Устройство для хроматографической аффинной очистки ферментных препаратов

 

Использование: получение чистых ферментных препаратов в микробиологических и химических производствах. Сущность изобретения: устройство содержит корпус с размещенным в нем сорбентом, который заключен в слои объемной волокнистой сетчатой ткани, размещенной в виде пакета между перфорированными перегородками. Под нижней перегородкой размещен разбрызгиватель для подвода промывной воды, 2 ил.

союз соВетских социАлистических

РЕСПУБЛИК (19) ()1) (5!)5 С 12 М 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4788171/13 (22) 30.10.89 (46) 07.08.92,Бюл, М 29 (71) МГУ им. M,В.Ломоносова и Ладыжинское производственное биофармацевтическое объединение "Энзим" (72) Е.Ф.Григорьев, Г.H.Ðóäåíñêàÿ, В.В.Болоховский, Л,В.Удовенко, В.M.Ñòåïàíîâ, А,С.Ôåäoñååâ и О.Г.Купенко

{56) Авторское свидетельство СССР

N 942427, кл. С 12 N 9/50, 1978, Патент CLUA

М 4627.918, кл.. В 01 D 15/08, 1986 r, Изобретение относится к технике йолучения чистых ферментов в микробиологических и биохимических производствах, конкретно к устройствам для аффинной хроматографии, в частности для аффинной хроматографии ферментов, в том числе протеолитических.

В лабораториях процесс аффинной хроматографии осуществляют в обычных стеклянных или пластмассовых хроматографических колонках цилиндрической формы диаметром 0,5-1,5 см и высотой 5-25 см, имеющих входное и выходное отверстия.

Сорбент помещен на фильтре, расположенном в нижнем конце колонки. Такое устройстао дает возможность получать очищенйые ферменты с выходом до 100%.

Однако такие устройства (колонки) неприменимы в условиях крупного производства ввиду большого сопротивления слоя сорбента в колонке и неизбежного уменьшения скорости фильтрации. Кроме того, для регенерации сорбента после аффинной хроматографии ферментов культуральных (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ АФФИННОЙ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЦХ ПРЕПАРАТОВ (57) Использование: получение чистых ферментных препаратов в микробиологических и химических производствах. Сущность изобретения: устройство содержит корпус с размещенным в нем сорбентом, который заключен в слои объемной волокнистой сетчатой ткани, размещенной в виде пакета между перфорированными перегородками.

Под нижней перегородкой размещен раэбрыэгиватель для подвода и ромы вной воды, 2 ил. Г жидкостей микроорганизмов необходимо каждый раз удалять сорбент из колонки для устранения нерастворимых примесей, содержащихся в культуральной жидкостей, что создает дополнительные затраты времени, труда и снижает эффективность процесса.

Наиболее близким к предлагаемому устройству по технической сущности и достигаемому результату является колонка для радиальной хроматографии, корйус которой произвольной формы с двумя крышками сверху и снизу на фланцевом соединении, крышки снабжены входным и выходным отверстиями. Через центр колонки проходит стержень. На верхней крышке с внутренней стороны в радиальном направлении от входного отверстия отходят трубки, Вдоль внутренних стенок камеры расположены кольцеобразные каналы. Вдоль центрального стержня проходят каналы для сбора вытекающей жидкости и удаления ее через сливной кран, расположенный на нижней крышке колонки.

1752756

25

35 ного производства, особенно в случае 40

55

Сорбент для хроматографического разделения помещается внутри камеры между двумя пористыми фильтрами из полиэтилена, тефлона, полипропилена, которые соприкасаются с кольцеобразными каналами.

В качестве сорбента может быть использована агароза, полиакриламид, целлюлоза.

Жидкость поступает в аппарат через входное отверстие и по радиальным каналам в верхней крышке протекает в кольцеобразный канал, а затем через пористый фильтр поступает в сорбент в горизонтальном направлении. Пройдя через слой сорбента, жидкость проникает через фильтр, примыкающий к выводному каналу, окружающему центральный стержень, и удаляется через нижнее сливное отверстие.

Недостатком известной конструкции является сложная в исполнении и эксплуатации система трубок.и каналов, проходящих через устройство. Кроме того, устройство предназначено для работы с дорогостоящими импортными сорбентами, не экономичными в условиях производства.

Проведение хроматографии в горизонтальном направлении и применение сорбентов со значительной механической прочностью несколько облегчает- проведение процесса в большем объеме, чем в лабораториях, но не снимает проблемы масштабирования хроматографического процесса для промышленного производства, так как значительное увеличение количества сорбента, расположенного в один слой, неизбежно приводит к возрастанию сопротивления слоя сорбента жидкости и снижению эффективности процесса, Не разработана система промывки и регенерации сорбента в условиях промышленочистки ферментов из культуральных жидкостей микроорганизмов и других,биологических жидкостей или экстрактов, содержащих многочисленные белковые, углеводные и другие примеси, которые в ряде случаев могут вызывать различные помутнения и заби вать поры фильтров и сорбентов.

Целью изобретения является повышение производительности за счет ускорения процесса хроматографии и регенерации сорбента и увеличение активности конечного ферментного препарата.

Указанная цель достигается тем, что в устройстве сорбент заключен в объемную волокнистую сетчатую ткань, размещенную горизонтальными слоями по высоте корпуса колонны в виде пакетов, каждый из которых укреплен между двумя горизонтальными перфорированными перегородками, цилиндрический корпус устройства выполнен из

15 нержавеющей стали, рассчитан на работу под давлением, состоит из двух частей, из которых верхняя выполнена в виде цилиндра с конусом, снабженным патрубком для подвода жидкости, нижняя выполнена в виде конуса, внутри которого под нижней перфорированной перегородкой размещен разбрыэгиватель. снабженный патрубком для подвода промывной жидкости, и патрубок для отвода жидкости. расположенный на боковой поверхности конуса.

В предлагаемом устройстве могут быть использованы как аффинные сорбенты на основе известных матриц, так и другие аффинные сорбенты, в том числе синтезированные на основе макропористых кремнеземов — аэросила, силохрома, а также силикагеля. Такие матрицы обладают рядом преимуществ перед известными, так как у них на порядок лучше гидродинамические свойства, они не подвергаются разрушению ферментами микроорганизмов, значительно более дешевы и экономичны.

Однако сорбенты на основе кремнезема довольно хрупкие и при работе в большом слое могут разрушаться. Использование высокообъемной синтетической ткани для защиты гранул сорбента от повреждения делает возможным значительное увеличение объема устройства и работу под давлением. Полужесткая структура ткани обеспечивает высокую прочность и стабильную работу устройства и позволяет повысить скорость протекания жидкостей вместо обычных для колоночной хроматографии 510 до 200-1000 мл/мин. В случае повреждения одного или нескольких. кусков ткани их легко заменить новыми, не затрагивая остальные, В предлагаемом устройстве предусмотрена система промывки и регенерации сорбента, которую осуществляют с помощью разбрызгивателя, помещенного в нижней части устройства, Жидкость проходит снизу вверх, смывая отложения части белковых и других примесей как с сорбента, так и с поверхности ткани.

На фиг. 1 изображено устройство, продольный разрез; на фиг. 2 — узел! на фиг. 1.

Устройство состоит из корпуса 1, выполненного иэ нержавеющей стали, состоящего из двух частей. Верхняя часть выполнена в виде цилиндрического корпуса 2 с конусом

3, снабженным патрубком 4 для подвода жидкости, Нижняя часть корпуса выполнена в виде конуса 5, внутри которого на осевой линии размещен разбрызгиватель 6 в виде полой полусферы, а снаружи — патрубок 7 для подачи жидкости снизу вверх.. на боковой поверхности конуса 5 расположен пат1752756 рубок 8 для отвода жидкости. Обе части скреплены фланцевым соединением 9.

Внутри верхней части корпуса 1 сверху и снизу расположены перфорированные перегородки 10, между которыми находится фильтрующее устройство 11 (фиг. 2), представляющее собой комплект из кусков объемной волокнистой сетчатой .ткани 12, устойчивой к действию органических растворителей, различной толщины (0,6 — 5,7 мм).

Внутри ткани насыпан сорбент для аффинной хроматографии, например, на основе агарозы или на основе макропористых кремнеземов или силикагелей. Края ткани

12 запаяны термическим способом. Полученные плоские фильтры 13 разделены дренажными прокладками 14 из вакуумной резины и укреплены горизонтальными слоями по высоте корпуса 1 в виде пакета, укрепленного между двумя горизонтальны.ми перфорированными перегородками 10, Устройство работает следующим образом.

Культуральную жидкость микроорганизмов, вытяжку или экстракт, содержащий протеолитические ферменты, подают насосом в устройство.через патрубок 4. Жидкость проходит через решетку и попадает s фильтрующее устройство 11, проходя последовательно через слои аффинного сорбентэ. При этом протеолитические ферменты, содержащиеся в жидкости. специфически взаимодействуют с сорбентом и задерживаются, а разнообразные примеси проходят с током жидкости через патрубок

8 отвода. Затем в систему подают воду для промывки. Элюцию фермента осуществляют с помощью специальных элюирующих буферов, которые подают через патрубок 4.

Через патрубок 8 собирают раствор очищенного фермента. Регенерацию сорбента осуществляют в той же установке подачей воры в обратном направлении через разбрыэгиватель 6 и отводом загрязненной жидкости через пэтрубок 4.

Таким образом, конструкция предлагаемого устройства гораздо более простая, не содержит сложной системы подводящих и

J выводящих канальцев и трубочек, Размеры и конфигурации его могут быть произвольными, так как процесс аффинной хроматографии. в первую очередь, зависит от качества аффинного сорбента, а именно от степени сродства физиологически активных веществ, подвергаемых очистке. к лиганду и от концентрации лиганда на носителе (матрице) сорбента, а не от соотношения длины

10 и диаметра колонки

Защита гранул сорбента включением его в полимерную сетчатую ткань резко повышает надежность работы установки, Время бесперебойной работы зависит не от механического разрушения сорбента; а от прочности химической связи между матрицей и лигандом. Предлагаемая кассетная система позволяет проводить процесс с большой скоростью (200-1000 мл/мин).

Возможность применения в такого типа установке хрупких дешевых аффинных сорбентов отечественного проиЗводства в сочетании с системой промывки и регенерации сорбента беэ разборки устройства, а также

20 достигаемое увеличение активности конечного ферментного препарата делает процесс аффинной хроматографии более эффективным. содержащее цилиндрический корпус с патрубками для подвода и отвода жидкости и расположенный в корпусе сорбента, о т л и35 ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения производительности эа счет ускорения процесса хроматографии и регенерации сорбента и увеличения препарата, сорбент

40 заключен в обьемную волокнистую сетчатую ткань, размещенную горизонтальными слоями по высоте корпуса в виде пакета,. укрепленного между двумя горизонтальными перфорированными перегородками, при

45 этом под нижней перегородкой установлен раэбрыэгиватель в виде полой полусферы, снабженный патрубком для подвода промывной воды.

ЗО Формула изобретения

Устройство для хроматографической аффин ной очистки ферментных препаратов, 1752756

Фиг.1

p z

Составитель Г. Руденскэя

Техред M.Moðãeíòàë Корректор Л. Лукач

Редактцр В, Петраш

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2733 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5