материала, связанного с HBsAg, определяют с помощью набора для радиоиммунного анализа (AUSRIA). Полученные результаты указывают, что pRIT12660 экспрессирует полипептид, обладающий антигенной активностью HBsAg.

В радиоиммунном анализе неочищенные клеточные экстракты из pRIT12660 дают положительную реакцию, тогда как неочищенные клеточные экстракты из pRIT12363 не дают положительной реакции.

Вышеприведенные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие

pRIT12660, экспрессируют HBsAg

AUSRIA активности в неочищенных клеточных экстрактах даны в табл.4.

Пример 20. Дрожжи, трансформированные pRIT22660, выращивают в селективной среде, либо в колбах Эрленмейера, либо в ферментерах в log фазе и собирают центрифугированием.

К клеткам (0,1 г) добавляют вначале 20 мкг 40 мМ PMSF в изопропаноле, а затем

200 мкл образца буфера для электрофореза на SDS-полиакриламидном геле (0,125 M трис-HCI, рН 6.8. содержащий 20% глицерина, 4 SDS, 6 M мочевины и 10% 2-меркаптоэтанола), Образцы вращают и аликвоты

2-20 мкл разбавляют далее в образце буфера до конечного объема 40 мкл, инкубируют в течение 5 мин при 100 С и обрабатывают электрофоретически.

После электроблоттинга протеинов на нитроцеллюлозном фильтре полученные фильтры предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37 С с 3% желатина в pBS.

Фильтр инкубируют с моноклональными антителэми к HBsAg и наличие связывания определяют последовательным инкубированием с биотинированным овечьим антимышиным Ig (разбавление 1/250 в PBS. содержащем 1% желатина), стептавидинбиотилированным комплексом пероксидазы хрена (разбавление 1/400 в PBS, содержащем 1 желатина) и, наконец, 30 мкл Н202 и HRP-реагентом проявления цвета. содержащим 4-хлор-1-нафтол, 30 мг в 10 мл метанола промывают PBS, содержащим

0,1 Твин-20.

Иммуноблот дает 4 полосы протеина, связанные с S-протеином определенного молекулярного веса 33, 30, 28 и 25 kd. Основную часть связанного с S материала обнаруживают в полосе протеина 33 kd.

Наименьшая детектируемая полоса протеина мигрирует медленнее, чем S протеин„ синтезированный в дрожжах.

Пример 21, Измельчают дрожжевые клетки в присутствии буфера (200 мМ трис, .

3 М NaCI. 10 мМ ЕДТАа, 10 мМ этиленгликоль-бис (бета-аминоэтиловый эфир) N, N, N, N-тетрауксусной кислоты (EGTA), 4 мМ

PMSF 10% изопропанола) с последующим центрифугированием в течение 45 мин при

30000.g.

Клеточные экстракты pRIT12660 частично очищают от клеточного экстракта ультрафильтрацией, CSCI равновесным центрифугированием и гидроксиапатитной хроматоГрафией 4 полосы протеина S-связанного материала детектируют на этих стадиях очистки анализом Вестерн-блат, очищают на этих стадиях очистки. Иммуноб,потный анализ AUSRIA положительных С$О фракций после равновесного центрифугирования показывает, что четыре $-связанные полосы присутствуют в тех же относительных соотношениях в каждой фракции.

Пример 22. Сывороточный альбумин человека полимеризуют глутаральдегидной обработкой и очищают, Очищенные клеточные лизаты pRIT122660 разделяют электрофорезом на акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозный фильтр последовательно инкубируют с PHS А (15 мкг) мл в PBS, содержащем 1% желатина), антисывороткой кролика к альбумину человека, биотинированным анти-кроличьим lg обезьяны (1/250 разбавление в РВ$, содержащем 1% желатина), стрепавидин-биотинированного

22

1746887

21 пероксидаэой хрена (1/400 разбавление в

PBS, содержащем 1 желатина) и, наконец, Н202 и 4-хлор-1-нафтол.

Две самые крупные S-связанные протеиновые полосы (33 kd и 30 kd) подвергают взаимодействию с рН SA, а две самые меленькие (28 и 25 kd) не дают реакции.

Пример 23. Синтезируют петид со следующей формулой: NHz-Met ОЬ-TrpAsn-Ser-Thr-Ala-Phe-Нls-Glï-Ala-Leu—

Gln-Asp — Pro-Arg-На! — Arg-Gly-Leu-Tyr Le

u-Pro — Ala, Gly — Cys — COOH. Кроликов иммунизируют подкожно 100 мкг конъюгата (что соответствует 20 мкг пептида) в полном адъюванте Фрейнда, повторно иммунизируют на 8 и 15 день следующими 10 мкг конъюгата в полном адъюванте Фрейнда, а на 28, 69 и

149 день 100 мкг конъюгата в РВ$. За выработкой титра антител следят, отбирая образцы крови через определенные промежутки времени, и проверяют разбавление сыворотки инкубированием на синтетическом полипептиде, фиксированном на твердой фазе. Связанные антитела детектируют иодированным протеином А. Сыворотку используют после 100-кратного разбавления или после частичной очистки IgG, IgG частично очищают осаждением Naz$04 (120 мг на 1 мл сыворотки), повторно суспендируют в PBS и переосаждают 14% Naz$04. Повторно суспендированный Ig раствор обессоли.вают, пропуская через PD 10 колонку, Определение реакционной способности протеинов в иммуноблотах осуществляют с помощью биотинированного анти-кроличьего Ig обезьяны, стрепатавидин-биотинированной пероксидазы хрена и Н202 и

4-хлор-1-нафтолом, Протеины из частично очищенных препаратов рИТ12660 выделяют электрофорезом. на S0S полиакриламидном геле и переносят на нитроцелл юлозу. Иммуноблот показал, что две более крупные полосы протеина (33 kd и 30 kd) реагируют с антителами.

Пример 24. Частично очищенный препарат диссоциируют с помощью SDS u протеины разделяют электрофорезом на акриламидном геле. После переноса протеинов на нитроцеллюлозу полученные мембраны инкубируют с десятикратно разбавленным гамма-глобулином гепатит В, ñîдержащим 1 желатина. Связывание антител определяют последовательным инкубированием с помощью биотинированного античеловеческого Ig овцы (1/250 разбавление в PBS, содержащим 1 желатина), стрептавидин-биотинированной пероксидазы хрена,,и наконец, HzOz u

4-хлор-1-нафтолом.

Две наиболее крупные протеиновые полосы (33 и 30 kd полосы) подвергают взаимодействию с антителами человека. две наименьшие (28 и 25 kd полосы) нв дают реакции. $ протеин, полученный из частиц из дрожжевых клеток, содержащих

pRIT12363. не взаимодействует с этими человеческими антителами.

0062опм - 0,2. Туникамицин добавляют до конечной концентрации 10 р г/мл и культу, ры инкубиоуют в течение 3 мин при 30 С.

45 Затем добавляют 20 рл CI S-метионина (1000 Cl/ììoëü) на 1 мл смеси и культуры инкубируют еще в течение 15 мин. Меченую клеточную культуру в количестве 2 мл, обработанную или необработанную туникамицином, центрифугируют s микрофуге и

50 спрессованные клетки повторно суспендируют в 40р 1 SDS, после чего их разрушают путем перемешивания в смесителе В течение 2 мин в присутствии 0,3 г стеклянных шариков (диаметр 0,45-0,50 мм).

Проводят иммунное осаждение. Лизат нагревают в течение 3 мин при 100 С. разбавляют 0,5 мл PBS, содержащей 1х Трито10 Пример 25. Рге $2-$ протеин из частично очищенных препаратов частиц из

pRIT12660, содержащих 10S 44С clr клетки, разделяют электрофоретически и переносят на нйгроцеллюлозу, Прогоняют на геле S

15 протеин, очищенный из дрожжей, содержащих pRIT12363 и HBsAg частиц из сыворотки инфицированных людей. 1/2 нитроцеллюлоэного фильтра инкубируют в

50 мкг/мл конканавалина А в 10 мМ трис рН

20 7,5, 150 мМ NaCI. t мМ CaClz, 1 мМ МпО2, 0;05 Твин-20 и затем 30 мкг/мл пероксидазы хрена в 10 MM трис рН 7,5, 150 мМ NaCI

0,05 Твин-20 и, наконец, HzOz и 4-хлор-1нафтола.

25 Между инкубациями фильтр промывают

10 мМ трис рН 7,5, 150 мМ NaCI, 0,05

Твин-20. Другую половину нитроцеллюлозного фильтра инкубируют с моноклональным антителом 6.

30 Полоса 33 kd протеина реагирует с коканавалин N-пероксидазными реагентами, хотя ни одна из полос протеина 30, 28, 25 kd из дрожжных клеток ° содержащих

pRIT12363, не реагирует. 8 присутствии 0,1

35 M метил-альфа-0-маннопиранозида связывания конкавалина А с 33 kd протеином не происходит.

Пример 26. Клетки, содержащие с

pRIT12660 и pRIT12377, выращивают в се40 лективной среде (YNB + 80 гlмл гистидина

/0C5 clr или YNB/10$44С clr до значения

1746887

20 гранулы повторно суспендируют в буферном растворе.

Образцы. содержащие 10 cpm, подвергают электрофорезу через 12,5% SDS полиакриламидный гель, После электрофореза гели фиксируют в 40%-ном метанольном растворе 10%-ной уксусной кислоты, обрабатывают для флюорографии, сушат на фильтроеальной бумаге в вакууме и подвергают флюорографии с использованием пленки при-70 С

B результате показано, что дрожжевые клетки, содержащие pRIT12660. синтезируют 33 kd протеин в отсутствии туникамицина и 30 kd протеин в присутствии туникамицина. Обе полосы отсутствуют в соответствующих образцах клеток, содержащих pRIT12377.

Полученные результаты показывают что

33 kd рге S2 — S протеин, экспрессированный в дрожжевых штаммах 065 ciro„èåñåò олигосахаридную часть, N-гликозидно-связанную с аспарагином.

Пример 27, Олигосахаридная структура.

Сырые клеточные экстракты клеток, содержащие pRIT12660 или частично очищенные препараты; содержащие pre S2-S частицы из таких экстрактов, обрабатывают эндо-N-.àùåòèëêëþêoçàìèHèäaçoé иэ

Streptomyces plicatus.

Частично очищенные частицы (50 мл, 450 мг/мл протеина) кипятят в течение 3 мин при 100 С л в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия, разбавляют 10 раз 100

M натрий-цитрата с рН 5 и к 240 мл такой смеси добавляют 2,4 мл эндо Н (74 мг/мл).

Образцы, содержащие и не содержащие андо Н, инкубируют в течение 2 ч при 37 С.

Анализ образцов, обработанных и не обработанных эндо Н, осуществляют с помощью

5G

55 на Х100, 0,5% деоксихолата 0,1% SDS u снова нагревают в течение 1 мин при 100 С.

К кипящему экстракту добавляют 25 мл

10%-ной суспензии предварительно промытого иммунопреципитина и систему ин- 5 кубируют в течение 30 мин при О С.

Полученную смесь осветляют центрифугированием в течение 5 мин на микрофуге. К верхнему слою жидкости добавляют 2,5 мл моноклонального антитела 6 специфичного 10 к S протеину полученную смесь инкубируют в течение 1 ч лри 0 С.. Затем добавляют еще одну порцию (25 мл) иммунопреципитина и полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при О С. Имунные комплексы собирают 15 центрифугированием (5 мин в микрофуге) и промывают PBS, содержащей 2 М мочевины, PBS, содержащей 1% 2-меркаптоэтанола, и наконец PBS. Окончательно промытые

SDS-поликриламидного гель-электрофореза и иммуноокрашивания с детекцией моно-. клональным антителом 6 к протеину S. позволил установить исчезновение полосы, соответствующей 33 kd, и появление полосы

31 kd в ходе обработки андо H. Полоса 31 kd продолжает реагировать с конканавалин Апероксидазными реагентами. Положение других полос (30, 28 и 25 kd) не изменяется в ходе обработки эндо Н. Аналогичные результаты получают и при более длительной инкубации или при более высоких концентрациях андо Н, Пример 28. Сырой дрожжевой экстракт, содержащий pre S2 S частицы, готовят измельчением дрожжевых клеток в присутствии эквивалентного весового количества экстракционного буфера, представляющего собой 50 mM фосфата натрия с рН

8,1 4 mM ЕДТА, 1,0% Таина-20, 4 mM PMSF и 10% изопропанола или 200 mM трис-HCI c рН 9,0, 3.0 M NaCI, 10 mM ЕДТА, 10 аМ

EGTA (этиленгликоль-бис-(бета)-аминоэтиловий эфир N, N, N, N -тетрауксусной кисI лоты), 1% Твина-20, 4 mM PMSF и 10% изопропанола, Устанавливают рК гомогената, равным

8,0 или 9,0 соответственно, и после этого его центрифугируют в течение 45 мин при

30000xg.

К 500 мл сырого дрожжевого экстракта с рН 7,2 добавляют 10 г коллоидного оксида кремния.

Коллоидную суспензию перемешивают в течение ночи при 4 С и затем центрифугируют с низкой скоростью вращения, Гранулы трижды промывают 150 мл 0,15 M раствора NaCI в течение 1/4 ч и затем периодически элюируют 250 мл 10 mM пирофосфатного буффера (рН 9,3), содержащего 2%

Твина-20, причем реакцию проводят в тече- . ние 3 ч лри 37 С. Десорбат, представляющий собой желтоватый, ярко опалесцирующий раствор, пропускают через 50 мл колонку с фенилборонатной агарозой, уравновешенную 10 mM раствором пирофосфатного буфера с рН 9,0. Объемная скорость 15 мл/ч.

Колонку дополнительно промывают 2 объемами уравновешивающего буфера и затем элюируют в обратном направлении 100

mM сорбита в 50 глМ трис (рН 7,2) лри объемной скорости 15 мл/ч. Элюирован-. ные целевые фракции сливают и после установления рН 8,1 пропускают через колонку с ДЕАЕ-фрактогель TSK, уравновешенную

50 аМ раствором трис с рН 8,2, Частицы элюируют тем же буфером, содержащим 75

mM NaCI. После этой стадии удаляют остав25

1746887

Пример 29. Аэросил-десорбат в количестве 50 мл пропускают через 5 мл.колонку с чечевичной агарозой, уравновешенной уравновешивающим буфером, (трис-буфер) в количестве 10 mM (рН. 7,2), 0,14 MNaCI u

0,3}(Твина. Колонку промывают двумя объемами уравновешивающего буфера 10 mM (рН 7,2) и затем элюируют сахаром, облада- 2 ющим специфичностью на чечевицу, таким как 0,5 М альфа-метилманнопиранозид в уравновешивающем буфере.

Результаты материального баланса представлены в табл.6.. 3

В результате исследования устанавливают, что гибридные частицы содержат -50 мкг Твина-20 на 100 мкг протеина, Пример ЗО. Иммуногенность частиц, полученных из экстрактов клеток. содержа- 3 щих pRIT12660, изучают на двух штаммах мышей: Ва!Ь/с(Н2-d) и NMRI (H -О), Перед инъекцией частицы адсорбируют на Al (ОН}3 и мышам (5 мышей на группу) внутрибрюшинно вводят по 0.3 мкг RIA реагирующего 4 материала. Через 1 мес после иммунизации мышей умертвляют, спускают кровь и сыворотку мышей одной группы сливают. Титр антител к S-белку в полученных препаратах . определяют с использованием набора 4

AUSAB (Аббот Лабс) и стандарта WHO, антитела к per-$2 пептиду определяют с использованием анализа в твердой фазе (RIA} согласно которому синтетический рге $2 пептид абсорбируют на пластмассе и свя- 5 занные антитела определяют с помощью анти-мышиного IgG кодона, меченого иэотопом l. Результаты, приведенные в табл,7, показывают, что экстракты дрожжевых клеток, содержащие рЮТI2660, индуцируют 5 анти-S pre S2 антитела в обоих штаммах мышей, причем у мышей штамма NMRI индуцируются более высокие титры анти-рге

S2 антител, чем у мышей штамма Balb/c.

Титр антител к S белку, полученный у мышей шиеся нуклеиновые кислоты (до содержания < 1 мкг/20 мкг протеина).

Результаты материального баланса представлены в табл.5.

Готовят материал, очищенный от экстрактов дрожжевых клеток, содержащих

pRIT12660, с последующим разновесным центрифугированием в присутствии CSCI, после чего этот материал подвергают исследованию на.электронном микроскопе после окрашивания его ацетатом уранила. B результате такого исследования обнаруживают наличие структур дискретных частиц с диаметром 19 мкм и установлено, что содержание таких гибридных частиц составляет

5 — 20 мкг.Твина-20 на 100 мкг протеина. штамма Balb/с или NMRI в 2-3 раза выше, чем титр, полученный при более высокой дозировке из дрожжевых клеток, содержащих pRIT12363.

5 Результаты по изучению иммуногенности, относящиеся к частицам Pre S2-S суммированы в табл.7.

Титр представляет собой разбавление, обеспечивающее значительное связывание

10 антитела (в 2,5 раза превышающее значение, полученное на отрицательной контрольной сыворотке).

Пример 31. Первая стадия представ. ляет собой слияние ТДНЗ промоторного

t5 участка соте SIN-термннааьним участком

НВЧ генома. Исходное вещество представляет собой плазмиду pRIT12792, содержащую фрагмент Ncol — Xbal размером 495 Ьр с

S1-Pre S2 кодирующей последовательно20 стью за исключением последнего аспарагинового кодона.

Оба фрагмента Ncol-Xbal, содержащиеся на pRIT12792 и pRIT12793, получают иэ

ДНК pre $1-pre $2 штамма. вируса гепатита

5 В (серотип ddw}; клонированного на плазмиде pRIT10616.

pRlT12792 в количестве 52 мкг гидролиэуют в присутствии Ncol u Xbal эндонуклеаз и обрабатывают нуклеазой фасоли с тем, 0 чтобы устранить 5> ответвления. Обработанный и очищенный 495 Ьр йсо1-Xbal фрагмент в количестве 600 и г (2 пмоль) лигатируют с 170 и r (0,02 пмоль) pRIT12314. вектора, предварительно линеаризованно5 го с помощью BamHI u Smal эндонуклеаз, и обрабатывают нуклеазой фасоли рЮТ12314 содержат полный 2 микронный фрагмент

S.cerevlsiae и ТДНЗ промотор, отделенный . от АРСЗ терминатора BamHI-Smal-EcoRt

0 линкером, BamHI EcoRI

Smal

ATGGATCCCCCGGAATC рТДНз tARCa

5 Лигированную смесь используют для трансформации Е.coll MM294, Отбирают шесть трансформантов, содержащих плаэмиду, в которой фрагмент S1-рге S2 вставлен в правильной ориентации. Получают

0 плазмиду pRIT12843 (а...f).

Следующая стадия заключается во внедрении в каждую из плазмид pRIT12843 (а...f) S кодирующего участка с целью перестройки всего рге S1-$2-$ гена.

5 Эту операцию проводят следующим образом.

Каждую из плазмид pRIT12843 (а.. f) гидролизуют в присутствии рестриктаз BamHI . и Salt. BamHI сайт помещают в начало pre

$2 участка, тогда как сайт Sall помещают

1746887

20

30

40 после APG3 терминатора в pBR 327. Самый крупный фрагмент BamHI-Sall(10.400 bp) e количестве 80 л г (0,012 ммоль), очищенный от плазмид pRIT12843 (а...f), лигируют с 300 п г (0;11 пмоль) фрагмента BamHI-Sall из

pRIT12660 4800 Ьр, фрагмент BamHI-Sall

pRIT12660 содержит часть pre S2-S кодирующей последовательности, за которой следует APG-терминаторные последовательности и IEY2 дрожжевая последовательность, После лигирования и трансформации штамма Е.соl! ММ294 каждой из плазмид

pRIT12843 (а...f) отбирают клоны, содержащие плазмиды, названные pRIT12845 (а., f).

Такие плазмиды pR 1712845 (а..Л) используют для трансформации $.cerevlslae штамма

10S 44С ciro. Скрининг культур, выросших из индивидуальных клонов трансформацией дрожжей, проводят путем испытания сырых клеточных экстрактов в наборе AYS

RIA. Сырые клеточные экстракты готовят путем разрушения дрожжевых клеток, ресуспендированных в PBS. содержащей 0,5%

Таина-20, 2 мМ PMSF и 5% изопропанола.

Испытывают по одному трансформанту из каждой из шести отдельных трансформаций в присутствии рй1T12845 (а..,f), Пять из шести испытанных трансформантов дают положительную реакцию при испытании AYS

R1A.

Образцы сырых экстрактов подвергают иммунологическому исследованию. Четыре из пяти трансформантов с положительной реакцией при испытании AYS RIA обнаруживают S-родственный протеин 39К. Один трансформант проявляет родственный протеин в.23 К, Пример 32. Готовят черые клеточные экстракты из дрожжевого штамма 10S 44С

clro, содержащие pRIT12845, pRIT12660 или

pRIT12377, и дрожжевого штамма ДС5с1го

Экстракты из штамма 105 44С clr, содержащие pRIT12843 и pRIT12660, показывают сильную антигенную активность HBsAg, которая отсутствует у экстрактов из штамма

10$44С clro, содержащего pRfT12377, или штамма ДС5 cir, содержащего pRIT12363.

Центрифугирование сырых клеточных экстрактов из 10S 44С clr клеток, содержащих pRIT12845, и измерение HBsAg антигенной активности методами AYS RIA в CSCI фракциях позволило обнаружить антиген с полосой около rho = 1,2 г/см ; Активность

CSCI фракций в отношении связывания с

pre $1 антителами испытывают с помощью анализа EL ISA, После того, как антиген свяжется с твердо-фазным анти-HBsAg, его инкубируют в присутствии моноклонального антитела МА18/7, которое далее детектируют с помощью биотинированного антимышиного Ig, стрепдэвидин-биотинированного комплекса пероксидазы хрена и.хромоге-, на.

Полученные результаты показывают, что pre $1-pre 52-протеин, продуцированный в 105 44С clr клетках, содержащих

pRIT12845, скапливается в частицы, аналогично частицам HBsAg, полученным из сыворотки.

Пример 33. Анализируют HBsAg родственные протеиновые мономеры, экспрессированные в клетках, содержащих р R IT12845.

Миграцию и иммунную реакционноспособность клеточных протеинов сравнивают с протеинами из HBsAg частиц, очищенных от человеческой сыворотки.

Для анализа протеинов используют три иммунореагента: — моноклональное антитело к $ эпитопу, — поливалентную антисыворотку кролика и pre S2 пептида, моноклональное антитело МА18/7, специфичное к pre 51 эпитопу.

Анализ иммуно-блотингом показал наличие среди клеточных протеинов клеток

10S 44С pRIT12845 двух протеинов, специфически реагирующих со всеси тремя иммунореагентами, описанными выше.

Устанавливают, что молекулярный вес двух таких протеинов составляет 38.000 и 45.000 дальтонов, pre S1 — pre S2-S протеин весом

38000 дальтонов мигрирует несколько быстрее,.чем р39 pre $1-рге S2-S протеин из

HBsAg частиц.

Данные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие pRIT12845, экспрессируют два протеина весом 38 и 45

kd, несущие pre 51, pre 52, а также S-эпитопы.

Пример 34, Дрожжевые клетки, содержащие pRIT12845, разрушают стеклянными шариками, взятыми в эквивалентном весе (диаметр 0,45 — 0,50 мм), в равном весе

10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 2%. 505 и 8 мМ ЕДТА, в результате перемешивания в смесителе.

После центрифугирования верхний слой в течение 4 мин нагревают при 100 С.

Жидкость из нагретого верхнего слоя в количестве 10 мкл разбавляют 40 мкл 25 мМ натрийцитратного буфера (рН 5,0) и добавляют 2 мкл EndoH (74 мкг/мл). Образцы, содержащие и не содержащие добавленный

EndoH, инкубируют в течение 2,5ч при 37ОС.

Обработанные и не обработанные

ЕпбоН образцы анализируют методом электрофореза на SDS-полиакриламидном геле и осуществляют иммуно-блотинг.

Пятно анализируют с помощью моноклонального антитела 6 МА18/7.

1746887

В соответствии с анализом методом иммуно-блотинга, как в случае моноклонального антитела 6, так и моноклонального антитела МА18/7, наблюдают исчезновение полосы, соответствующей 45kd и появление полосы 41 kd в ходе обработки ЕпбоН. Обработка .ЕпбоН не оказывает влияния на миграцию полосы 38 kd.

Эти результаты показывают, что pre S1pre $2-$ протеины с молекулярным весом 10

45 kd несут N-гликозидносвязанную олигосахаридную цепь высоко-маннозного типа.

П ри м е р 35. Клетки дрожжевого штамма 10$44С clr, содержащие pRIT12845, Клетки (20 мл культуры) метят в.течение

60 мин ImCI ЗН-меченой миристиновой-кислоты и затем собирают центрифугированием. Полученные клетки промывают 20 холодной Н О, ресуспендируют в 100 мл 3 мМ трис-HCI (pH 7,4). содержащего 3 мМ (ДТТ), 1 SDS и 1.мМ PMSF, и разрушают

100.мг стеклянны : шариков в результате шести 30-секундных стадий. интенсивного 25 перемешивания в смесителе, причем перед каждой стадией проводят охлаждение льдом. Осколки удаляют путем центрифуги-, рования в течение 1 мин на центрифуге.

Экстракт в количестве 20 мкл обрабатывают 30 в течение 3,5 ч при комнатной температуре

7 мкл свежеприготовленного 4 М гидроксиламина, 20 М глицина рН 10. . Образцы..обработанные и не обрабо35 танные гидроксиламином, подвергают электрофореэу íà SDS полиакриламидном геле.

Образцы, не обработанные гидроксиламином, подвергают анализу методом иммуноблотинга в присутствии моноклонального

40 антитела, распознающего $ эпитоп.

Методом -флюорографии устанавливают, что меченая полоса, соответствующая

38 kd, присутствует лишь в клеточном экстракте дрожжевых клеток, содержащих .

pRIT12845. Меченых полос, специфичных 45 для экстрактов иэ клеток,.содержащих

pRIT12550. не обнаруживают, . Эти результаты показывают, что pre S1S2-S протеин весом 38 kd содержит ковалентно-связанную миристиновую кислоту, 50 присутствующую в амидной связи. Как пра-. вило. миристат ковалентно связывается с протеинами путем амидной связи с аминотерминальным глицином. Этот факт позволяет предположить, что инициирующий кодон для Met удален из pre $1 рге S2-S протеина и что Gly остаток в положении 2 доступен для ациллирования миристиновой кислотой.

pRIT12660, или pRIT12377, выращивают в 15

YNB до знэчения ОДао нм порядка 0.4;

Пример 36. Плазмида pRIT12793 содержит рге $ 1-рге S2 кодирующую последовательность ía Ncol-Xbal фрагменте размером в 495 bp. ДНК плазмиды рй!Т12793 гидролизуют в присутствии эндонуклеазы

Neo!, обрабатывают Т4 ДНК полимеразой для заполнения липких концов и далее гидролизуют в присутствии ХЬа! эндонуклеазы, Фрагмент Ncol/Т4 ДНК полимераза/ХЬа! очищают злектрофорезом на полиакриламидном геле и электроэлюированием и встраивают в вектор рУС12, предварительно обработанный Smal u Xbal эндонуклеазами. ЕДинственный Bst Х сайт присутствует. на N-конце рге Sl кодирующего участка.

Экзогенные кодирующие последовательности ДНК могут быть введены путем гидролиза pRITX и ее производных эндонуклеазами Bst X u BamHI или EcoRI или Pst I и встраивание этой кодирующей последовательности между этими сайтами, в результате чего происходит удаление большей части рге Sl кодирующего участка и N-терминальной части рге $2 последовательности, После получения таких конструкций они могут быть рекомбинированы в другие плазмиды, содержащие остаток pre $1-pre S2 последовательностей, необходимых для сохранения и репликации в Е.coll u S.cerevlclae.

Из таких геномных клонов HIY вируса получают различные субфрагменты. как рге

S2-$ ДНК .кодирующие последовательности. Такие гибридные частицы служат основной вакцины для защиты людей от инфицирующего агента HIY.

Исходный материал представляет собой плазмиду рВН10-R2. содержащую геном HIY изолята ВН10. 3108 Ьр Sall-Xhol фрагмент ДНК вирусного происхождения вырезают из рВН10-R2 и клонируют между

Sall u Xho! сайтами плазмиды рУС18 и получают плазмиды pRIT12901.

ДНК pRIT12901 гидролизуют эндонуклеазами В9!!! и МЬо!! и фрагмент размером

117 bp выделяют электрофорезом на акриламидном геле и электроэлюированием.

ДНК фрагмента обрабатывают нуклеазой фасоли с целью удаления однонитевых ответвлений и лигатируют с ДНК pRIT10911, . которую переваривают эндонуклеазой

8amHI и обрабатывают нуклеазой фасоли.

Из лигированной смеси выделяют плаэмиду рЮТ12893, в которой фрагмент Bglll-МЬо!! . размером в 117 Ьр иэ pRIT12901 встраивают на pRIT10911; Определяют нуклеотидную последовательность ТДНЗ протомора, слитого с фрагментом HTIY-III BgIII-Mboll размером 117 Ьр. Устанавливают, что такая последовательность имеет вид:

5 ATCCACCAGGACATATCACCCA 3, 31

1746887

10

5 GATCTCGACAGGCCCGAA GGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA 3

3 AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT 5

5 GACAGAGAGAGATCCCCG 3

3 CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC 5

45 где первый ATG кодон представляет собой фрагмент ТНДЗ промоторного участка

pRIT10911, а вторая группа представляет собой внутренний ATG кодо С7 пептидного фрагмента, Второй ATG кодон перекрывает

TGA терминальный кодон. Такой кодон термииации находится в той же рамке считывания, что и первый ATG кодон. Определение последовательности ДНК 3 участка на

pRIT12893 позволила установить правильную последовательность слияния, обработанную нуклеазой фасоли Mboll конца

HTIY/111 фрагмента с pre S2 последовательностью на pRIT10911.

Затем ДНК pRIT12893 обрабатывают в присутствии Hind lll эндонуклеазы и выделяют фрагмент размером 3250 Ьр, который очищают электрофорезом на агарозагепе и электроэлюированием. Затем фрагмент

Hind П! размером 3250 Ьр вставляют в Hind

I II сайт плазмиды УЕ р13 с целью получения . pRIT12894. ДНК плазмиды используют для трансформации клеток дрожжевых штаммов ДС5 и 10$44С.

Транскрипция и трансляция в дрожжевых клетках С7 слитого -pre S2 — S белка ДН К. на pRIT12894 приводит в результате к синтезу пептида на 5 остатков, начинающегося с ТДНЗ кодона, а также С7 — pre $2-спитого пептида, начинающегося иа втором внутреннем ATG кодоне С7 последовательности, Такое слияние содержит 38 аминокислотных остатков С7 пептида вместо 45 остатков

Этот фрагмент имеет 5 Bgl и 3 BamHI однонитевые концы. Примерно 20 r двухни. тевого фрагмента и 300 и r ДНК плазмиды

pRIT10911, обработанной BamHI смешива. ют и лигируют. Идентифицируют лазмиду

pRIT12898, выделяют ее и внедряют в нее фрагмент.размером. 60 Ьр на сайте BamHI

pRIT10911..ДНК pRIT12899 гидролизуют с

Hind IП эндонуклеазой и Hind П1 фрагмент размером 3200 Ьр очищают электрофорезом на агарозовом геле и электроэлюированием.

Hind ill фрагмент вставляют íà Hind IИ сайт

УЕр13, получают плазмиду pRIT12900. Затем ДНК плазмиды рй1Т12900 используют для трансформации дрожжевых штаммов

ДС5 и 10$44С.

Пример 38. Дрожжевые штаммы ДС5 или 10S 44С, содержащие УЕр13, pRIT10912, интактивного Bglll Mboll — обработанного нуклеэзой фасоли С7 фрагмента.. ДНК pRIT12901 гидролизуют в присутствии эндонуклеаз Hhal и Н! пб1И, выделяют фрагмент размером 230 Ьр. Этот фрагмент очищают электрофорезом на акриламидном геле и электроэлюированием и обрабатывают ДНК полимеразой с целью заполнения однонитевых ответвлений. Обработанный таким образом фрагмент вновь лигируют с

ДНК pRIT10911, которую обрабатывают

BamHI и нуклеазой фасоли, Из лигированной смеси идентифицируют плазмиду

pRlT12897, в которую встраивают фрагмент

HtY ДНК размером 230 Ьр в правильной рамке считывания с целью слияния с pre $2 последо вател ь ностью pR IT10911. Затем

ДНК плазмиды pRIT12897 гидролизуют с

Hind III эндонуклеазой и фрагмент размером 3365 Ьр. содержащий ТДНЗ промотор, HIV-pre $2 — S, АР63 терминатор, очищают электрофорезом на эгарозовом геле и электроэлюированием. Такой 365 bp фрагмент лигируют с плазмидой УЕр13 гидролизованиой с Hind III эндонуклеазой и получают

pRIT12898. ДНК плазмиды (pRIT12898) используют дпя трансформации клеток дрож-. жевых штаммов ДС5 и 10S 44С.

Фрагмент синтетической ДНК размером 60 Ьр, синтезируют традиционными способами в виде двух единичных нитей. которые затем подвергают совместной ренатурации;

pRIT12894 или pRIT12898, выращивают в жидкой среде. не содержащей лейцина (YNB + 80 мкгlмл гистидина или YNB) и клеточные протеины анализируют методом

40 иммуноблотинга, используя в качестве первого антитела моноклональное антитело к эпитопу HBsAg человека. pRIT12894, pRIT12363 несет S ген HBV, слитый с ТДНЗ промотором в виде фрагмента Hind Пl размером 2900 Ьр из pRIT12322, внедренного в дрожжевую векторную плазмиду, идентичную pRIT12377, и продуцирует HBsAg под контролем ТДНЗ промотора. Методом иммуно-блотиигэ обнаруживают полосу, 50.родственную S протеину с молекулярным весом порядка 32 kd среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС5 или 10S 44С, трансформи34

1746887

Таблица 1

Таблица 2 рованных с помощью pRIT12894. Полоса. относящаяся к S протеину с молекулярным весом порядка 45 kd, присутствует среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС5 или 10$44С, содержащих рИ Т12898, тогда как полоса, относящаяся к протеину S молекулярного веса порядка 29

kd, присутствует среди клеточных протеинов иэ дрожжевого штамма ДС5, содержащего pRIT10912, Готовят сырые клеточные экстракты из дрожжевого штамма ДС5. содержащие или

pRIT12363, pRIT10912 или рВТ12894. Измеряют концентрацию протеина и активность по AYS RIA. Осуществляют анализ этих экстрактов методом иммуноблотинга.

CSCI центрифугирование сырых экстрактов и измерение HBsAg антигенности методом АУ$ RIA в CSCI фракциях позволяет обнаружить антиген. соответствующий полосе около rho = 1,2 г/см . Этот результат з подтверждают методом иммуно-блотинга

CSCI фракций, Дрожжевые клетки штаммов ДС5 и 10S

5 44С, трансформированные или pRIT12894 или pRIT12898, синтезируют слитый протеин с молекулярным весом порядка 32 и 45

Мб, оба из которых несут S этитоп.

Формула изобретения

10 . Способ получения гибридного полипептида, содержащего HBsAg, предусматривающий конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующим слитый полипейгид, трансформацию полученными

15 ДНК штаммов Saccharomyces cerevlslae, выделение и очистку целевого продукта, о тл и ч а ю шийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК

pRIT12573, или pRIT12574, трансформируют

20 штаммы S.cerevlsiae 1044С или ДС5.

* ГликоЗилирован недостаточно для удерживания на колонке.

3746887

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

1746887

Таблица 7

** Титр анти-S антител.

m IY/ìë

+"+Анти-рге $2 антитела

* Доза Sродственного антигена, мкг

Вводимые препараты

BaIb/с

NMRI

Balb/с

NMRI

1404 . 748

0

719

1163

1,7

1,55

120

2418

3344

0.3

TI. 2660

* Определение осуществляют с использованием AYS RIA.

** Определение осуществляют с использованием набора АЧ$ АВ.

*** Определение осуществляют с применением радиационно-иммунологического анализа в твердой фазе и синтетического pre $2 пептида, адсорбированного на пластмассе.

Редактор Н.Гунько

Заказ 2406 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101Частица дрожжей, управляемая pRITI2363

Частица дрожжей, управляемая pRITI2363+ синтетический pre 8 2 пептид:

0,08 мкг

Синтетический pre $2 пептид:

0,08 мкг .pre S 2-$ частица дрожжей, управляемая

Составитель Н.Кузенкова

Техред М.Моргентал Корректор О.Кундрик