Рекомбинантная плазмидная днк pfrblv - f6, кодирующая белок оболочки бактериофага @ и белок @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент белка оболочки бактериофага @ и белка @ 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии . Целью изобретения является получение слитого белка, обладающего активностью белка оболочки бактериофага fr и белка др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота Получена рекомбинантная плазмидная ДНК pFRBLV-F6, которая состоит из векторной плазмиды pFR 20, несущей ген белка оболочки бактериофага fr под контролем промотора триптофанового оперона, и фрагмента гена др 51 вируса лейкоза крупного рогатого Скота длиной 147 п.о. внедренного в ген белка оболочки по сайту EcoRV, соответствующему второй аминокислоте белка оболочки, с сохранением фаз трансляции как гена др 51, так и гена белка оболочки, белой fr CP-BLVflp 51 состоит из 130 аминокислот белка оболочки и 48 аминокислот др 51 и обладает антигенными свойствами обоих белков. Получен штамм Е coli K802, несущий плазмиду pFRBLV-F6. 3 с.п. ф-лы, 2 табл сл

„„ДЦ „„1751208 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 N 15/33, 15/70

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР. к

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 2 (21) 4745577/13: .- . .. (57) Изобретение относится к микробиоло(22) 10.08.89 ......, ., гической промышленности и биотехноло(46) 30.07.92. Бюл. М 28 : . гии, Целью изобретения является получение (71) Институт органического синтеза слитого белка, обладающего активностью

АН ЛатвССР и Отдел медицины (Шарите) белка оболочки бактериофага fr и белка др

Университета Гумбольдта (Берлин) (ОЕ) 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. (72) Райнер Ульрих, Хельга Сиаккоу, Корне- Получена рекомбинантная плазмидная ДНК лия Платцер, Зинаида Розенталь. Ханс Аль- pFRBLV-F6, которая состоит из векторной фред Розенталь {DE),T. M. Козловская, плазмиды pFR 20, несущей ген белка обоИ. В. Соминская, Д. Э, Дрейлиня, А. Я. Бре- лочки бактериофага fr под контролем проде, l0. А. Озолс, П; М; Пушко, П. П. Пумпея мотора триптофанового оперона, и и Э. Я. Грен .." ..: . ... фрагмента гена др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота длиной 147 п.о. внед(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ренного в ген белка оболочки по сайту

ДНК pFRBLV-FG, КОДИРУ10ЩАЯ ДЕЛОК ЕсойЧ, соответствующему второй аминоОБОЛОЧКИ БАКТЕРОФАГА FZ И БЕЛОК кислоте белка оболочки, с сохранением фаз

ДР 51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО трайсляции как гена др 51; так и гена белка

РОГАТОГО СКОТА. СПОСОБ EE КОНСТ- .. оболочки, белок fr.СР-BLVдр 51 состоит из

РУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ 130 аминокислот белка оболочки и 48 амиESCHERfCHlA COLI ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА нокислот др 51 и обладает антигенными

ОБОЛОЧКИ БАКТЕРИОФАГА FR И БЕЛКА свойствамиобоихбелков,Получей штамм Е.

ДР51 ВИРУСАЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГА- сои К802, несущий плазмиду pFRBLV-F6. 3

ТОТО СКОТА,: с.п. ф-лы, 2 табл. (л линустойчивости, протяженностью 5279

° и п,о., Bglll-BamHI фрагмента ДНК il. HVI, ко- C) дирующего участок последовательности др Сб

51 (49 аминокислот), соответствующий 56103 аминокислотам зрелосо др 51 и содержащего нейтрализующий эпитоп с прилежащими аминокислотами и иммунологический эпитоп — сайт узнавания моноклональных антител вАК14, протяженностью 147 п.о.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pFRBLV-F6 входят гены; ген fr CP-BLV др 51, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка, Изобретение относится к микробиологической промышлен ности и биотехнологии.

Целью изобретения является получение слитого белка, обладающего активностью белка оболочки бактериофага fr и белка др

51 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Сконструирована рекомбинантная плазмида рРВВО/-F6, которая состоит из следующих элелментов:

ДНК плазмиды pRF 20 несущей полный ген бактериофага fr c внедренным по второй аминокислоте по уникальному сайту рестрикции EcoRV и делецией в гене тетрацик1751208 ген bla, обеспечивающий устойчивость 12 С. После переосаждения этанолом ДНК . к ампициллину. Ген fr CP-BLV др 51 нахо- растворяют в 10 мкл воды (ДНК 1). дится под контролем промотора trp. 2 мкг плазмиды pFR 20 расщепляют 3

ПлазмидарРЯВЮ-Рбамплифицируется ед, рестриктазы EcoRV в15 мкл раствора В, при добавлении в среду хлорамфеникола, 5 содержащего 0,01 М трис-НС1,.рН 7,5, 0,05 неконъюгативна. M NaCl и 0,01 М MgCIz, в течение 1 ч при

Сущность способа конструирования 37 С, наносят инкубационную смесь на плазмиды pFRBLV-F6 состоит в том, что 1,5%-ный агарозный гель,.Фрагмент, соотфрагмент гена др 51 вируса лейкоза внедря- ветствующий линеариэован ной плазмиде ется во вторую аминокислоту белка оболоч- 10 pFR 20, выделяют из агарозного геля ки fr с образованием рекомбинантного гена (ДНК 2), .

fr CP-BLV др 51..-... „0,1 мкг ДНК 1 и 0,1 мкг ДНК 2 сшйвают

Штамм-продуцент получают трансфор- Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содер мацией клеток Е. соИ К802 рекомбфМнтной жащего 0,05 M трис-НСI, рН 7,5, 0,01 М плазмйдной ДНК pFRBLV-F6,:;: ;-. " 15 MQClz, 0,01. M дитиотрейтол, 50 мкМ ATP u

Штамм характеризуется следующими 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при йризнаками, 4 С, Фермент йнактивируют нагреванием

Морфологические йризнаки: клетки па- при 65 С в течение 15 мин, Y. реакционной лочковидной формы, грамотрицательные. смеси добавляют 100 мкл клеток Е; соИ RR1, Культуральные признаки: клетки растут 20 обработанных 0 1 M СаС12 (конечная конна обычйо используемых питательных сре- центрация 5 х 10 клеток/мл), для трансфордах, образуют колойии средней величины.. .. - " мации клеток. .Физико-биохимические признаки: оп -: Отбор клонов осуществляют путем тимальная температура культивирования "" экспресс-выделения и секвенирования, 37ОС, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источ- 25 плазмиднбй ДЙ К, выделенной экспрессника углерода используют углеводы, в каче- .. методом. Плаэмида с ожидаемой последостве источника азота.— минеральйыа соли, а . вательностью получает наименование также органические соединенйч :в::виде пеп- pFRBLV-F6. тойа, трйптона, аминокислот; -,.:- : ::, Штамм-продуцент Е. coli К802 (pFRBLVУстойчивость к антибиотйк;, tj" устойчив 30 F6). к ампициллину, что обусловле ",." ",íàëè÷èåì Штамм-продуцент получают трансфорплазмиды. Присутствие в штамме плазмид- мацией клеток Е, co!i К802 рекомбинантной.. ной ДНК подтверждается путем проверки плазмидой pFRBLV-F6. Клетки выращивают устойчивости к ампициллину, а также путем в солевой среде М9 с добавкой. г/л: казамивыделения и анализа плазмидных ДНК экс- 35 новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин пресс-методом. 0,02 до оптйческой плотности ОП щ = 4-5.

Продуктивность штамма составляет Определение др 51- и fr-активности ме0,5% целевого продукта от общего клеточ-, тодом иммуноблотинга. ного белка. Для иммуноблотинга клетки (6 мг) сусШтамм депойирован в коллекции Цент- .40 пендируют в 100 мкл буфера для нанесения рального музея промышленных микроорга- образцов на полиакриламидный гель по низмов под номером ВКПМ В-4984..:., JizvMnv, содержащего 2%-ный додецил Пример 1, Конструирование реком-,,": ::сульфат натрия (ДСН) и 2%-ный 3-меркапто- . бинантной плаэмидйой ДНК р1=ВВ В-F6.,:: ",:этанол, и лизируют 2 мин прогреванием на

20 мкг ДНК плаэмиды, содержащей ч4Ь." ипящей водяной бане. Полученные лизаты

В9И! — BamHI фрагмент др 51 и выделенной-,-:„-::;(? — 4 мг/мл белка) наносят на полиакриластандартным методом, расщепляют 50 ед.:мидный градиентный гель (12-23%) размерестриктазы Вц!!! и 50 ед. рестриктазы ".:.„.:,ром 150х150х0,75 мм, Электрофорез

Вап Н! в 100 мкл раствора А, содержащего::: пооводят в течение -,15 ч при силе тока 7 мА.

0,1 M трис-НС1, рН 7,5, 0,05 M NaCI и 0.01 M 50 После электрофореза белки переносят на . MQCiq, в течение 2 ч при 37 С. Рестриктаэы нитроцеллюлозу. инактивируют 15 мин прогревайием при Фильтрыинкубируютсмоноклональны65ОС. После очистки ДНК В9И! — BamHI фраг- ми анти- др 51 антителами mAK 14 в развемента на агарозном геле ДНК растворяют в дении 1:500 на буфере TBS, содержащем 20 мкл воды, Заполнейие концов проводят 55 50 MM трис-НСI, рН 7,5, 0,15 M NaCI, 0,1% в 100 мкл раствора Б. содержащего 0,05 M тритон Х100, 1% БСА, в течение 15 ч при трис-HCI, pH 7,5, 0,01 MgCI2, 0,01 М дитиот- 20 С, После трехкратной отмывки буфером рейтол,0,025 MNaCI, 100 мкМ dATP, dCTP, TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20 С с бТТН и dQTP и 10 ед, ДНК-полимеразы E. коньюгатом пероксидазы с антителами npocoll (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при тив иммуноглобулинов мыши в разведении

1751208

1:500. Фильтры отмывают буфером TBS (3 — но. Иньекции антигена повторяют на 14 и 21

5 раз) и проявляют диаминобензидином. В день и с 28 дня начинают брать кровь, Спепараллельной постановке фильтры инкуби- цифичность антител определяют методом руют с анти- fr CP антителами кролика в ИФА с использованием двух антигенов: fr разведении 1:200 на буфере TBS в течение 5 CP (для определения анти- fr CP антител), 15 ч при 20 С. После двукратной отмывки НВ с Ag — др 51 (для определения а ти- др буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 51 антител). Титры антител на 28 день имму20 С с конъюгатом пероксидазы. с белком А низации приведены в табл, 2.

S. aureus. Лизаты клеток штамма-продуцен- .. Таким образом; изобретение позволяет та обнаружйвают в обоих случаях специфи- 10 получить слитый белок оболочки РНК-соческие зоны окраски, соответствующие держащего бактериофага fr и оболочки ви- белку с мол.м. 19,32 кДа (или длиной 184 руса лейкоза крупного рогатого скота, аминокислот). Контрольные лизаты клеток обладающий иммунологической активноE. соИ К802 таких зон не обнаруживают;" стью как по белку бактериофага fr, так и

Пример 2. Определение др 51-актив- 15 белку др 51 чируса лейкоза крупного роганости в составе слйтого белка fr СР-BLVдр того скота.

51 методом энзимоиммунологического анализа натвердойфаэе.. -. - Формула изобретения

В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для 20 1. Рекомбйнантная; плаэмиднэя ДНК иммунологических реакций. Очищенный бе- pFRBLV-F6, кодирующая белок оболочки лок fr CP-BLV др 51 разводят до концентра- бактериофага fr и белок др 51: вируса лейкоции10мкгlмл в50MMтрис-НCI, рН 8,0,0,15 за крупного скота„"размером 5426 п.о, и

М NaCI и вносят в лунки планшетов — rio 100 мол.м. 3,48 МДа, содержащая . мкл в каждую, Инкубируют 1 ч при 37 С, 25 . EcoRV.— EcoRV. фрагмент ДНК плазмипосле чего раствор удаляют иэ лунок, план-: ды pFR 20 размером 5279 п.о., шеты отмывают 4-5 раз дистиллированной . Bglll — BamHI — фрагментДНКАНЧ1, ководой и высушивают, В лунки вносят моно- дирующий белок др 51 вируса лейкоза крупклональныеанти-др51антитела(мыши)или ного рогатого скота и белок оболочки поликлональные анти- fr антитела (кролика) 30 PHK-содержащего бактериофага fr, размев различных разведениях. После инкубации ром 147 п.о., в течение 1 ч при 37 С планшеты отмывают уникальные сайты рестрикции с коордидистиллированной водой и вносят по 100 натами: мкл конъюгата пероксидаэы хрена с антите- ВзрМ11 — . . 0 (начало координат) лами против иммуноглобулинов кролика .35 Pstl — . 1947 или мыши в разведении 1:500. После инку- Seal — 2182 бации в течение 1 ч планшеты отмывают и Hpal — . 3640 проводят цветную реакцию. В лунки. вносят Mstll— 3885 по 100 мкл 0,25;4-ного раствора ортофени- Sacl — 4580 лендиамина,2 М HCI â 0,1 М цитрате натрия, 40 Aval — 4801, .рН 5,0, 0,02- Hz0z, инкубируют 30 мий при генетические маркерй и регуляторные уча20 С, реакцию останавливают добавлением стки:

100 мкл 01 í.HCI. Появление коричневой ген Ыа, обеспечивающий устойчивость окраски свидетельствует о наличии антиген- к ампициллину координаты 1629 — 2489, ной активности, для количественной оценки 45 Ptrp — промотор координаты 3635 — 2648. активности измеряют оптическую плотность при 492 нм (табл. 1). Отсутствие реак-. 2. Способ конструирования рекомбиции в отрицательном контроле (fr CP) нантной плазмидной ДНК pFRBLV-F6, коди- свидетельствуето специфичности связыва- рующей белок оболочки бактериофага ния анти- др 51, антител рекомбинантным 50 fr и белок др 51 вируса лейкоза крупнобелком fr СР-BLV др 51. го рогатого скота, включающий гидролиз

Пример 3. Иммуногеннаяактивность ДНК il. HNI рестриктазами Bglll и BamHI, слитого белка fr СР-BLV др 51, обработку гидролизата ДНК-полимеразой

Для определения иммуногенности Е, coll, лигирование фрагментов ДНК с ДНК рекомбинантным белком fr СР-BLV др 51 55 плазмиды pFR 20, обработанной рестрикта- иммунизируют кроликов. Для этого смеши- зой EcoRV, трансформацию полученной ливают2 мгбелка, растворенного в1 млфизи-. газной смесью клеток Е, coll RRI, отбор ологического раствора РВ$, с 1,25 мл путем секвенирования клонов, несущих полного адъюванта Фрейнда и получают го. плазмиду FRBLV-F6. могенную эмульсию. Белок вводят подкож7 8

Д, Штамм бактерий Escherlchia соП бактериофага fr и белка др 51 вируса лейкоBKÏÌ В 4984-продуцент белка оболочки за крупного рогатого скота.

1751208

Таблица 1

Сорбированный антиген

Имм нологическая активность. ОП492/мл анти- 51 анти-f CP

fr СР-BLVgp 51

frCP конт оль

0,50

0,85

0,45

0,01

1,у

Титр антител в ИФА черед 28 дней после иммунизации кроликов

Антиген для иммунизации анти-fr СР анти- 51

10-4

frCP

fr СР-BLV 51

10-3

Составитель Т,Забойкина

Редактор Л.Павлова Техред M.Ìîðãåíòàë, Корректор С,Пекарь

Заказ 2665 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101. Иммуногенность рекомбинантного белка fr СР-BLVgp 51

I .Таблица 2