Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста человека

 

Использование: биотехнология, медицина . Сущность изобретения: штамм получен слиянием клеток мышиной миеломы PAI с клетками селезенки мыши линии BAIB/C, иммунизированной фракцией нагруженных ЭФР эндосом, полученной из клеток эпидермоидной карциномы человека А 431. Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса IgM.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (f 1) (s1)s С 12 N 5/20, С 12 Р 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

{21) 4749007/13 (22) 11.10.89 (46) 15.10.92. Бюл. М 38 (71) Институт цитологии АН СССР (72) А. Б. Сорокин, Е, С. Корнилова, А. Д.

Сорокин, К. И. Галактионов, Е, А. Сорокина, А. Ф. Арэ и Т. М. Гринчук (56) Gregorl М., Rees А., EMSOJ., 1984, v, 3, рр. 929-937.

Fredman P. et al, J. Biol Chem., 1983, v.

258, рр. 11206-11210, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХХ КЛ ЕТОК )КИВОТН ЫХ MUS

MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОHAflbHblX АНТИТЕЛ,". РЕЦЕПТОРУ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине для изучения экспрессии рецептора ЭФР при патологических изменениях клеток, а также с целью выделения рецептора ЭФР человека для дальнейшего анализа.

Известны штаммы-продуценты моноклональных антител /МКА/ к рецептору

ЭФР /1-4/, полученные при слиянии клеток различных линий миелом с клетками селезенки мышей, иммунизированных клетками эпидермальной карциномы человека А 431.

Однако во всех указанных работах рассматриваются лишь свойства самих МКА, но не дается каких-либо признаков гибридом, являющихся продуцентами MKA к рецептору эпидермального фактора роста человека.

Преимущественно продуцируемые этими гибридомами МКА относится к типу tgG, тогда как поливалентность моноклональных антител класса lgM обеспечивает ряд пре(57) Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получен слиянием клеток мышиной миеломы

PAl с клетками селезенки мыши линии

ВА(В/С, иммунизированной фракцией нагруженных ЭФР эндосом, полученной из клеток эпидермоидной карциномы человека

А 431. Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса ig M. имуществ при изучении подвижности рецепторов ЭФР плазматической мембраны клеток (1).

Наиболее бли кой к заявляемому штамму является гибридома, продуцирующая

МКА к рецептору ЭФР человека класса lgM, известная как 2G2 — lg M(2)..

Однако указанные МКА 2G2 — igM оказывают активное ЭФР— подобное воздействие в процессе их использования, что затрудняет работу с нефиксирова ни ым материалом.

Целью предлагаемого изобретения является получение нового штамма-продуцента МКА к рецептору ЭФР человека, не вызывающих в процессе их применения индукции ЭФР-подобного. воздействия на исследуемый материал.

Заявляемый штамм получают при слиянии с помощью полиэтиленгликоля клеток мышиной миеломы РА 1 с клетками селезен1768635 ки мыши линии Ва!в/с, иммунизированной фракцией нагруженных ЭФР эндосом, полученной из клеток зпидермальной карциномы человека А 431. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридом по признаку продукции антител к внутриклеточным отсекам клеток А 431 и последующего клонирования был отобран штамм с авторским названием

В10, стабильно продуцирующий IVIKA к рецептору ЭФР человека, Штамм хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР— BCKK/Ï/, Регистрационный номер 359 Д. К моменту депонирования штамм прошел 16 пассажей.

Физиологические, морфологические и культуральные признаки.

Штамм культивируют на ростовой среде

R P M I 1640 с добавлением следующих аминокислот /s мг на литр среды/; L — аланина — 8,9; L — аспарагина — 15,0, L — аспэрагиновой кислоты — 13,0, глицинэ — 7,5, L — глютаминовой кислоты — 14,7, L — пролина — 11.5, 1 — серина — 10,5, а также 50 мкМ R — меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы.

Клетки культивируют в пластиковой или стеклянной посуде в закрытой системе или в атмосфере 5% COz при 37 С, При росте на укаэанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции 24-30 час. Клетки пассируют 1 раз в 2-3 дня. Кратность рэссева 1:3, Криоконсервацию проводят в смеси равных объемов кондиционированной ростовой среды и 20% деметилсульфоксида на ростовой среде при концентрации 10 клеток в 1 мл. Режим замораживания: 1 С в мин. от +20 до -60 С, 10ОС в мин. — от -60 до -100OC, 50ОС в мин. от -100О до -1500C.

Клетки хранят в жидком азоте, Отогревают при 40 С в течение 1-2 мин, далее разбавляют 10 — кратным объемом среды, центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин и высевают в ростовую среду.

Прививка культивируемых гибридных клеток штамма R10 сингенным мышам /линия BAI в/с/ вызывает у них образование асцитной опухали. В асцитной жидкости содержатся МонАТ к рецептору зпидермэльного фактора роста. Способность к продуцированию МонАТ стабильно сохраняется, по крайней мере, 16 пассажей в культуре и 3 пассажа при перевивках нэ мышах /срок наблюдения/.

Кариологическая характеристика, В клетках с модальным числом хромосом /95-94 хромосом у 42% всех клеток/ при рутинном окрашивании, кэк правило, присутствуют 4 хромосомы, меньшие по размеру, чем 19 хромосома. мыши и не менее 2 маркерных хромосом больших, чем 1-я хромосома стандартного набора, Обнаружены также 2 метацентрических маркера, отличающихся по размеру, Продуктивность штамма.

При стандартных условиях культивирования гибридома продуцирует МонАТ в таких количествах, что для реакции иммунофлуоресценции на клетках А 431 культуральную среду можно применять в разведении 1:10.

Специфичность антителэ подтверждэ15 ют методом иммуноблотинга

Каждая мышь линии Ва!в/с предварительно получает внутрибрюшинно по 0,3 мд пристана. Через 4-17 дней животным внут. рибрюшинно вводят гибридные клетки /10 клеток на мышь в 0,5 мл среды/, Спустя 12

20 дней мышь забивают и из брюшной полости извлекают эсцитическую жидкость /5 мл/.

Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейших перевивок гибридомы, Асцити25 ческую жидкость используют в качестве препарата монАТ.

Клетки эпидермальной карциномы человека А 431 /примерно 10 клеток/ промы-:

30 вают фосфатным буфером, солюбилизируют буфере при рН 7,35, 50 мМ с добавлением

NaCI 150 мМ, Твин 20-0,1% и человеческого сывороточного альбуминэ 30 мг/мл, обозначенного как раствор А. Асцитическую жидкость гибридомы R 10 разводят 10.000 рэз в этом же буфере и выдерживают с перенесенными на нитроцеллюлозу белками 12 час при 4 С. Выполняют 3 промывки раствором А и инкубируют с кроличьей антисывороткой. против. мышинных антител.

Затем — 3 промывки раствором А и инкубация с иодированным препаратом белка А.

После 3-х кратной промывки раствором А нитроцеллюлозэ с перенесенными клеточными белками высушивается и экспониру" буфером, содержащим Хепес 20 мМ, глицерин 10%, тритин Х.100-1%, ЭДТА — 0.5 М и фенилметилсульфанилфлуорид — 1 мМ, 20 мин при комнатной температуре. белки вы35 саживэют охлажденным ацетоном 12 час и подвергают злектрофоретическому разделению в 8% полиакриламидном геле. Перед . нанесением на форез осадок суспендируют в децилсульфате натрия 1% и глицерина

40 10% с последующим прогревом 5 мин при

60 С. После окончания электрофореза перенос белков на нитроцеллюлоэу проводят по стандартной методике. Места невпецифического связывания на нитроцеллюлозе забивают 1-часовой инкубацией в Трис-MCI

1768635

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUs аозсийзэ L, ВСКК(П)

Ь 359Д вЂ” продуцент моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста человека.

Составитель А. Сорокин

Техред M.Mîðãåíòàï Корректор И,Шмакова

Редактор В, Трубченко

Заказ 3622 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", t, Ужгород, ул,Гагарина, 101 ется с рентгеновской пленкой Pm-В при -70 С.

Устайовлено, что полученная асцитическая жидкость содержит монАТ к белку с мол. весом 170 .ООО. В сочетании с данными по иммунопреципитации монАТ R 10 белка 5 с мол. массой 170.000. способного автофосфорилироваться после добавления ЭФР, и данными по параллельному применению в процедурах иммунопреципитации и иммуноблоттинга поликлональных антител к ре- 10 цептору ЭФР !предоставлены А.

Содерквист, Вандербильдский университет. США/ это доказывает, что МонАТ R 10 узнает именно рецептор ЭФР.

Характеристика МКА, продуцируемых 15 . штаммом R 10.

МонАТ, сокретируемые в асцитическую жидкость клетками гибридомы штамма 8 10, связываются с рецептором эпидермального фактора роста человеческой эпидермаль- 20 ной карциномы. Связывание монАТ с рецептором ЭФР установлено реакциями иммунопреципитации и иммуноблоттинга, а также непрямой реакцией поверхностной иммунофлуоресценции на клетках эпидермальной карциномы человека А 431. По данным электрофореза в полиакриламидном геле монАТ, продуцируемые клетками гибридомы штамма R 10. относятся к классу

IgM, Характерной особенностью МонАТ, продуцируемых гибридомой R 10, является то, что это монАТ узнает эпитоп экстраклеточного домена рецептора ЭФР и не оказывают ЭФР-подобного действия на исследуемый материал.