Способ оценки ингибирующих свойств химических веществ
Использование: в биоаналитической химии , при оценке ингибирующей активности природных и синтетических лекарственных препаратов. Сущность изобретения: через проточный реактор, содержащий иммобилизованный фермент, последовательно пропускается раствор субстрата до насыщения , смесь растворов субстрата той же концентрации и ингибитора до установления равновесного состояния и снова раствор субстрата до насыщения. По виду регистрируемой кривой оценивают ингибирующие свойства исследуемых веществ. 2 ил,, 2 табл.
союз соВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
"E
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4744340/13 (22) 02,10.89 (46) 07,08.92. Бюл, ¹ 29 (71) Институт химических наук АН КазССР (72) Б,Е.Новиков, П.П,Гладышев и B.Ø.Màìлеев (56) Кулис Ю,Ю, Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов.—
Вильнюс: Моклас, 1981, 200 с, Авторское свидетельство СССР
¹ 894989, кл, С 01 В 21/00, 1989. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНГИБИРУЮЩИХ
СВОЙСТВ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Изобретение относится к биоаналитической химии и может быть использовайо при оценке токсичности объектов окружающей среды, исследовании антиферментативной .активности природных и синтетических лекарственных препаратов, веществ пестицидного типа и т,п.
Известны методы определения антиферментативной активности химических соединений, основанные на изучении степени ингибирования активности ферментов в присутствии исследуемых соединений.
Недостатком данных методов является необходимость проведения большого количества экспериментов для получения градуировочных графиков, по которым затем возможно определение равновесных (только) констант взаимодействия исследуемых веществ с биокатализатором (основная характеристика соединения); а также отсутствие возможности непосредственного определения степени обратимости взаимодействия эффекторов с ферментными системами.
i Ж,, 1752770А1 (я)ю С 12 0 1/00, С 01 В 21/00 (57) Использование: в биоаналитической химии, при оценке ингибирующей активности природных и синтетических лекарственных препаратов, Сущность изобретения: через проточный реактор, содержащий иммобилизованный фермент, последовательно пропускается раствор субстрата до насыщения, смесь растворов субстрата той же концентрации и ингибитора до установления равновесного состояния и снова раствор субстрата до насыщения. По виду регистрируемой кривой оценивают ингибирующие свойства исследуемых веществ. 2 ил., 2 табл.
Наиболее близким к предлагаемому является способ с использованием прочной системы, в которОм: оцЖМа"ингибирующих свойств химического соединения проводится по степени подавления актйвности каталазы, раствор которой вместе с раствором субстрата и ингибитора подается в капиллярный реактор, где происходит биокаталитический процесс. СкороСть этого процесса регистрируется на выходе -реактора по из- (Л менению концентрации продукта или субстрата. Процесс осуществляют следующим образом: в реактор пропускают смесь потоков субстрата и фермента, при этом регист- р рируют фоновое значение сигнала, затем в систему добавляют поток раствора ингибитора и после установления равновесия реги- а, стрируют значение сигнала, соответствующее скорости биокаталитической реакции при данной концентрации ингибитора. Проводят ряд экспериментов при различных концентрациях ингибитора и строят калибровочный график, по которому затем можно определить относительную (по
1752770 отношению к выбранному стандарту) ингибирующую активность исследуемых веществ, Г!одобные измерения можно проводить и при импульсном вводе ингибитора в поток субстрата для уменьшения времени анализа.
Недостатками метода являются необходимость построения калибровочной зависимости концентрация ингибитора — падание активности фермента, отсутствие характе.ристик обратимости взаимодействия фермент — ингибитор и ограниченность получаемой информации, в частности не определены кинетические константы взаимодействия, являющиеся основными характеристиками исследуемого соединения, Целью изобретения является расширение инфоративности и упрощение способа оценки ингибирующих свойств химических веществ, Поставленная цель достигается тем, что применяют колоночный реактор, заполненный носителем с иммобилизованным ферментом, что дает возможность применить последовательность операций, состоящую в поочередном пропускании через реактор раствора субстрата, смеси растворов ингибитора и субстрата той же концентрации и затем снова раствора субстрата, причем каждая операция проводится до установления стационарного значения активности фермента, а регистрируется динамика изменения активности в ходе опыта, Способ отличается применением в проточной системе иммобилизованного фремента, позволяющего физически отделить компоненты реакционной смеси в потоке (субстрат, продукт, ингибитор) от. биокаталиэатора, что дает возможность по кривым релаксации активности фермента (ветвь инактивации, ветвь реактивации) получить новую информацию о6 антиферментативной активности ингибиторов ферментов, На фиг, 1 дана схема установки для осуществления способа; на фиг, 2 — сигнал проточного детектора продукта ферментативного процесса.
Установка состоит из двухканального перистальтического насоса 1,обеспечивающего раздельную подачу раствора субстрата (S) и смеси растворов субстрата и ингибитора (3+1), которые переключением двухходового крана 2 могут попеременно подаваться в колоночный реактор.3, наполненный носителем с иммобилизованным ферментом, где протекает процесс. На выходе реактора установлен проточный детектор 4, регистрирующий концентрацию субстрата или продукта ферментативной ре40
По указанному способу возможна регистрация динамики изменения активности иммобилизованного биокатализатора в виде зависимости, общий вид которой показан на фиг.2. На получаемой динамической кривой сигнал детектора (регистрируется продукт реакции) — время выделено четыре участка; I — фоновый сигнал (субстрата в системе нет);! — сигнал в системе без ингибитора (постоянный поток субстрата); III— динамика ингибирования фермента (в реактор подается смесь растворов субстрата и ингибитора, стрелкой обозначен момент начала подачи); IV — динамика реактивации фермента в случае взаимодействия с обратимым ингибитором (подается только раствор субстрата). Непосредственно по виду полученной кривой определяют величину ингибирующей активности изучаемого соединения (величина отрезка а), степень обратимости взаимодействия с ферментом (отношение величин отрезков а и b) и стеакции в потоке, которая пропорциональна скорости процесса. Сигнал детектора записывается самописцем 5 в координатах сигнал — время. Таким образом, при
5 пропускании через реактор раствора субстрата регистрируют сигнал О, величина которого пропорциональна V< .= Ооа Vo, где а — коэффициент пропорциональности, С свою очередь, скорость процесса пропор10 циональна активности биокатализатора.
При пропускании смеси растворов субстрата и ингибитора регистрируется сигнал О (t)
= V(t), Для расчетов используется соотношение: О (s)/О, V(t)/Vo, что избавляет от необходимости производить калибровку детектора в размерных величинах. Для детектирования применяют любой тип детектора, который может быть использован для регистрации активности выбранной ферментативной системы в потоке. При выборе детектора необходимо учитывать, что время его отклика должно быть, как минимум, на порядок ниже времени релаксации проточного реактора при скачкообразном изменении концентрации субстрата в нем. В примерах, в частности, был использован электрохимический проточный детектор, регистрирующий ток окисления продукта реакции (в случае холинэстеразной реакции) или субстрата (в случае каталазной реакции), Для расчетов использовали отношение величины тока, регистрируемое в ходе эксперимента, к величине, зарегистрированной в стационарных условиях при пропускании раствора субстрата (участок II, фиг. 2), 1752770 пень сродства фермент — ингибитор (величина ф
Таким образом, в одном эксперименте получают информацию о степени обратимости взаимодействия фермент — ингибитор и 5 определяют индивидуальные кинетические: константы (Кз, k-a, К;) процесса, характеризующие антиферментативную активность исследуемого соединения по формулам: / + з („+ +,. з ) (1+- к-3
15 е
1+S+i -я ! ехр(— k- tj
1 г7+т /Ы =1
Vo (2) 20
1 i 1
-(- — — 1+ — х „+,, (3) где Я = S/Km, I = 1/Kj, k-3
К =
k3.
V, — скорость биокаталитического процесса в отсутствие ингибитора;
V(t) — скорость процесса при введении ингибитора (функция времени);
V(t)/Vo — величина, непосредственно регистрируемая в ходе опыта;
ЧЮ
А = - I - равновесное значение о
30 регистрируемого сигнала 35 в присутствии ингибитора; . t — время;
S — концентрация субстрата;
i — концентрация ингибитора;
Km — константа Михаэлиса. 40
По исходным данным (зависимость
V(t)/Vo — ), полученным из динамической кривой реактивации (участок !Ч, фиг. 2), с использованием уравнения (2) рассчитывают величину k-z. Для этого (2) преобразуют к 45 виду: 1 - А = Вехр(-k-gtj, где А = V(t)/Vo; В = (йз/k-з)/(1 + S + йзВ-з). Прологарифмируем левую и правую части полученного уравнения: In (1 - А) = In  — k-зт. Таким образом, откладывая экспериментальные данные в 50 коодинатах In (1 — V(t)/V,) — t, получим прямую, тангенс угла наклона которой равен величине -k-з. При этом величина V(t)/Vo равна сигналу проточного детектора (в относительных единицах), регистрируемому в ходе эксперимента (фиг. 2). Затем по данным инактивации (участок III, фиг, 2) с использованием (1) и рассчитанной k-g определяют ka. Для этого (1) преобразуют к виду:
А - Я = Bexp (-k gt(C йз/k ç)/Cj, где А =- V(t)/Vp, В = (Фз/k-3)/(1 + S + Йз/k-з), С = 1 + S.
Прологарифмируем левую и правую части полученного уравнения:
In(А -Л, ) = In В -й-з1(С+ Исз/k-3)/С.
Таким образом, откладывая экспериментальные данные в координатах In(V(t)/V -Л) — t, получим прямую, тангенс угла наклона (tg а ) которой равен k-з(С + ik /k-з)/С
Далее, используя величину k-з, полученную описанным способом, определяют з = k-з((С tg а )/k-3 - Cj/i.
Далее рассчитывают К как k-g/Кз. В случае проведения серий опытов при различных концентрациях ингибитора и определения в каждом случае велйчины по (3) можно непосредственно рассчитать величину К . Для этого уравнение (3) преобразуем к виду1/A. -1= iD/Ê, где D = 1/(1+
+ S). Таким образом, откладывая данные эксперимента в координатах (1/ А - 1) — i, получим прямую, тангенс угла наклона которой равен 1/Кь
Процесс осуществляют в проточном капиллярном реакторе (диаметр 1 — 2 мм, длина 10 — 15 мм), заполненном носителем и иммобилизованным ферментом. В качестве биокаталиэаторов использовали ацетилхолинэстеразу и каналаэу. Все реакции проводили при температуре, оптимальной для данных ферментов (37 С).
Иммобилизацию ферментов проводят известным способом, например сорбционно на силохромах. Для этого раствор биокатализатора (концентрация 0,05 — 5 мг/мл) пропускают с помощью перистальтического насоса (скорость 0,5 — 5 мл/мин) через реактор, заполненный силохромом, в течение
30-50 мин, Раствор белка готовят в 0,01 н. натрийфосфатном буферном растворе (рН
7,5) в количестве 2 мл. После пропускания раствора биокатализатора реактор промывают в течение 10 мин чистым раствором буфера для удаления несорбировавшегося биокатализаторэ.
Для детектирования использовали проточный электрохимический детектор.
В примерах, приводимых ниже, с целью иллюстрации конкретных экспериментов приведены размерные величины отрезков а и Ь (фиг, 2), а также величины сигнала в отсутствие ингибитора V< и его стационарное значение Х в его присутствии, Для расчетов использована безразмерная величина А, равная отношению размерной Л к величине /о. При расчетах констант kz u
k з использовали безразмерную величину
V(t)/Vp, получаемую преобразованием, 1752770 ность фермента восстанавливается до первоначального значения. По виду регистрируемой кривой сделан вывод о,том, что ингибитор — обратимый. Из данных эксперимента рассчитаны значения: k-z = (3,2 +.
Ю,6)х10 с; з=(55 0,3)х10 моль с, К1 = (0,58 + 0,1) х 10 моль. Пример 4. Условия,как в примере 1.
Используют ингибитор — хлорофос (концен0 тра ция 1,2 + 10 моль/л). Регистрируют стационарный сигнал 0,67 мкА. Уменьшение сигнала до 0,51 мкА, Восстановление сигнала при попытке реактивировать фермент не наблюдается, Следовательно, ингибитор—
5 необратимый. Рассчитано значение kg =
=(1,4+ 0,3) х 10 моль с
Пример 5. Условия,как в примере 1.
Используют ингибитор — цианид калия (концентрация 2,1 + 10 2 моль/л). Регистрируют
0 стационарный сигнал 0,66 мкА. При пропускании смеси растворов субстрата и ингибитора зн:.,чение сигнала не изменяется, следовательно, данное вещество не является ингибитором ацетилхолинзстеразы, 5 Пример 6. Используют реактор с иммобилизованной каталазой, через который пропускают раствор перекиси водорода (концентрация 0,9х 10з моль/л), Регистрируют уменьшение тока окисления
0 субстрата вследствие протекания ферментативной реакции до 0,18 мкА. При пропускании смеси растворов субстрата и ингибитора .(цианид калия, концентрация
1,2 к10 моль/л) наблюдается увеличение
5 тока окисления субстрата до i 0,26 мкА вследствие подавления активности биокатализатора. При подаче чистого раствора субстрата регистрируемый сигнал уменьшается до первоначального значения. Следо0 вательно, цианид калия — обратимый ингибитор каталазы. Рассчитаны: k-з = (4,3)
+0,5) х 10 с, Кз=(1,2 + 0.3) х 10 моль с и Ki =(3,6«+0,5) х104 моль.
Пример 7. Используют реактор с
5 иммобилизованной каталазой и раствор субстрата — перекиси водорода, как в примере 6. Для детекции протекания ферментативного процесса используют проточный спектрофотометрический детектор. Регист0 рацию перекиси водорода проводят при длине волны 230 нм. В начальный момент регистрируют значение оптической плотности, равное 0,31. При пропускании через реактор раствора субстрата и ингибитора, 5 как в примере 6, наблюдается увеличение значения оптической плотности до 0,42. При подаче в реактор чистого раствора субстрата наблюдается восстановление сигнала до первоначального значения. По результатам эксперимента рассчитаны: k-з = (4,1 1-006}х
Пример 1 В реактоо с иммобилизованной ацетилхолинэстеразой, подают раствор субстрата: ацетилтиохолиниодида (концентрация 3,2 1- 10 моль/л). При этом регистрируют стационарный ток окисления 5 образующегося продукта (фиг. 2, участок И), равный 0,68 мкА, Затем в реактор подают смесь растворов субстрата и ингибитора— прозерина (концентрация 5,1 10 моль/л), -6
При этом наблюдается падение регистриру- 1 емого сигнала (фиг, 2, участок ill) до стацио.нарной величины 0,54 мкА, После этого в реактор подают раствор субстрата, активность иммобилизованного фермента восстанавливается, что проявляется как 1 возрастание регистрируемого тока до первоначального значения (фиг, 2, учаток iV), Получено, что значения величин отрезков а и Ь равны, следовательно„ингибитор — обра- . тимый, По уравнению (2) рассчитано: k-z = 2
=(5,0 «+ 0,8)с10 с, Затем поданным инактивации и вычисленному k-з определяют kg =
:(8,2+ 0,5) 10 моль с . Далее рассчитвают
К = k-ä/Кз и получают величину (6,8 + 0,5)
«10 моль. Опыты проводят при тех же усло- 2 виях, но с шестью различными концентрациями ингибитора. Регистрируют величину отрезка а (фиг. 2). Получают данные о величине сигнала, регистрируемого при различных концентрациях ингибитора, в системе 3 ацетилхолинэстераза — ацетилтиохолинио дид — прозерин, которые приведены в табл, 1.
С использованием (3) методом наименьших квадратов рассчитывают значение Ki, равное(7,4+ 0,7) х10 моль. 3
Построив калибровочную характеристику концентрация ингибитора — а по известному способу можно определить неизвестную концентрацию ингибитора, Пример 2. Способ осуществляют по 4 примеру 1. Применяют раствор субстрата с большей концентрацией (9,3 10 моль/л) и тот же ингибитор. Регистрируют величину стационарного тока, равную 0,79 мкА, уменьшение сигнала до 0,67 мкА при той же 4 концентрации ингибитора. По данным экс-. перимента рассчитаны значения; k-g ==(5,3+ 0,4) х 10 с, kg=(8,0 g 0,2) х 10 моль с ; Ki = (6,6+ 0,5) х 10 в моль, Таким -T - 1, образом, изменение концентрации субстра- 5 та не приводит к измененйю кинетических констант, что говорит о правильности предполагаемого механизма реакций.
Пример 3, Способ осуществляют по примеру 1, но вместо прозерина использу- 5 ют тетрабутиламмоний иодистый (концентрация 5,0t 10 моль/n), Стационарный сигнал равен 0,68 мкА, Регистрируется уменьшение сигнала при пропускании ингибитора до 0,61 мкА. При реактивации актив1752770
10 (2) х10 с, Кз = (1,3+ 0,4) х10 моль с" и К» = (3,1+ 0,6) х10 моль, Полученные данные зависимости кине-. тических параметров процессов ингибирования от условий их проведения по 5 примерам 1 — 7 приведены в табл. 2.
Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным более информативен, позволяет рассчитать концентрацию ингибитора (с использованием калибровоч- 10 ного графика), определить качественно и количественно 1з степень сродства фермент— ингибитор, оценить обратимость взаимодействия и количественно рассчитать кинетические характеристики процесса. 15
Вывод формул для расчета кинетических констант, Взаимодействие между биокатализатором, субстратом и ингибитором описывается схемой: 20
Е+ — ES E+P; . (1)
k2
Е+ I — -El
ka — з где Š— фермент;
25, S — субстрат;
Р— продукт;
l — ингибитор;
ES u El — фермент-субстратный и ферм ент-ингибиторный комплексь» соответственно;
k1 и k 1 — константы скорости образо вания и распада на исходные соединения фермент субстратного комплекса;
kz — константа скорости образования продукта реакции;
Кз и k-з — константы скорости образова ния и распада фермент-ингиби торного комплекса;
К» = k-з/Кз — равновесная константа диссоциации фермент-ингибиторного комплекса.
В случае взаимодействия с необратимым. ингибитором обратная реакция (константа 45
k-з) отсутствует, Введем обозначения: х = CEs, у = Св, z=
= Се, i = С», S = Cs, P.=- СР, V = dCp/dt, где Се, Cs, CI, Cp, CEs, CEI — концентрации фермента, субстрата, ингибитора, продукта, фер- 50 мент-субстратного и фермент-ингибиторного комплексов соответственно; V — скорость процесса. Тогда дифференциальные уравнения, описывающие протекание реакций (1) и (2) имеют вид:
dx/dt = k1zS (k2 + k-1)х, (3)
dy/dt = -di/dt = k32i = k-gy, (4)
dz/dt = -k1zS + (kz+ k-1)х — kazi + k-зу, (5)
dS/dt = -k1zS + k-1x, (6) V = dP/dt = k2x, (7)
Ферментативный реактор имеет малые размеры, поэтому можно допустить, что в нем достигается режим полного перемешивания компонентов в подвижной фазе и в Р== vpdP/бс, где»L» — объемная скорость flo тока; V — свободный объем реактора. Таким образом, измеряемый сигнал пропорционален скорости образования продукта, которую можно найти из уравнения (7), решив (3) — (6), В условиях эксперимента концентрации субстрата и ингибитора в потоке велики (по сравнению с концентрацией фермента), поэтому их изменением в ходе реакции можно пренебречь (S = const,! = const). В этом случае уравнения (3) — (7) линейны и для расчета dP/dt достаточно решить систему (3) — (5).
Чтобы описать ветви инактивации (I =
const) и реактивации (i = О) фермента систему (3) — (5) следует решать при различных начальных условиях, Исходное .стационарное состояние определяется кинетикой Михаэлиса-Ментен. Поэтому, считая момент ввода ингибитора нулевым, для процесса инактивации имеем следующие начальные условия;
S CP
x =Xp—
Km +S, y =yp =О, 2 = о =
К СЗ
,.V = Vp = k2 хо, где CE — общая концентрация иммобили— зованного фермента в реакторе;
Km = (kz + k-1)/k1 — константа Михаэлиса, Решим (3) — (5) методом преобразования
Лапласа, который связывает функцию x(t) с ее операторным изображением х(р) посредством интегрального уравнения:
x(q)= f x(t) exp (-qt ) dt, о где q — параметр преобразования.
Умножив (3) — (5) на ехр(-qt) и проинтегрировав по времени, получим:
qx — хо = k1zS - (kZ + 1)х, (8)
qy= kszi- k-зу, (9)
qz — zp = -k1zS + (k2 + k-1)x - kzzi + k-зу, (10)
Из алгебраической системы (8) — (10) находим
V х („k3l к2+k — 1 )), (»1)
q +Aq+ B где А = G + H; В = GH - k1kgSi; G = k1S + kz+
+k-1; H = k-з + kal.
Свойства преобразования Лапласа позволяют определить стационарное значение скорости образования продукта
1752770
И,. g qV(q)/ Ч.=lim (V(t)/Vo )=- lim (x(t)/x, 1+S
1+ +7
q-"0
СЪсЭ т-где S -- S/Krn, i =- йз/k-э.
Из (8) — (10) несложно найти и стационарные значения других переменных; хс = хо Х: ус =(хы/S) 2,; zc =(хо/З) Л: Vc =
= (о (12)
Обращение преобразования Лапласа сделаем после разложения (11) на сумму простых дробей
V g) Л !Q I(l<2 + k — g) о Ц g1 — Ц2
1 1
qz (q + qz j qiqqq+ q> где -q1 и -Цг — полюсы изображения (11), которые, как легко проверить, при любых положительных кинетических константах находятся в левой полуплоскости на вещественной оси. Оригинал изображения (13) имеет вид:
V(g з i(<2 + k — g) ) =-Л+ х
Ц1 g2 хр(— Цг Т) ехР— Ц1С ) (14)
Ц2 Ц1
В эксперименте установлено, что при быстром изменении концентрации субстрата релаксации сигнала происходит значительно быстрее, чем при изменении концентрации ингибитора, т,е. G» Н. При этом с ВысОкОЙ точностью Ц1 = k2 + k-1 + k1S, Цг = kз(1+ S+ }/(1+ S). Так как q»> q2, то для больших значений времени (14) дает асимптотику;
V t iexp(— k о
Формула (15) имеет удовлетворительную точность практически во всем .интересующем диапазоне времени.
Для реактивации фермента имеет начальные условия (12). Используя вместо (9) и л уравнение Py - ус = k-зу, получим х — - (г, + х, (1 + q ) + yc k-З / (ц+к-3 ) ) (1 6)
Оригинал изображения (16) выражается как
x = — е ((2с + xc ) (1 — 8xp(— G t ) )—
S < — 3 ус (ехр (—.k — эт) — ехр(-G t ))+ус(1ехр(-k-з t ) ) +хс ехр (- G t).
Так как 6» Ь-з, то для большого значения .времени
V(t)/V0 = 1 - (Iexp (-к-зт))/(1 + Я + )). (17) 5
Асимптотики (15) и (17) спрямляются соот-.. ветственно в координатах t — In(V(t)/Vo — Л ) и t — in(1 - Ч(т)/1/о). Тангенс угла наклона первой прямой равен -(k-з + kz(i/(1 + S))), а вторОЙ -k-з, Еще один способ расчета К основан на измерении Ki при различных концентрациях ингибитора. так как
1 1 i
Формула изобретения
Способ оценки ингибирующих свойств химических веществ, включающий пропу15 скание через проточныцй реактор растворов субстрата и исследуемого вещества в присутствии фермента и определение параметра, соответствующего величине активностифермента, отл ича ю щ и йся тем, 20 что, с целью упрощения и расширения информативности способа, используют реактор с иммобилизовэнным ферментом, пропуска ние растворов осуществляют в три стадии, при этом на первой и третьей стади25 ях пропускают растворы субстрата одной и той же концентрации, а на второй стадии— смесь растворов исследуемого вещества и субстрата, и каждую стадию проводят до установления стационарного значения ак30 тивности фермента, в процессе пропускания .определяют в качестве параметра, соответствующего величине активности фермента, скорость ферментативного процесса в присутствии исследуемого вещества
35 v1 и скорость процесса в его отсутствие v вычисляют отношение vt/vp и на протяжении второй стадии по величине убывания отношения оценивают ингибирующую активность исследуемого вещества, на протя40 жении третьей стадии оценивают степень обратимости процесса ингибирования, если величина отношения достигает соответствующей величины нэ первой стадии, исследуемое вещество считают обратимым
45 ингибитором, а если величина отношения в конце третьей стадии меньше соответствующей величины на первой стадии, то исследуемое вещество — необратимый ингибитор, по продолжительности времени возраста-
50 ния величины отношения на третьей стадии оценивают степень сродства фермент-ингибитор, при этом чем больше время возрастания, тем прочнее сродство фермент-ингибитор, а для количественной
55 характеристики ингибирующей активности вычисляют равновесную и кинетические константы диссоциации фермент-ингибиторного комплекса.
1752770
Табл и ца 1
Т бли а 2 а ц
Субстрат, Ингибитор, Ток фона а, Ь, k, с k» K моль
-з 3 моль/л моль/л мкА мкА моль с
Ацетилхолинэстераза
Ацетилтио Прозерин 0,68 0,14 холиниодид 5,1 !0
3,2 10 <
0,14 5, О. 1О 3,2. 10 6,8. 10
0,07
0,14
0,16
0,18
7,4.10
0,21
0,25
-S -6
0,12 5,3-10 8,0.10 6,6 !0
9,3 ° 10
3,2 10
Тетрабутиламмоний иодистый 5,0.. 1О з 0,68
0,07 3,2 ° 10 5,5. 1О 5,8 10
0,07
3,2 10
3,2 10
Хлорофос
1,2-10 З
1,4 10
0,67
0,16
Цианид калия
2,1 10
0,66
Каталаза
s, О, 08 4,3 10 1,2.10 3,6 10. Перекись Цианид каводорода лия
0 9,!О-з 1 2 ° 10
0,18
0,08 г
2,4 ° 10
4,7 10
5,6 ° 10
7,3.10
9,5 10
11,9 1О
5,1 ° 10
0,67
0,67
0,67
0,67
0,67
0,67
0,79
0,07
0,14
0,16
0,18
0,21
0,25
0,12
1752770
Редактор B.Ïåòðàø
Заказ 2734 . Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Ю
v„
Составитель О,Комарова
Техред M,Mîðãåíòàë Корректор О Юрковецкая
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101
