Штамм гриба aspergillus flavus link как тест-культура для определения грибостойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов

 

Использование: техническая микробиология, машиностроение. Сущность изобретения: предлагается использовать для определения грибостойкости сталей оксидных алюминиевых и магниевых сплавов штамм гриба Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д, выделенный из продуктов коррозии оксидного алюминиево-магниевого сплава. Штамм гриба Aspergillus flavus Link BKMF- 3190Д депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБМФ АН СССР. 3 табл.

Изобретение относится к микологии промышленных материалов и представляет собой новый штамм микромицета, используемого для оценки грибостойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в тропическом климате, в лабораторных условиях. Известен штамм микроскопического гриба Aspergillus flavus N 624, который является продуцентом фермента с высокой активностью. Недостатком указанного штамма является незначительная активность по отношению к различным металлам. В основном он используется для получения уриказы. Известен также ряд штаммов Aspergillus flavus, поражающих металлы. Недостаток этих штаммов недостаточная их агрессивность по отношению к оксидным магниевым и алюминиевым сплавам. Кроме того, все эти штаммы выделены из продуктов коррозии металлов, находящихся в различных климатических зонах СССР, и не могут быть использованы для оценки грибостойкости металлов, направляемых в тропики. Кроме того, все эти штаммы являются патогенными. В качестве прототипа, наиболее близкого к предлагаемому штамму по назначению, является штамм Penicillium chrysogenum ВКМF-3068Д, используемый в качестве тест-культуры для испытания алюминиевых сплавов на грибостойкость. Недостатком этого штамма является незначительно высокая его активность по отношению к сталям, оксидным алюминиевым и магниевым сплавам, экспортируемым в страны с тропическим климатом. Цель изобретения получение агрессивного изолята микроскопического гриба деструктора сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов, применяемых в условиях тропического климата, безопасного для здоровья людей. Для получения штамма Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д была исследована микрофлора продуктов коррозии сталей, алюминиевых сплавов, как не защищенных, так и защищенных оксидными покрытиями и консервационными смазочными материалами, проходившими натурные испытания 16 месяцев в различных климатических зонах Республики Куба. Из различных образцов сталей и алюминиевых сплавов, прокорродировавших в результате натурных испытаний в тропиках, были выделены разнообразные грибы. Причем было отмечено, что видовой состав грибов, обнаруженных в продуктах коррозии металлов, защищенных консервационными смазочными материалами, идентичен видовому составу грибов, содержащихся в продуктах коррозии металлов, не защищенных смазочными материалами. Наиболее часто на пораженных коррозией металлах и преимущественно в промышленной зоне Республики Куба, встречался гриб Aspergillus flavus. Из 200 металлических образцов стальных, магниевых и алюминиевых сплавов указанный гриб был обнаружен в продуктах коррозии 170 образцов. Наиболее жизнеспособным и агрессивным по отношению к сталям, оксидным алюминиевым и магниевым сплавам оказался предлагаемый штамм Aspergillus flavus N IV. Штамм Aspergillus flavus выделен из продуктов коррозии сплава АМц-8, защищенного консервационным составом АУ+10% ЕГ-11ОН, находящимся на экспанировании на промышленной станции Республики Куба, в июне 1989 г. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМF-3190Д. Культурально-морфологические особенности штамма. Aspergillus flavus Link на среде БСА при температуре 25^оС образует колонии диаметром 6-6,5 см желто-зеленого цвета с почти чисто желтым краем шириной 2 мм. В центре колонии клочковато-пушистые от наличия хохолка из бесцветного мицелия. Окраска обратной стороны бежевого цвета. С обратной стороны хорошо заметна радиальная складчатость колонии. Головки конидиеносцев радиальные, большей частью крупные. Высота конидиеносцев, отходящих от субстратных гиф, 200-300 мкм, ширина 5-12 мкм. Конидиеносцы шиповатые, оканчиваются округлым пузырем 10-40 мкм в диаметре. На пузырях более мелких конидиеносцев иногда присутствуют только фиалиды, а на более крупных профиалиды и фиалиды. Размеры профиалид и фиалид примерно одинаковые (8-10 мкм х 2,5-3 мкм), но фиалиды несколько крупнее в тех головках, где профиалиды отсутствуют. Конидии большей частью шаровидные (но есть и грушевидной формы), шиповатые, размер их 3-5 мкм, окраска от очень бледной, почти бесцветной, до желтовато-зеленой. Штамм хорошо растет на сусло-агаре и на среде Чапека. Физиолого-биохимические свойства штамма. Температурный оптимум роста 30^оС, минимум 15^оС, максимум 40^оС. Штамм хорошо растет на консервационных смазочных материалах, применяемых в тропическом климате Республики Куба. Штамм хорошо растет на сусло-агаре, среде Чапека, среде БСА при широком диапазоне рН от 3 до 11. На различных консервационных материалах в тропических условиях Республики Куба указанный гриб чаще всего развивается вместе с грибами Drechslera rostrata Lasiodiplodia theodromae и бактериями рода Bacillus. Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, глицерин, маннит, сорбит, крахмал, минеральное масло, очень плохо усваивает целлюлозу. Отношение к источникам азота: источники азота, такие как азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, сернокислый аммоний, DL-лейцин, L-аспарагин, DL-аспарагиновую кислоту, DL-α-аланин, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, мочевину усваивает совсем незначительно. Антагонические свойства по отношению к другим культурам, выделенным в тех же условиях, отсутствуют. Хранить штаммы можно в лиофильно высушенном состоянии в стерильных ампулах. Непродолжительное время можно хранить в холодильнике в пробирках на косяках агаризованных сред Чапека или сусло-агара. Для поддержания первоначальной активности штамм гриба можно хранить в пробирках с минеральной средой (состав, г/л: КН₂РО₄ 1,0; MgSO₄ 0,5; NaNO₃ 3,0; KCl 2,0, вода водопроводная остальное) с минеральным маслом МК-8 в соотношении минеральная среда масло 3:2. Предлагаемый штамм непотогенен. П р и м е р 1. Выделение штамма. С пораженных коррозией металлических образцов сплава АМц-8, экспонировавшихся на промышленной станции Республики Куба, соскабливали стерильным шпателем 0,1 г рыхлых продуктов коррозии сплава, переносили с соблюдением стерильности в ступку, затем измельчали и переносили в чашку Петри с застывшей средой сусло-агар. Помещенные на поверхность питательной среды продукты коррозии алюминиевого сплава тщательно растирали стерильным шпателем по всей поверхности среды сначала в первой чашке, а затем этим же шпателем протирали поверхность среды последовательно во 2-й, 3-й, 4-й, 5-й чашках. Чашки закрывали крышками и инкубировали в термостате при температуре 30^оС в течение 10-14 сут. После инкубирования в 5-й чашке выросли изолированные, преобладающие над другими грибами колонии Aspergillus flavus Link. С отдельных колоний гриба небольшое количество спор перевивочной иглой переносили в чашки Петри с застывшей средой сусло-агар и инкубировали при тех же условиях. После окончательного пересева, в результате которого была получена чистая культура изолята, ее проверяли общепринятыми микробиологическими методами на чистоту, отсевали в пробирки на косяки со средой сусло-агар, термостатировали при температуре 30^оС 10 дней и затем хранили в холодильнике при температуре 4^оС. В дальнейших исследованиях выделенный изолят применяли для проверки на грибостойкость стали 3 и оксидированных магниевых и алюминиевых сплавов. П р и м е р 2. Испытание стали 3 и оксидных алюминиевых и магниевых сплавов на грибостойкость. Для испытания металлов на грибостойкость вначале подготавливали образцы. При этом нарезали образцы из ст.3 размером 10х20х2 мм, шлифовали до класса ▿^0,4 чистоты поверхности. Затем образцы обезжиривали бензином Б-70, протирая мягкой ветошью, смоченной в бензине, по поверхности металлической пластины. Аналогичным образом производили обезжиривание в ацетоне. После обезжиривания образцы взвешивали на весах Sartorius, заворачивали в крафт-бумагу и стерилизовали в сушильном шкафу HS61А при температуре 165^оС 2 ч. При подготовке образцов из алюминиевых сплавов поступали следующим образом: образцы из сплава АК-6 нарезали из прутка диаметром 50 мм с толщиной 4 мм, затем образцы по диаметру разрезали на 4 равные секторные части; образцы из сплава Д16 нарезали из плоского плакированного листа алюминиевого сплава Д16 размером 10х50х2 мм. Волосяной щеточкой нарезанные образцы из алюминиевых сплавов обезжиривали венской известью, промывали водой, промокали фильтровальной бумагой и подвергали анодному окислению в растворе состава; серная кислота (пл. 1,84) 200 г/л; при температуре 20^оС и плотности тока 1 А/дм²; продолжительность 60 мин. Наполнение оксидного слоя образцов производили в растворе двухромовокислого калия (50 г/л) при температуре 90^оС в течение 30 мин. При подготовке образцов из магниевого сплава нарезали из плоского прокатного листа магниевого сплава МА-8 с оксидированной поверхностью пластины размером 10х50х2 мм, у которых плоские стороны имели оксидное защитное покрытие заводской поставки, а торцы не имели защитного покрытия. Нарезанные образцы из магниевого сплава МА-8 обезжиривали венской известью с помощью щеточки, промывали водой, промокали фильтровальной бумагой. Приготовленные образцы (как изложено выше) из сплавов АК-6, Д16 и МА-8 высушивали в сушильном шкафу при температуре 80^оС 15 мин. Затем образцы взвешивали на всех Sartorius, заворачивали в крафт-бумагу и стерилизовали в сушильном шкафу 2 ч при температуре 165^оС. Подготовленные к испытаниям образцы из ст.3, оксидированных алюминиевых и магниевых сплавов подвергали исследованию на грибостойкость контактным методом, сущность которого заключается в выдерживании образцов на поверхности газона тест-культуры, выращенной на питательной среде сусло-агар в чашке Петри. На поверхность питательной среды сусло-агар в чашках Петри помещали одну бактериологическую петлю спор гриба Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д и растирали равномерно шпателем по всей поверхности питательной среды. Чашки Петри заворачивали в бумагу и термостатировали при температуре 30^оС. После термостатирования, когда на поверхности среды образуется сплошной рост гриба, на его поверхности стерильным пинцетом располагают простерилизованные образцы разных металлов. Количество испытанных образцов каждого металла должно быть не менее 5 шт. Контролем служили те же образцы металлов, но размещенные на поверхности стерильной питательной среды в чашках Петри, не засеянной тест-культурой. Подготовленные к испытаниям чашки Петри с металлическими образцами помещали в эксикатор, на дно которого наливали стерильную дистиллированную воду, за счет чего в эксикаторе поддерживали влажность 96-98% Эксикаторы располагали в термостатной комнате при температуре 30±2^оС. Продолжительность экспозиции опытных и контрольных образцов 9 месяцев. Аналогичные испытания проводили со штаммом Penicillium chrysogenum BKMF-3068Д, который использовали в качестве прототипа. После окончания испытаний чашки Петри с металлическими образцами подвергали стерилизации в автоклаве ВК-75 при давлении 2 атм и температуре 120^оС 2 ч. После убивки (стерилизации) металлические образцы очищали от мицелия, питательной среды и продуктов коррозии с помощью скальпеля. Окончательно продукты коррозии стали 3 удаляли в растворе состава: кислота соляная (пл. 1,19) 500 см³/дм³; ингибитор ПБ-5 10 г/дм³; температура 18-25^оС. Продукты коррозии алюминиевых сплавов удаляли в растворе состава: хрома (VI) окись 20 г/дм³; кислота ортофос- форная (пл. 1,59) 50 см³/дм³; температура 80-95^оС. При удалении продуктов коррозии образцы пинцетом в вертикальном положении опускали в соответствующие растворы, налитые в стакан, и выдерживали для стали 10 мин, а для алюминиевых сплавов 1 мин. Затем образцы вынимали из раствора, промывали сначала в воде, затем в ацетоне, просушивали и взвешивали. Потерю массы образцов определяли по формуле K · 100% где Δm потеря массы испытуемого образца;
Δm m_o m, где m_o масса образца до испытаний, г;
m масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г. Площадь пораженной коррозией поверхности образца (в) определяли наложением на поверхность металлического образца пластины из прозрачного материала с нанесенной на нее сеткой. По результатам измерения коррозионных очагов вычисляли процент коррозионного поражения металлических образцов по формуле:
S_i= · 100% где S₁ площадь коррозионного очага на лицевой стороне образца, клетки;
S₂ площадь коррозионного очага на обратной стороне образца, клетки;
S_оцен площадь всей оцениваемой поверхности образца, клетки. Грибостойкость материала обратно пропорциональна площади пораженной коррозией поверхности образцов. Глубину коррозионных поражений определяли с помощью микроскопа. Результаты сравнительных испытаний на грибостойкость образцов из стали и оксидных алюминиевых и магниевых сплавов с использованием в качестве тест-культур штаммов Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д и Penicillium chrysogenum BKMF-3068Д представлены в табл.1-3. Из табл. 1 видно, что предлагаемый штамм гриба в 2 раза на стали 3 и более чем в 2 раза на оксидированных алюминиевых сплавах и оксидированном магниевом сплаве увеличивает площадь пораженной поверхности исследуемых образцов по сравнению со штаммом-прототипом (ВКМF-3068Д), что свидетельствует о его более высокой коррозионной активности. Из табл. 2 следует, что убыль массы металла из стали 3, оксидированных алюминиевых и магниевых сплавов под действием предлагаемого штамма в 2 раза выше по сравнению со штаммом-прототипом. Данные табл.3 показывают, что глубина коррозионных поражений образцов из Ст. 3 и оксидных алюминиевых и магниевых сплавов под действием предлагаемого штамма тоже почти в 2 раза превышает глубину коррозионных поражений образцов по сравнению с известным штаммом-прототипом. Из представленных экспериментальных данных видно, что при использовании предлагаемого штамма гриба Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д в качестве тест-культуры для оценки микологической стойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов почти в 2 раза и более увеличиваются площадь пораженной поверхности металлов, убыль массы металла и глубина коррозионных язв по сравнению с известным штаммом-прототипом Penicillium chrysogenum BKMF-3068Д. Следовательно, использование предлагаемого штамма микромицета в качестве тест-культуры позволяет повысить достоверность результатов при испытании сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов, используемых в условиях тропиков, на грибостойкость.

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus flavus Link ВКМF-3190Д как тест-культура для определения грибостойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---