Способ получения реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени

 

Использование: в медицинской промышленности для получения реактива, используемого при оценке состояния больных с коагулопатиями. Цель: повышение чувствительности реактива и увеличение сроков хранения его специфических свойств. Сущность изобретения: отходы производства соевого лецитина растворяют в хлороформе. К раствору добавляют этанол при соотношении биологического материала - хлороформа - этанола 1 : 8 : (37 - 40). Надосадочную жидкость выпаривают. Остаток растворяют в петролейном или диэтиловом эфире и осаждают целевой продукт ацетоном. Образовавшийся осадок высушивают и затем растворяют в 5%-ном растворе сорбита и лиофилизируют. Положительный эффект: изобретение обеспечивает получение реагента из отходов производства, что позволяет получить дешевый реактив в больших количествах. Реактив является более чувствительным по сравнению с реактивом фирмы "Reanal" к нарушению 1 фазы свертывания крови. Специфические свойства реагента не изменяются при хранении при +4°С в течение года. 3 табл.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается способа получения реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ) из отходов производства соевого лецитина, используемого в качестве эмульгатора жировой эмульсии для внутривенного введения. Известен способ получения реактива для определения АПТВ из реактива для определения протромбинового индекса - тромбопластина, полученного путем водной экстракции мозговой ткани человека. Недостатками данного метода является его нетехнологичность из-за источника сырья и получение реагента с недостаточно высокой активностью и малым сроком хранения. Цель изобретения - расширение ассортимента реагентов для определения АПТВ, обладающих высокой чувствительностью и увеличение сроков его хранения. Эта цель достигается тем, что в качестве источника фосфолипида (ФЛ) используют отходы производства соевого лецитина, которые растворяют в хлороформе, добавляют этанол, причем на 1 мас.ч. фосфолипидов берут 8 об.ч. хлороформа и 37-40 об.ч. этанола, далее осадок отбрасывают, надосадочную жидкость выпаривают, сухой остаток растворяют в петролейном или диэтиловом эфире и осаждают целевой продукт ацетоном с последующими высушиванием, растворением в растворе сорбита и лиофилизацией. Способ осуществляется следующим образом: фосфолипиды сои, нерастворившиеся в этаноле в процессе экстракции соевого лецитина из обезжиренных фосфатидов (Пучкова С.М., Шанская А.И., Недачина Н.А.. Способ получения соевого лецитина. Авт.св. N 773993, кл.А 61 К 35/78), растворяют в хлороформе из расчета 8 мл хлороформа на 1 г фосфолипидов. Затем при перемешивании добавляют 96% -ный этиловый спирт (37-40 мл на 1 г ФЛ). После 1-3 ч выдержки осадок отделяют фильтрованием и отбрасывают. Фильтрат упаривают под вакуумом при 30-50оС. Сухой полупродукт растворяют в петролейном или диэтиловом эфире (1 мл на 1 г ФЛ) и осаждают целевой продукт ацетоном из расчета 1:5. Осадок отделяют центрифугированием, высушивают в вакууме и растворяют в 5% -ном растворе сорбита (рН - 7,4). Раствор фосфолипидов оптимальной концентрации (0,1-0,2% ) в 5%-ном растворе сорбита подвергают лиофильной сушке и после восстановления используют в качестве реактива для определения АПТВ. П р и м е р 1. 10 г нерастворившихся в этаноле фосфолипидов после непосредственной экстракции соевого лецитина из обезжиренных фосфатидов растворяют в 80 мл хлороформа. Неактивные в отношении свертывания примеси осаждают добавлением тонкой струйкой при перемешивании 370 мл этилового спирта. После выдержки в течение 1 ч осадок отфильтровывают и отбрасывают. Фильтрат выпаривают досуха под вакуумом с использованием роторного испарителя при 30-35оС. Сухое вещество растворяют в 10 мл петролейного эфира, раствор вливают при перемешивании в 50 мл ацетона, образовавшийся осадок фосфолипидов отделяют центрифугированием при 2500 об/мин 4оС и высушивают в вакууме. Получают 2,68 г конечного продукта, что составляет 26,8% от исходного. Полученные фосфолипиды имеют следующие характеристики: фосфор 3,4%; кислотное число 54,0 мг КОН/г; показатели окисленности: количество диенов 0,41%, триенов 0,11% , перекисное число 0,02 мг % l2; фракционный состав по данным ТСХ: содержание лизофосфатидилхолина (ЛИЗОФХ) 1,6%; фосфатидных кислот (ФК) 4,0; фосфатидилинозита (ФИ) 13,8; фосфатидилсерина (ФС) 3,1% фосфатидилхолина (ФХ) 21,4%; фосфатидилэтаноламина (ФЕА) 33,8%; нейтральных липидов 6,5%; неидентифицированных фосфолипидов 15,8%; кисл/нейтр 0,40; иодное число, рассчитанное по жирно-кислотному составу по данным ГЖХ, 141,1. Для получения АПТВ-реактива ФЛ растворяют в 5%-ном растворе сорбита (рН 7,4) до концентрации 0,15%. Раствор разливают в пенициллиновые флаконы по 2 мл, замораживают при (-582)оС, закаливают в течение 15 дней и подвергают сублимационной сушке. Продолжительность процесса сублимации составляет 18 ч. Конечная температура препарата в период досушивания 19оС. Продолжительность сушки 36 ч. П р и м е р 2. 50 г отходов производства соевого лецитина, высушенных на воздухе и хранившихся при 4оС в течение 5 мес, растворяют в 400 мл хлороформа, в раствор при перемешивании тонкой струйкой вливают 2 л этилового спирта. После 2 ч выдержки осадок отфильтровывают и отбрасывают. Фильтрат выпаривают с помощью роторного испарителя при 40-50оС, сухое вещество растворяют в 50 мл диэтилового эфира. Эфирный раствор при перемешивании вливают в 250 мл ацетона. Осадок центрифугируют при 2500 об/мин, 4оС и высушивают в вакууме. Получают 11,35 г конечного продукта, что составляет 22,7%, от исходного. Характеристики полученного фосфолипида: фосфор 3,00%; кислотное число 52,2 мг КОН/г; количество диенов 1,03%; триенов 0,27%; перекисное число 0,28 мг% I2; фракционный состав по данным ТСХ: лизо ФХ 2,9%; ФИ 18,1%; ФС 12,4% ; ФХ 16,1% ; ФЭА 33,6%; неидентифицированных ФЛ 16,7%; кисл/нейтр 0,43% ; иодное число, рассчитанное по жирно-кислотному составу по данным ГЖХ, 145,3. Фосфолипиды растворяют в 5%-ном растворе сорбита (рН 7,4) до концентрации 0,15%. Раствор разливают в пенициллиновые флаконы по 2 мл, замораживают при (-582)оС, закаливают в течение 15 дней и подвергают сублимационной сушке. Продолжительность процесса сублимации составляет 19 ч. Конечная температура препарата в период досушивания 20оС. Продолжительность сушки 35 ч. По предлагаемому способу получены 4 серии реактива и изучены их свойства. В процессе отработки технологии были сформулированы требования к сырью и к отдельным стадиям процесса. Соотношение 1 мас.ч. фосфолипидов: 8 об.ч. хлороформа : 37-40 об.ч. 96% -ного этилового спирта является оптимальным и позволяет получить реагент - заменитель 3 фактора тромбоцитов, обладающих прокоагулянтными свойствами и чувствительный к коагуляционным нарушениям исследуемой плазмы. П р и м е р 3. 20 г нерастворившихся в этаноле фосфолипидов после экстракции соевого лецитина из обезжиренных фосфатидов, высушенных на воздухе и хранившихся при 4оС в течение 2 мес. растворяют в 160 мл хлороформа, в раствор при перемешивании тонкой струйкой вливают 760 мл 96%-ного этилового спирта. После выдержки в течение 1 ч осадок отфильтровывают и отбрасывают. Фильтрат выпаривают досуха под вакуумом с использованием роторного испарителя при 30-35оС. Сухое вещество растворяют в 20 мл петролейного эфира, раствор вливают при перемешивании в 100 мл ацетона, образовавшийся осадок фосфолипидов отделяют центрифугированием при 2500 об/мин 4оС и высушивают в вакууме. Получают 5,14 г конечного продукта, что составляет 25,7% от исходного. Полученные фосфолипиды имеют следующие характеристики: фосфор 3,2%; кислотное число 53,6 кг КОН/г; показатели окисленности: количество диенов 0,65% , триенов 0,23%; перекисное число 0,08 мг.% I2, фракционный состав по данным ТСХ: содержание лизофосфатидилхолина 1,3%; фосфатидилинозита 14,9%; фосфатидных кислот 3,2%; фосфатидилсерина 4,5%; фосфатидилхолина 20,9%; фосфатидилэтаноламина 33,7%; неидентифицированных фосфолипидов 14,9%; кисл/ нейтр 0,4; иодное число, рассчитанное по жирно-кислотному составу по данным ГЖХ, 143,8. Далее поступают по примеру 1. При уменьшении количества этилового спирта до 35 об.ч. и ниже на 1 мас. ч. фосфолипидов оставшиеся в растворе малоактивные фосфолипиды подают в конечный продукт и снижают его прокаогулянтную активность. При увеличении количества этанола свыше 40 об.ч. на 1 мас.ч. фосфолипидов падает выход конечного продукта без повышения его специфической активности. Точную концентрацию раствора конечного продукта, лежащего в границах 0,1-0,2% , подбирают опытным путем на основании данных специфической активности. Уменьшение концентрации раствора сорбита менее 5% ведет к ухудшению внешнего вида высушенного реагента, уменьшению стабильности при хранении и снижению специфической активности. Лиофилизованный реагент восстанавливают добавлением хорошо перемешанной суспензии каолина (5 мг на 1 мл дистиллированной воды), после чего флакон интенсивно встряхивают в течение 3 мин. Восстановленный таким образом реагент стабилен при 4оС в течение недели, а при комнатной температуре в течение одного дня. Полученный предлагаемым способом АПТВ-реактив оценивался на основании определения АПТВ доноров и больных гемофилией. АПТВ-тесты проводились на плазме, полученной от доноров и от больных гемофилией. Кровь отбирают венопункцией и стабилизируют 3,8%-ным раствором основного цитрата натрия ( 9 ч. крови : 1 ч. стабилизатора). После перемешивания и центрифугирования в течение 10 мин при 4000 об/мин пипеткой отбирают плазму, которую следует использовать в течение 2 ч после отбора. В нагретые при 37оС центрифужные пробирки помещают 0,1 мл тщательно перемешанного АПТВ-реагента, инкубируют при 37оС в течение 3 мин. Затем добавляют 0,1 мл исследуемой плазмы и инкубируют в течение 2 мин с периодическим встряхиванием. По истечении срока инкубации добавляют 0,1 мл подогретого до 37оС 0,025 М раствора хлористого кальция и одновременно включают секундомер, начиная измерение времени свертывания. Определение повторяют 2 раза и берут среднее арифметическое значение. Определение АПТВ одних и тех же образцов плазмы доноров проводили с использованием АПТВ-реактивов, получен- ных по предлагаемому способу (из отходов соевых ФЛ), по прототипу (из мозговой ткани человека), и широко применяющегося в практике реактива фирмы "Reanal" (Венгрия). Результаты приведены в табл.1. Как видно из табл.1, АПТВ доноров, определенное различными реагентами, различалось незначительно, т.е. прокоагулянтная способность предлагаемого реагента из отходов соевых фосфатидов не отличалась от таковой реагентов из мозговой ткани человека и реактива фирмы "Reanal". При обследовании больных гемофилией вычисляли индекс АПТВ - отношение АПТВ больного к АПТВ донорской смеси, которое показывало глубину коагуляционного дефекта в каждом конкретном случае. АПТВ донорской смеси, в данном случае - АПТВ смеси не менее 5 доноров, определенное реактивом из того же флакона в то же самое время, что и АПТВ больного. При проведении данного исследования авторы не располагали реактивом, полученным по прототипу, и поэтому реактив, полученный предлагаемым способом, сравнивали с реактивом фирмы "Reanal". Сравнение чувствительности двух реактивов проводили сопоставлением индексов АПТВ, определенных разными реактивами для одного и того же больного. Часть данных представлена в табл.2. Как видно из табл.2, степень нарушения АПТВ зависит от уровня коагуляционного ФУШ, при увеличении активности последнего индекс АПТВ уменьшается. Изменение уровня ФУШ от 2 до 10% соответствует изменению индекса АПТВ с реактивом фирмой "Reanal" от 2,79 до 1,40, в то время как предлагаемый реактив дает изменение от 5,29 до 1,56, что свидетельствует о его большей чувствительности. При исследовании выборки из 32 больных гемофилией с использованием АПТВ-реагента из соевых бобов и реактива фирмы "Reanal" были получены данные, подтверждающие большую чувствительность предлагаемого реагента. Так, в среднем по группе индекс АПТВ с реактивом фирмы "Reanal" составил 2,260,12 ( S), соевый реактив 3,12 0,21 (t=3,55, различие статистически достоверно). Применение лиофильной сушки позволило получить реагент, обладающий рядом преимуществ по сравнению с прототипом. Специфические свойства реагента не изменяются при хранении в течение года при 4оС, в то время как реагент, полученный по прототипу, стабилен в течение 3 мес при хранении при -20оС. В табл.3 даны показатели АПТВ (в сек) доноров при использовании реактива из отходов соевых фосфатидов в процессе хранения. Снижение требований к температурному режиму хранения и сухая форма позволяют транспортировать реагент на большие расстояния в любое время года. АПТВ-реактив, полученный по предлагаемому способу, определяет АПТВ доноров такое же, как и реактив из мозговой ткани человека и реактив фирмы "Reanal", но, более чувствителен к нарушению I фазы свертывания крови. Реактив более стабилен, срок его хранения увеличен до года, транспортабелен. Предлагаемый способ не использует в качестве сырья мозговую ткань или кровь человека, что исключает возможность инфицирования обслуживающего персонала, не требует дорогостоящих и дефицитных источников сырья, а позволяет утилизировать отходы производства соевого лецитина, не используемые в настоящее время, что позволяет получить гораздо более дешевый реактив для определения АПТВ, чем реактив из мозговой ткани человека, и реактив фирмы "Reanal". Необходимо также отметить практически полное отсутствие в лечебных учреждениях страны реактива для определения АПТВ, поэтому столь важный тест, используемый во всем мире для оценки состояния многочисленных больных с нарушениями I фазы свертывания крови, для профилактических исследований перед всеми хирургическими вмешательствами (наряду с определением времени кровотечения и протромбинового времени) в нашей стране не проводится.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАКТИВА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННОГО ПАРЦИАЛЬНОГО ТРОМБОПЛАСТИНОВОГО ВРЕМЕНИ, включающий обработку биологического материала органическими растворителями, концентрирование полученного раствора и последующее растворение сухого остатка, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реактива и увеличения сроков сохранения его специфических свойств, в качестве биологического материала используют отходы производства соевого лецитина, которые растворяют в хлороформе и затем обрабатывают этанолом при соотношении биологического материала, хлороформа и этанола, соответственно равном 1 : 8 - 37 : 40, далее остаток растворяют в петролейном или диэтиловом эфире, добавляют ацетон, после высушивания полученный порошок растворяют в 5%-ном растворе сорбита и лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.07.2004

Извещение опубликовано: 27.04.2005        БИ: 12/2005




 

Похожие патенты:

Изобретение относится к лесохимической промышленности и касается способов получения воска

Изобретение относится к масложировой промышленности, а именно к способам получения ланолина

Изобретение относится к масложировой промышленности

Изобретение относится к парфюмерно-косметической, пищевой, фармацевтической и медицинской промышленности, а именно к способам получения лецитина

Изобретение относится к оборудованию для масло-жировой промышленности, а именно к шнековым прессам для отжима растительного масла

Изобретение относится к масложировой промышленности, - а именно к способам выделения нейтрального жира из соапстоков и направлено на интенсификацию процесса, снижение потерь и повышение качества целевого продукта

Изобретение относится к способам получения восковых продуктов, используемых в качестве диспергаторов резиновых смесей, и может быть реализовано в нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиохирургии и анестезиологии

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано при диагностике и лечении заболеваний щитовидной железы
Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов для тромболитической терапии

Изобретение относится к биохимии и касается средств для реконструкции мембран In vitro

Изобретение относится к лечебному питанию

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской промышленности, и касается разделения крови на гем и глобин

Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений, меченных радиоактивными изотопами, и может быть использовано для получения меченного тритием тромбоксана B2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения кейлонов
Наверх