Способ получения мутантов чумного микроба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции i

 

Изобретение относится к бактериальной генетике. Целью изобретения является повышение выхода мутантов чумного микроба со строго определенными делециями Способ заключается в использовании гибридной плазмиды pFs 23, которую вводят в клетки чумного микроба с последующим отбором бескапсульных вариантов по KmRAps фенотипу

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИС1ИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК я) С 12 И5/О1, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4863570/13 (22) 22.06.90 (46) 15.08,92. Бюл, В 30 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) А.В. Карлышев, В.И. Кравченко,В.М. Красильников и А, П. Анисимов (56) Авторское свидетельство СССР

М 1439122, кл. С 12 N 15/00, 26.09.86. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ

ЧУМНОГО МИКРОБА ДЕФЕКТНЫХ ПО

Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к области направленного делеционного мутагенеза плазмид, Известен способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу капсульного антигена фракции i, путем посева взвеси на питательную среду, содержащую 15-25 мМ оксалата натрия, и инкубирования при 37 С, что приводит к получению в популяции Тох Fra мутантов У.

pestls. Отсутствие капсульного антигена у них обусловлено потерей генов, детерминирующих образование капсулы в результате делеции фрагмента плаэмиды pFra/Тох.

К недостаткам прототипа следует отнести то, что причина, обусловливающая такие делеции, не выявлена. Делеция составляет

25-33 от размера плаэмидного реплико- на. Это приводит к значительному нарушению структуры всей плазмиды pFra/Òîõ.

Выращивание культур Y. pestis на кальцийдефицитных средах при 37 С вызывает повреждения не только плазмиды рРга/Тох, но и и серции, делеции плазмиды pCad различной протяженности и мутации в хромосоме Y. pestis. Это в свою очередь приводит

HJ 1754779 А1

СИНТЕЗУ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА

ФРАКЦИИ 1 (57) Изобретение относится к бактериальной генетике. Целью изобретения является

/ повышение выхода мутантов чумного микроба со строго определенными делециями.

Способ заключается в использовании гибридной плазмиды риаз 23, которую вводят в клетки чумного микроба с последующим отбором бескапсульных вариантов по Km Àð фенотипу. к изменению биологических свойств микроба.

Цель изобретения — повышение выхода мутантов со строго определенными делециями;

Цель достигается за счет осуществления целенаправленной мутации, приводящей к делеции структурной части fra-оперона. Это происходит в результате гомологичной рекомбинации в клетках Y. pestis гибридной конструкции pFK23 с интактной плаэмидой.

Затем отбирают бескапсул ьн ые варианты по Km Àð -фенотипу.

Сущность изобретения заключается в конструировании гибридной плазмиды на основе вектора рНС79. Данный вектор содержит ген р -лактамаэы и не способен стабильно наследоваться в клетках чумного микроба без селективного давления. Гиб- ридная плаэмида несет в своем составе фрагмент ДНК плазмиды рРга/Тох, где центральная область этого фрагмента, несущая структурную часть fra-оперона, замещена на гсн устойчивости к канамицину. Наличие в рекомбинантной плазмиде областей гомологии с плазмидой pFra/Tox, фланкирую1754779 щих ген антибиотикоустойчивасти, при трансформации клеток Y. pestis гибридной плазмидой обеспечивает гамалогичную рекомбинацию с плазмидай pFra/i ox, в результате чего у части микробной популяции на интактной плаэмиде pFra/Tox происходит замещение структурной части fra-оперона на ген устойчивости к канамицину, а структурная часть fry-операна люминирует из микробной клетки, Инкубируют трансформанты прй 28ОС в течение 2 — 3 сут на питательном агаре, содержащем 25 мкг/мл канамицина. Выросшие клоны и; ресевают на агар со 100 мкг/мл ампициллина и отбирают клоны с фенотипом Vrn "Ap .

Клоны с Km Aps фенотипам составляют

0,1-15% от числа всех трансфармантов, причем 100% клонов c Km "Ар -фенотипом несут делецию структурной части fra-оперона, Содержание в популяции рекамбинантных клонов с Km Àðs-фенатипам можно увеличить до 50 — 80% путем заражения смесью трансфармантав белых мышей, предварительно иммунизированных "фракцией 1". Наличие *фракции 1" в клстках про-. веряют в реакциях РПГА и РНАт, Синтез "мышиного" токсина, Y-антигена определяют в реакции диффузионной преципитации в геле, Са зависимость, способность к пигментсорбции, фибринологическую, йлаэмокоагулазную активность и способность к синтезу пестицина l тестируют согласно руководству.

Существенное отличие заключается в трансформации микробных клеток плазмидой рГ„23, обеспечивающей в результате гомалогичной рекомбинации с собственной плаэмидой pFra/Tox элиминацию структурной части fra-аперона из микробной клетки; получение мутантов проводится на полноценных питательных средах при температуре 28 С вЂ” в наиболее физиалогичных для культивирования У, pestls In vitro условиях, Пример 1. Получение рекомбинантйых плазмид, Плазмида рЦС4К скойструирована I/Ieira J., Messing J. Плаэмида pFs1 получе" на нами путем клонирования 5,6-мегадальтонного Есо RI-фрагменат плазмиды рГга/Тох из вакционного штамма Y. pestls

ЕВ линии НИИЭГ в составе известного касмидного вектора рНС79. На ее основа, за счет делеции 0,8-мегадальтонного Яа1Яфрагмента ДНК сконструирована плазмида pFs2. Данные плазмиды несут в составе кланированных фрагментов ДНК плазм":ды

pFra/Òox fra-операн и обеспечивают при температуре 37 С образование белковой капсулы (Fl антигена) в несущих эти канструкции клетках кишечной палочки и чумного микроба. Векторная часть плазмиды включает гены Ap", Tc, а плазмида pFs2 несет лишь ген Ар", т,к. проведенная в процессе

5 ео получения делеция Sal Fi-фрагмента привела х инактивации гена Тс", Для получения плазмиды pFsSX ДНК рГз1 гидролиэовали рестриктазами Sal ((ограниченный гидролиз) и Xho (noëíûé гидроl0 лиз), смешивали с SelJ1-фрагментом плаэмиды pUC4K несущий ген устойчивости к канамицину, обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4. Полу-ченным лигатом трансформировали клетки Е. соИ Н В 101, отбирали Km"Òñ

15 кланы, выделяли плазмидную ДНК клонов.

При получении плазмиды pFs 23 применяли сходные приемы, за исключением того, что делецию получали обработкой плазмиды

pFs 2 рестриктазой Cia, ген Km" из плазмиды

20 pUC4K встривали по сайту Berm Hf трансформанты Е, co!l HH 101 отбирали па Km "Àð"признаку. Сконструированные таким образам плазмиды несут Kmr ген и имеют делецию внутренней области, обеспечиваю25 щей продукцию капсульнага антигена, Иммунологический анализ (РПГА и

РНАт) 28 и 37 — культур Е. coil с плаэмидами

pFsSx u pFs 23 показал полное отсутствие способности к синтезу капсульнаго антиге30 на в культуре с титром 5 10 мк/мл, Резуль9 таты иммунологического анализа подтверждены троекратно.

Л р и м е р 2. Изучение механизма образования Рга=вариантав.

35 Для этой цели использовали полученный Черепановым П. А. (ВНИИПМ) нэ основе вакционного штамма Y. pestls ЕВ г! ИИЭГ штамм V. pestls ЕВ 100, ссдержащий лишь плазмиду, детерминирующую синтез Fl - и

40 T-антигенов. Трансформация клеток Y.

pestis ЕВ 100 плазмидой pFs 23 позволила отобрать клоны Km"Ар . Они составляли

15% популяции трансформантов. Иммунахимический анализ (РПГА, PHAr) вариантов

45 Y. pestis ЕВ 100 с плаэмидой pFs 23 показал полное отсутствие способности синтеза капсульного антигена в культуре с титром . 5 10 мт/мл, Результаты иммунохимическага анализа подтверждены троекратно, Вы50 деленную плазмидную ДНК анализировали с помощью рестриктаэ, Установлено, что

Г плазмида содержит делецию и вставку Km - . фрагмента в области, детерминирующей синтез хапсульнога антигена, как и предпо55 лагалась.

Использование плазмиды рГз$х для трансформации клеток У. pestls EH 100 не, привело к появлению Km Ap клонов, r s

П; и м е р 3. Получение Fra=oàðèàèтав штамма У, pestis ЕВ НИИЭГ. i f54779

Составитель Е. Игнашина

Редактор А. Маковская . Техред М,Маргентал Корректор Л. Лукач

Заказ 2869 Тираж Подписное

БНИИПИ Государственного комитета по иэабре" ениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Клетки Y. pestis ЕВ НИИЭГ (2-суточная

28 -ная культура на агаре Хоттингера) трансформируют плазмидами pf=s 23 и

pFsSx. Отбирают Km"-клоны, обьединя отих и пассируют на иммунных бслых мышах, вакцинированных подкожно введением

20 мкг коммерческого препарата Fi антигена за 3 недели до заражения, Эта процедура сппсабствует завершению процесса рекомбинации и элюминации из популяции сохранившихся Fra -клеток.

За сутки до заражения животным вводят внутрибрюшинно FeSQ 7НгО в подсолнечном масле (0,2 мл суспензии, содержащей 0,5 мг соли), Иэ органов павших животных дела от высевы на агар Хаттингера, содержащий Km (25 мкг/мл), Отбирают клоны с фенотипом Km Àð . Использование плаэмицы pFs 23 позволяет получить 50-80 клеток с данным фенотипом, 100 которых не способны продуцировать капсульный антиген. Использование плазмиды рРзЯх приводило к образованию рекамбинантных клонов лишь с фенотипом

Ар Km", 25% из них были не способны к продукции капсульного антигена, Пример 4, Оценка антигенного состава рекомбинантнь х кланов Y. pestfs

ЕВ ВНИИЗГ pFs 23.

Наличие Я антигена проверяют в 100 клонах путем постановки сералагических реакций РПГА и РНА 28 и 37 -них культур, выращенных на arape Хоттингера. FJ антиген отсутствовал в культуре с титром

5 10 и к/мл.

Синтез "мышиного" токсина и Ч-антигена определяют в реакции диффузионной преципитации в геле.

Са -зависимость, способность к пигг мент-сорбции, фибринолитическую. плазмокоагулазную активности и способнос ь к синтезу пестицина I тестируют согласно ру5 каводству, 100% клонов обладали фенатипам Fra Тпх Ч Lcr Pstl Ffb Coa РзЬ, Основным преимуществом предлагаемого способа является получение бескапсульных вариантов чумного микроба, 10 сохранивших все остальные фенотипические признаки исходных штаммов, В их генаме происходит лишь целенаправленное замещение структурной части fra-оперона на генблок детерминирующей синтез кана1.5 мицинфосфотрансферазы.

Способ применяется в генетических иссМедаваниях Y. pestis для изучения рол;-: антигена "фракции f" в биологии этого микроорганизма и для получейия плаэмид

20 рРга!Тах, маркированным геном антибиотикаустайчивасти в заранее выбранном сайте, Способ не требует дорогих реактивов и занимает мало времени.

Формула изобретения

Способ получения мутантов чумного микроба дефектных по синтезу капсульного

30 антигена фракции 1, предусматривающий

° выращивание клеток чумного микроба на питательной среде, отбор мутантов, Содержащих плазмиду pFra/Tox с делецией в генах, ответственных за синтез капсульно35 га антигена, отл и ч à ю щи и с я тем, что, с целью повышения выхода мутантов со строго определенными делециями, в клетки чумного микроба вводят плазмиду pFs 23, а мутанты атбира1от по Km Ap фенотипу.