Способ получения солей n-ацил-или n-арилдезоксинуклеозид-5 @ -фосфатов
Использование: в качестве промежуточных продуктов в синтезе биологически активных веществ и для получения ДНК- и РНК-зондов в медицинской диагностике . Сущность изобретения: продукт:солиN-ацил-или N-а рил дезоксинуклеозид-Б1-фосфатов формулы I: Jwo/ ()jNH vr он где в ia to1 МНСОС6Н5 N N 16 # N К в МНСОСБН5 ,- Лм 15 У NH О NHCCH(CHj)2 выход: 1а, 80,2%; 10, 84%; 1в, 78%. Реагент 1: триметилхлорсилан. Реагент 2: дезоксинуклеозид, Условия реакции: в среде пиридина , 4-5-кратный избыток реагента 1. Реагент 3: ацилили арилхлорангидрид соответствующей кислоты. Условия реакции: в среде пиридина при молярном соотношении реагент 3; реагент 2 (2-3):1 с выдерживанием реакционной смеси при комнатной температуре и охлаждением до 0-(-30)°С. Реагент 4: 1,5-2,5 н водный раствор аммиака . Условия реакции: в присутствии триэтиламина, взятого в эквимолярном количестве к суммарному количеству реагентов 1-3 с выделением целевого продукта обргщеннофазовой хроматографией. 3 з.п. ф-лы, 9 табл, (Л о С
СОЮЗ COBETCKI
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (s1)s С 07 Н 19/10, С 07 D 239/47, 473/18, 473/34// А 61 К 31/70
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1Ж(И" 3 IÓ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ о
1в: В* — остаток гуанина —, „,о (NH н +NHIICH(CH>)y i
1 о (21) 4737744/04 (22) 18,09.89 (46) 15.10,92. Бюл, ¹ 38 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР (72) И,В.Цветков, Е.И.Дужинский, Н,И,Комарова и В.П.Старостин (56) R.Ê.Palph, Н.G.Khorana. J. Am. Chem.
Soc., 1961, v. 83, N 13, рр. 2926 †29, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ NАЦИЛ- ИЛИ N-АРИЛДЕЗОКСИНУКЛЕО3 ИД-5 -ФОСФАТОВ (57) Использование: в качестве промежуточных продуктов в синтезе биологически активных веществ и для получения
ДHK- u PHK-зондов в медицинской диагностике. Сущность изобретения; продукт: соли N-ацил- или
N-арилдезокси нчклеозид-5 -фосфатов
Фор л ° (с,н,),нн он
Изобретение относится к химии сахаров, а именно к усовершенствованному способу получения солей N-ацил- или
N-арил-деэоксинуклеозид-5 -фосфатов об1 щей формулы 1
%
НО-I -OCII O В + )(° (с,нб), он где 1а: B — остаток аденина — NHcoc,н, < Xa"
1б: В* — остаток цитозина —, NHcoc,н, С, 1
„, Ы„„ 1768610 А1 где
NHCOCgH) () NHCOCgH)
1а (g Iб (N N „о
i н
lб (:.3. II
N ннссн(сн,), Выход: 1а, 80,2%; 10, 84/; 1в, 78%. Реагент
1: триметилхлорсилан. Реагент 2; дезоксинуклеозид, Условия реакции: в среде пиридина, 4 — 5-кратный избыток реагента 1.
Реагент 3: ацил- или арилхлорангидрид соответствующей кислоты. Условия реакции: в среде пиридина при малярном соотношении реагент 3; реагент 2 = (2 — 3):1 с выдерживанием реакционной смеси при Koмнатной температуре и охлаждением до 0+30) С, Реагент 4: 1,5 — 2,5 н водный раствор аммиака, Условия реакции; в присутствии триэтиламина, взятого в эквимолярном количестве к суммарному количеству реагентов 1 — 3 с выделением целевого продукта обращеннофазовой хроматографией. 3 з.п, ф-лы, 9 табл, которые могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов в синтезе дезоксиолигонуклеотидов, явля1ощихся биологически активными веществами, а также для получения ДНК-зондов для медицинской диагностики.
Известен способ получения N-ацил- или
N-арилдезоксинуклеозид-5 -фосфатов путем взаимодействия избытка ацил- или арилхлорангидрида с дезоксинуклеззид-5
1 фосфатом в пиридине с последующим щелочным гидролизом образованнь к ацилили арилфосфатных и 3 -0-ацил- или арилэ1 фирной связей. Для этого реакционную смесь после ацилирования при комнатной температуре обрабатывают 1 M раствооом
NaOH при 0 С в течение 5 — 10 мин с последующей нейтрализацией избытка щелочи
Ио 100(;г )г I ) ln«l t (Чг ) !!, НатрИЕВ)<Ю СО)! Ь НукГ(Е(31)г/ ."" <1-()ср"""
ПЕрЕВОЛя Г В Г(ИШ ДИНИЕ .;: - jnB;-,;,(3., 0(г)1.:()
ХрОМа Tpf ра) !il и Гt! I O((, ((; (: it :. »! r !, rir) .
ДУХ! С f! C l 10!Lit: I .): "., л 1 и (<:. 1 лозе и лиофи::,зл((ии
О,.",11 Л К 0 и 3 I 3» С 1! (1 и .. )
До(1 Сyl()сеiB»if г I ftfy, ".,"., :. !3 .
--;) Е jtr)C t /1 ебЛО I<1100(ЗВ i l ив !3 К»С Г (И а О) I, 0" С, 5- 1 6! i.! L t), :,:, ВОДа ПОЛУ !а г,ле<й На)fj!1(,1;<3 < Да (3 r;L РИД<«ЧI!,",((:3 го С(,г;:г ((B t )
Пост:.(()лен! lая (»rlk! ДОС! (! ;!r- Г(:," Г)(1< t;1;t. ГВЕМ <,((И СПОСС60 vl Г)0/)
ВКЛ ЩЧ " оt! tг)М <3 л-г «Ãt (г- гв;-тгг) In B I (l а;3ИЛХЛораНГИДри)1а СОС-ге»ТОТ<3)гк3)тгclt l k L; .— ЛОТЫ С CQQTBBÒCiBL< (j! t!1)I, 1; Зо OХЛа>К()ЕН!)Е;,i Отой С; „ С,:,) 1-1.;t(fjpnt)-.Е;../ (-,,ri. дукта резко)1)и и ыдел-.—;ием ое/t»BQ(r) (1()::дукта Хр:)1.;(: Г. ((!B(r Ей, fff)u Д (3 О К С И Н L/ К Л Г; 0 () .,: i !1r" Ва! j!., 1 Е г))-, Н (); < (3 Гъ ) Г) ягывают 4-.. -1 )х» r "..l !!:-"3!.,l;<сгмг (fl! >, )i)
ЛО!3СИ/IаНЗ гв f),!l» ll,:,",. .Г;а. ГI;pt :,", С(ад()»й) ГИД130ЛИЗВ С"..10CB О г(а.:>:,Д(. . (:,0 б (.),, г 1 ),; рОЛИЗ QG /LÖBCTBC: :;)T 1 -,, .) <1 Вод);Ь(1 тВСрОМ ) r)I )i) .
ПОЛуЧЕГ)Ия адЕНОЗИН(30дц»г.лщ»ГО ПрОДуКта РЕВКЦИОЫН)/Ю СМЕСЬ ВЫДЕР>К()В":Ют В I»c)ЕНИЕ 90 — 120 МИН, ПрИ ПОЛУ".fBH И ц:.ЛГИ,!ilfla двр>кащего продукта — 5-- 1.< .;ц;». <3 <3 cjó lBB Гуа и ози н соде р>ка ще гp 30- 60; в П !3 и м е р 1, Синтез М -6»I I: 3! /t;)BB< "3;— СиадЕН(3ЗИН-5 фОсфат», Тp!.,. - .г); .Е .;*,(,,r?f!L)!3HOLr) СОЛИ В К р >/ Г/3 О д(3 !.) Н л/ Ю К 0 Л б,Г B I< 1 C. C ((Ct (: T » trj 5 0 мл загру>ка;от 1 г(3,02 ммоль),!t BQ!(c д 1101- 1 зин-5 -фосфата В Н2-фо!13ги< .:1 с
40 мин. К высушенному нуклео) t,.,lk 0му териалу добавляют 14,6 мг) пиридина и 1,53 мл (12,08 ммольгг три(<летилхло(3силагlB, закрывают колбу и встряхива)от ее в течение 15 мин при комнатной теклпег)атур(<„.,.,:33/ ..:! t" )к!111(31)НГ) . t а Осе с ОбразоОслг :Р 1 !!!) PI,Д!" i! .! и ХЛОРИДа ДО(! <г () 1<) r), "Q, 0il t.),.t Qn lг) бе из(31)j! . и .я:.1 f! l ttc Il;t T и:,3и в тряхивании C )1 (. 0 . ) а ) ) 1.".1 . t ""; П (3 Р а Г tt f )
-3())ь :, "((гавля)о! 13,22 1:,ë Р)20,, -4 !,!,,,; .Q /f k r ) т р: 1 т:,<1 Г а (,1!, 1 а и 5, 6 6 (и л < ! 2(,, l . .,t, !It r г . ;(г Г 15 мин !3pli ":г!(Л, (1!Q!1 ТЕ - :! l "i "t l у f, (:. 110, 1, (1! t)/)Q !!0 jf(1 0 (1 (1 р 1)д t -! И Е " /!О Г: М Е С Ь )/ Г а f 1 f 3
1 .10: . г О::1 I <; . .-t B O i. 1 ..:. -:;.", О 1."r B C n r, a 6 Ft B >3 H p F p :;ti,.B.. =
Ер;, 1 — 1, /. t I, I, ) Г г)i
nr,, r t:-. 0 ),,«;, УПОР,:: -)<зт И ВЫСа>КИг:.:,г; Г Г, Г СГ)1,(-tL! ",:11 f), !.1Ь(оа l)IIL!V1 PCB(10)<, . t,).(t;) t,TQ! B-.IB!3i )3-:, r . /)i!. 3 Г B 13 j! Н Ь! ". I)!; Crit ((< t t!)я В б ."()0 (3» f!, )С;)с
1 (0,91 0,03 1,33 2 Яt 1 //гл Г,г) 1,71 1,36 ! 1;1 и г. е 0 2 Синтез f -: е. .зоилдезок(. t)11jt,:" ГИ! - - Г,!!f Е t;r t il 1ЗТ и. c . l<)110(1 ИЙ (,(Н-;.-,;;1<.,! B!i ln(rI) If!0 Оli!1CBI)flpl )У B г! (),l. i:Ij» 1., за !лс ключ»ни(м ГОГО. что В pBBI< 1.;,,;t б.::.. Г О,с„"3 /3,02:!)Оль) дезо,"си)(ити.1() „;;(11-Гб(-,)(30;3)ата,-, I-!i- ÄQfjr.;;.!Å И рг)аКцИ)О б (. ((:3011/ ));..".t, 3!!!1:г в е)Г))гт 5 (<1 (1 н, ВыхОД 1;)А rJf,i.iz — 1.30 r ((34.0";/,), )лем нтный анал))з: С 52,1 (5 f,56): Н 6,45 (6.49), IU 1 1,15 l10.,93). С((»к.((3< льнь,й аь)аг.из: f::;:B()-:2,2 10 ))/1 см ((t К(0ВГ;!,))ЫЕ СО<ЗТНГ)(«."1)Ия B бу())ЕрЕ, гл ((С вЂ” () I,: —; — i р (-I <<1 (I 2 БГ) /260 0.(35-F- 0,03 3 /0,/; Г,:r) 0,72 0,44 ".: 90/26! ) 0,46 П р и l Е р 3. С(Л(ГГЕЗ )К) -ИЗОбутнрИЛдЕ3 0 ." <И<1 - r<з (1 0:1! 1! 3 - -; - ф О с <1) <з< 1 а т !3 и 3 т 11 л B M (< ) o -,, l 1L,и Г i < 1 л Сиriтез ВB":,уг а)! B(!оп)чн0 0.01)санf)QM) B .t= i3B ";- „.1; КЛ)0 11 )г ЛЬ) 1)З()б<) ili! pL ;;,,:р!)Ла, а рвах).(!<1(О ИЗл)1768610 60 0,85 + 0,03 7 О / 2 б О 8 О / 2 6 О Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют соотношения бензоилхлорида к дезоксинуклеотиду. Результаты приведены в табл. б. 55 Пример ы 40 — 43, Определение оптимального соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду. бутирилирования ведут 30 мин. Выход ТЭА dpibuG — 0.98 г(78%). Элементный анализ: С 47,0 (46,33), Н 6,75 (6 80); N 16,23 (16,21). Спектральный анализ; Е260=1,75 10 М см 5 Спектральные соотношения в буфере Трис-ацетат, рН 8,0; 250/2 0,76 0,72 2 9 О / 2 6 О 0,60 Пример ы 4-11, Выбор времени 15 реакции бензоилирования для dpA, Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом время выдерживания реакционной смеси после добавления бензоил хло рида меня ют от 5 мин до 3 ч. Резул ь- 20 таты приведены в табл. 1. Пример ы 12 — 15, Выбор времени реакции бензоилирования dpC. Синтез ведут аналогично описанному в примере 2, при этом время реакции бензо- 25 илирования меняют от 2 мин до 60 мин, Результаты приведены в табл. 2. Пример ы 16 — 20, Выбор времени реакции изобутилирования dpG. Синтез ведут аналогично описанному в 30 примере 3, при этом время реакции изобутилирования меняют от 2 мин до 60 мин. Результаты приведены в табл. 3. Пример ы 21 — 27. Определение оптималbHQI температуры реакционной смеси 35 при добавлении водного аммиака. Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют температуру реакционной смеси перед гидролизом водным раствором аммиака от 37 до -30 С. Ре- 40 зультаты приведены в табл. 4, Пример ы 28 — 34. Выбор оптимальной концентрации водного аммиака в реакционной смеси, Синтез ведут аналогично описанному в 45 примере 1, при этом меняют концентрацию аммиака в реакционной смеси от 0,5 до 4,0 М. Результаты приведены в табл. 5. Пример ы 35-39. Определение оптимального соотношения ацилхлорида к де- 50 зоксинуклеотиду. Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом меняют соотношения триметилхлорсила на к дезоксинуклеотиду, Результаты приведены в табл. 7. Пример ы 44 — 45. Обоснование необходимости использования в процессе триэтиламина. Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом перед гидролиэом реакционной смеси водным аммиаком водном случае добавляют триэтиламин (пример 44), в другом случае (пример 45) — не добавляют. Результаты приведены s табл, 8. Пример ы 46 — 47, Выбор метода выделения целевого продукта. Синтез ведут аналогично описанному в примере 1, при этом выделяют целевой продукт обращенно-фазовой хроматографией (пример 46) или хроматографией на целлюлозе (пример 47). Результаты приведены в табл. 9, Таким образом, предложенный способ получения солей N-ацил- или N-арилдезоксинуклеозид-5 -фосфатов позволяет повысить 1 выход целевого продукта с 49 — 70 до 78— 84% и упростить процесс за счет применения для выделения продукта высокоскоростной обращенно-фазовой хроматографии. исключения трудоемкой стадии хроматографического перевода натриевой соли нуклеотидного материала в пиридиниевую (процесс длительный, требует упаривания больших объемов водных растворов элюата, что можно отнести и к хроматографии на целлюлозе), а также за счет того, что стадия гидролиза не требует строгого технологического контроля за временем и температурой процесса, Кроме того, предлагаемый способ позволяет снизить количество примесей в целевом продукте до 3 — 5 . Формула изобретения 1. Способ получения солей N-ацил- или N-арилдезоксинуклеозид-5 -фосфатов об1 щей формулы о tl М но-Р-ой о В 0 (с2н513ин он где В* — остаток аденина — днсос р 6 5 р танк М или В* — остаток цитозина 1 11сос5н5 Ф или.В* — остаток гуанина— о нн нинсясн(сн,р,, Таблица1 (((и«ние »рсмс})и р з)а())и о:г )з(л.". p()i.:. } . я Ii! до Iic) превращения в целевои продукт Вре(l}i p." )гi, ",и мин г Долг! )г !! ))ример 1 ! ! ! 5 6 г\ .! 9 10 ) 10,. i г г,,() i i г ) ) Долл ;реврав),-.}((» . в целеьой г)ро,.,,кт о>ii)c;,,:. г(а (ме) одса }(икроколоночной обращенi! !-().азова)) х()ом=! Го! р;«})ии. Таблица2, I И } О K С У M f )» P I I (i "() К! ): \ .,): i: С Т В У ИСХОД } г!; Х P () (3»ия}(ие време}(((реакц;и QI)3()LI»L)pf)F3-. )III).)!ID дол)о превращения в целевой продукт Вp«r. ;!л р(ак)(!)и, мин 1)(з()мер Доля превращения в целеадд ггродукт. Г, 12 13 14 15 5 F)0 83,0 95,2 96,1 95,5 Таблица3 Влиян((е времени реакции изобутирилиров()})(.я } а долю превращгения в целевой продукт Пример Р(1".мл реакции, мин Доля превращения в Вой Г) ОД КТ, г) 2 )6 17 18 19 60,0 75,2 87,5 93,3 94,0 В: ., (1;;": - i(, ",)L!: i- (!i - i .I }ХЛО— .}тв(,)с!»; О»,ill е )(."(!и. ) клеотиг(ом г f)ирид)г I)a г! г! д,i(bi,i i,i!(! д (()()т(()!»е} (и ) ) }i!. (ii (i г) i i I в i (.ë () i Ii i i i I ë .,i i I à L \ г г ) ñi(i! и }! г(КОМ}(»Т}!Ой 1 О(1()(доят г((.)Е С (1(.}С»С,(.)Ч}о!(Ц! )() ГИ Л(гг;. )!)Зд)(", f)();).;))(! .7;1 r;F";i il",, : г () . !;)(ЛЕ) l()г Х} гг М ((: Л Г В (); r) Г) (! . ) ) г } а Х !) (;, р ) ! ) (, О Тгг И:,! 1 Iã) (ii i I I г;I I«i i! ) I i ii li!i г)() в (.г((! л } ((; л (1 i I ) () (f,(1 (}(); е i г -, г "; ) i гг! j » (,С !»Ii! Л ПРО((ЕСГ», ДГ З "i l:iË!., I . I i i I). ) г)РЕДвар()T(,()ь)IO Г)бр l6» I i г)а)G ); -;. Ос . гг!.:}) гг)З()Ь)ТКОМ ГРИ()e ГИЛХЛ(Р)С!1()О ! Г) С(!Г!Д(", f! И г ид(гна, перед стадией гидролиза с.:", сь (.;«г .. i;.)а)ОТ,»о 0-(-301 С гг}дролиз осу(де(":твг»я}г} 1,5" 2,5 ))/) во((})})! О.)(;т(;.-,,p(;() ;) (.,",.)))а КО В f) PL)L!)() С) ВИ() т!)(г)З () )Л;);.)г! }(,), Вагд ) (: Г П }) }т) Л И Ч Е Ст В Е;- - IF (i L (к! O f г- (! () М (i () "i () () г л); (ГГ)(, вк I}(," ал триметилхлорсилан, а целевой Г)редукт выделя(о) обра(ценно-фазо()ой хроматографией в видс солей -:ризтилам! )онил, 5 2, Способ по п. 1, отличающийся 1E!!",, (òL: при получении аденозинсодержа.,. го продукта реакционную смесь выдерж)II iзют в те!j(}(1)e 90 — 120 мин, 3, Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и с я 1i е, что г(ри получении цитидинсодержаще. О продукта реакцион}(ую смесь выдержива;от в течение 5 — 15 мин. 4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что при получении гуанозинсодержа15 (()()го продукта реакционную смесь выдер}кивают B течение 30 — 60 мин. превращения в * целеВой г (РОДУ(ГТ, В /о 35,2 47,7 66,0 72,3 8 ),3 90,0 95,1 95,0 Таблица4 Влияние температуры реакционной смеси на долю превращения в целевой продукт Таблица5 Влияние концентрации аммиака на долю превращения в целевой продукт Таблицаб Выбор соотношения ацилхлорида к дезоксинуклеотиду Таблица7 Выбор соотношения триметилхлорсилана к дезоксинуклеотиду 176Г 310 ТаблицаБ Влиян!1е триатиламина на г=. х 3!1 целевого продукта В ь1 ход l!еле!1о! о ii ýÎä 1!êTÿ, У г о в и 1 Ij p, о ц е r. I:;; Р 1МЕР Б0,2 74,б Табл ица9 ВлиянvlB л.етода в l!,P!IBIIl Я на вь1ход целевого продукта ВI е111н!1й вид целе го продукта ь1хо г! цел е, - ого и l Áдукта, 7, 15 % 77 2 Составитель B.ÑTàpîñTèí Техред М. Аоргентал Корректор И.Шулла Редактор Заказ 3620 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета Ro изобретениям!1 открьпиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раугцская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент, г. ужгород, ул,Гагар1лна, 101 l18ред гидрол иза,",1 .г!обавля-. 1О Г ГтР!1З1 ;1ЛалilËII б .:3 дс:r3;.Бле, liия тп, 1,1п;1:.1,;! а Хрол1! Т<.liðàôii«еская однородность (улl 4l 11!рил1есе!1 50, l pc Il 1е е! Е1ыи гигр, ! рошок Гигр, порошок оттенком кремо цвеге (г1римеси I деля ются) 
