Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей

 

Использование: вирусология. Сущность изобретения: для получения сухих вирусных препаратов используют стабилизирующий состав, который содержит, (г/л культуральной вирусной суспензии): мальтоза 28-60; пептон 44-100; желатин 10-20; бычий сывороточный альбумин 11-25, тиосульфат натрия 1,25-3,0.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

РРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (!

) о (СО

С> (Э (21) 4791825/13 (22) 14.02,90 (46) 15.09.92, Бюл, ¹ 34 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнои роизводствен ного объединения "Вектор" (72) В,Г.Фролов, Ю.М.Гусев, В,А.Жуков и

В.М.Чермашенцев (56) Селезнева А.Ю„Николаева О.В. Фадеева Л,Л. и др, Методические рекомендации полиофилизации различных вирусов для целей длительного хранения. М., 1982, с, 39.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения сухих вирусных препаратов методом лиофилизации, Известны стабилизирующие добавки, используемые для лиофилизации культуральных суспензий вирусов и живых культуральных вакцин в виде композиций, состоящих из пептона, белков и углеводов, Например, для стабилизации вирусной вакцины против чумы плотоядных использовали пептон и лактозу, в качестве наполнителя при высушивании вакцины против болезни

Тешена свиней использовали пептон, сахарозу и желатозу, для стабилизации живой коревой вакцины — сорбит и желатозу.

Недостатком вышеперечисленных составов является то, что они обеспечивают сохранение биологической активности препаратов в течение 1 года при температуре хранения, не превышающей +4 .

Наиболее близким техническим решением по стабилизации культуральных суспензий тогавирусов, выбранным в качестве прототипа, является состав, включающий в себя пептон, или бычий альбумин, или сахаБЫ, 1761800 А1 (Я)5 С 12 N 7/00 А 61 К 39/125 (54) СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ СОСТАВ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ

ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ (57) Использование: вирусология. Сущность изобретения; для получения сухих вирусных препаратов используют стабилизирующий состав, который содержит, (г/л культуральной вирусной суспензии): мальтоза 28 — 60; пептон 44 — 100; желатин 10 — 20; бычий сывороточный альбумин 11 — 25; тиосульфат натрия 1,25 — 3,0. розу с желатином. Недостатком и редложенного состава является то, что он рекомендован для получения препаратов, хранение которых осуществляется при температуре не более+4 С и при этом на стадии высушивания наблюдается значительное снижение инфекционной активности порядка

0,8-1,3 Ig LDgo.

Целью предлагаемого технического решения является снижение потерь инфекционной активности вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), наработанного на культуре клеток, на стадии лиофильного обезвоживания и последующего длительного хранения при положительных температурах. Поставленная цель достигается тем, что в качестве стабилизатора используется состав, состоящий из пептона, желатина и углевода, дополнительно содержащий бычий сывороточный альбумин {БСА) и тиосульфат натрия, В качестве углевода используется мальтоза при следующих соотношениях компонентов (г/л культуральной вирусной суспензии);

Мальтоза

Пептон

1761800

44

Желатин 10 — 20

БСА 11-25

Тиосульфат натрия 1,25 — 3,0

На фиг. 1 и 2 приведены динамики инактивации вируса ВЭЛ в составе препаратов с различными стабилизирующими составами для температур хранения 37 и 20 С, соответственно.

Подготовка вирусного материала к высушиванию проводилась следующим образом, Выращивание вируса (штаммы ТС-83 и

N 230) на культуре клеток проводилось в соответствии с известной методикой. Полученный материал представлял собой поддерживающую питательную среду (на основе среды Игла МЕМ с добавлением 1—

2 сыворотки KPC), содержащую вирус, Компоненты стабилизирующего состава: пептон, БСА, мальтоза и тиосульфат натрия добавлялись в сухом виде к соответствующему количеству культуральной вирусной суспензии и растворялись в ней при комнатной температуре, после чего к полученной смеси добавлялся желатин в виде 10 /-ного водного раствора, подогретого до 30 — 35 С, Замораживание материала осуществлялось при (-30) — (-40) С, после чего он выдерживался при этой температуре не менее 2 часов, Высушивание проводилось в течение 18 — 24 часов в вакууме (Р=0,1 мм рт,ст,) при температуре подогрева полок лиофилизатора 40

С, Остаточная влажность полученного препарата при этом не должна превышать 3, Хранение высушенного материала осуществляется в течение 14 дней при 37 С либо не менее 6 мес при 20 С.

Тестирование инфекционной активности исходного и лиофилизованного вирусного материала, а также его инфекционной активности во время хранения при положительных температурах, проводилось путем титрования на первичной культуре фибробластов эмбриона курицы (Ф Э К) под твердым агаровым покрытием.

Примеры стабилизирующих составов, использованных для лиофилизации вируса

ВЭЛ, наработанного на культуре клеток.

Пример 1. Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Мал ьтоза 60

Пептон 100

БСА 25

Тиосульфат натрия 3,0

Желатин 20

Пример 2, Компоненты защитной среды, г/л культуральной вирусной суспензии:

Màëьтоза

Пептон

БСА 18

Тиосульфат натрия 2,12

Желатин 15

Пример 3, Компоненты защитной

5 среды, г/л культуральной вирусной суспенэии:

Мал ьтоза 28

Пептон 44

БСА 11

10 Тиосульфат натрия 1,25

Желатин 10

Для указанных примеров инактивация вирусного материала на стадии лиофильного обезвоживания оценивалась путем опре15 деления инфекционной активности материала до и после высушивания, Для заявляемого стабилизирующего состава (примеры 1 — 3) и для приведенных выше условий лиофилизации разница между титрами ис20 ходной суспензии и высушенного.материала составляла 0,1+ 0,2 Ig БОЕ, В табл. 1 приведены средние значения констант скоростей инактивации вируса

ВЭЛ в составе полученного препарата для

25 температур хранения -12, 20 и 37 С.

Для расчета констант скоростей инактивации использовалась модель вида С=Со ехр (-K

30 С и С вЂ” исходная и текущая концентрация вируса, соответственно: т- время экспозиции.

В соответствии с (1) строились линейные регрессии для функции

35 T=lg С

Т=а+Ьт (2)

Тогда коэффициент инактивации:

Кин=-2,303 b (3)

Для определения коэффициентов модели

40 (2) был использован взвешенный метод наименьших квадратов. Модель считалась адекватной, если прямая регрессии проходила через доверительные интервалы используемого набора экспериментальных точек, Рас45 чет концентраций вирусов проводился в соответствии с известной методикой, доверительные интервалы определялись для 5 -ного уровня значимости, В ходе экспериментальных исследова50 ний проводилось сравнение эффективности предлагаемого стабилизирующего состава с известными аналогами и прототипом. Данные приведены в табл.2.

В табл. 3 приведены данные, позволяю55 щие сопоставить стабилизирующие свойства защитных сред, приведенных в табл. 2, на стадиях лиофильного обезвоживания и последующего хранения при температуре 20 и

370С, 1761800

Таблица1

Таблица2

Таблица3

Стабилизирующий состав

Изменение биологической активности на стадии высушивания, БОЕ

Константа скорости инактивации при температуре хранения

37 С, с т.

1,60х10

1,07х10

6,00х10

5,37х10

Заявленный

Прототип (4)

Аналог (4)

Аналог (1) 0,1

0,4

0,3

0,8

0,14

1,61

0,90

0,74

Из данных, и риведенн ых в табл. 2, видно, что предлагаемое техническое решение обеспечивает существенное повышение устойчивости вируса ВЭЛ на стадии лиофильного обезвоживания, Предлагаемый стабилизиру- 5 ющий состав позволяет в несколько раз снизить потери биологической активности препаратов при хранении их в диапазоне положительных температур до 37 С, Наиболее рационально применение 10 данного стабилизатора при производстве живых вирусных вакцин, т,к. его использование обеспечивает выживаемость вирусов на этапе приготовления вакцины и позволяет производить хранение и доставку данной 15 вакцины без применения специальной холодильной техники, Формула изобретения

Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на 20 основе культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, содержащий пептон, желатин и углевод, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью снижения потерь инфекционной активности в процессе лиофильного высушивания и последующего хранения при положительных температурах, состав дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин и тиосульфат натрия, а в качестве углевода в нем используют мальтозу при следующих соотношениях компонентов, г/л культуральной вирусной суспензии:

Пептон 44 — 100

Желатин 10 — 20

Мальтоза 28-60

Бычий сывороточный альбумин 11 — 25

Тиосульфат натрия 1,25 — 3,0

1761800

Й ф" фивмнсж ю юи/юга, ф cF0F/гу,у

2, Составитель B.Ôðoëîâà

Редактор М,Самерханова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М.Петрова

Заказ 3235 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород; ул.Гагарина, 101

Инфемционная адтидмигта, fg БЯ

О Ю 720

Фьг 2

rz s4

Г суж

7Ю 780

7сутни