Способ получения амикацина

 

Использование: в качестве синтетического антибиотика в медицине. Сущность изобретения: продукт амикацин {0-3-амино- 3-дезокси-а-О-глюкопиранозил- 1- 6-0- (бамино-6-дезокси-а-О-глюкопиранозил}-1- 4 - м -/4-амино-2-окси-1-оксибуТил/-2-дезокси- D-стрептомин}. Реагент 1: канамицин А, защищенный бензилоксикарбонилом в положениях 3 и 6. Реагент 2: эфир М-бензилоксикарбонил- -(-)-4-амино-2-оксимасляной кислоты и N-оксисукцинимид. Условия реакции: в среде воды и низшего хлоралкана СН2С12, СНС1з, (СНаОД, рН 4,5-6,5 и удаление защитных групп. 2 з.п. ф-лы. 2 табл., 2 рис.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 07 Н 15/234

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

СН2ННЯ

Н0

Н0

NH2

СН20Н HO ОН но о "

Н2Н О

OH (21) 4356995/04 (22) 25.11.88 (31) 22783 А/87 (32) 27.11.87 (ЗЗ) IT (46) 15.11.92. Бюл. ¹ 42 (71) Пьеррел СПА (IT) (72) Альберто Манджиа (IT) (56) Европейский патент N. 0218292 А1, 1986, кл. С 07 Н 15/234. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИКАЦИНА (57) Использование; в качестве синтетического антибиотика в медицине. Сущность

Изобретение касается производных сахаров, в частности, усовершенствованного способа получения амикацина ((О-3-амино3-дезокси-с -0-гл юкоп иран озил-(1%=0(6амино-6-дезокси-a-D-гл юкоп иран озил)-1

N -(4-а мино-2-о кси-1-о ксибутил)-2-дезокси1

D-стрептомин}) формулы I; сн,мн, который является синтетическим антибиотиком и используется в медицине.

Известен способ получения амикацина ацилированием защищенного в 3 и 6 — по-! ложении канамицина формулы II Ы 1776262 А3 изобретения: продукт амикацин (0-3-амино3-дезокси-а-0-глюкопиранозил-(1об-0- (бамино-6-дезокси-а-0-глюкопиранозил)-1- 4)N -/4-амино-2-окси-1-оксибутил/-2-дезокси1

0-стрептомин}. Реагент 1: канамицин

А, защищенный бензилоксикарбонилом в положениях 3 и 6. Реагент 2: эфир N-бензилоксикарбонил-L+}-4-амино-2-оксимасляной кислоты и й-оксисукцинимид. Условия реакции: в среде воды и низшего хлоралкана (CH2Oz, СНОз, (СН2СЩ, рН 4,5-6,5 и удаление защитных групп. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 рис.

ОН R-СОСН СБН

О в где и — защитная группа, .которое проводят обработкой солью бивалентного металла, реакцией полученного комплекса с производным 1+)-4-амино-2гидробутановой кислоты, где аминогруппа защищена и оксигруппа активирована, с последующим разрушением комплекса и удалением ионов металла и защитных групп (11, Недостатком способа является его сложность и невысокий выход.

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода.

1776262

Поставленная цель достигается тем, что ацилированию эфиром N-бензил-оксикарбонил- -(+4-амино-2-оксимасляной кислоты и N-оксисукцинймида, взятым в виде раствора в низшем хлоралкане, например, хлористом метилене, хлороформе или 1,2дихлорэтане, подвергают непосредственно производное канамицина А формулы И, где

В СОСН СБН5

ll

О

Анализ жидкостной хроматографией продукта проводят в следующих условиях: колонка: RB-8,5 мкм; 250 мм х 4,6 мм (Броунли Лабс), элюент: А) буферный раствор KHzPQ< при 2,5 (1,36 r КН РОа растворено в 1 л воды, доведено до желаемого рН 5 -ной фосфорной кислотой, отфильтровано на фильтре с 0,45 мкм).

В) Смесь ацетонитрила — буфера с рН

2,5 (80/20 объем/объем), скорость потока 2 мл/мин. градиент: от 15% В до 90 В за 15 мин, температура: 30 С, детекция: УФ/350 нм. дериватизирующий раствор: 2,4,6-тринитробензолсульфокислота в воде — пиридине (50/50).

На приложенных рисунках, на рис, 1 показан спектр жидкостной хроматографии, тогда как на рис. 2 показан ИК-спектр в KBr.

Согласно предложенному способу не может образоваться изомерный продукт амикацина, называемый ВВ-К29, который является более токсичным, чем амикацин.

Потенциально имеющимися примесями могут быть только продукт, называемый ВВК11, и продукт, получаемый при двойном ацилировании у N-1 и N-3" — атомов.

1=(+4-амина-2-оксимасляная кислота обозначена как L-НАВА, ди(НАВА)КАНА-канамицин А, замещенный в 3 и 6 положении остатком 1=НАВА.

Пример 1. Суспензируют 53,4 г 3,6

-ди-Й-бензилоксикарбонилканамицина А в

1000 мл воды и растворенных в ней 38,5 мл уксусной кислоты, после 30 минут перемешиаания при комнатной температуре устанавливают рН равным 6 с помощью 30

NaOH (около 52 мл), После дополнительных 30 мин при комнатной температуре прибавляют за один раз 34.9 r N-бензилоксикарбонил-L-HABAN-оксисукцинимида, растворенного в 1442 мл метиленхлорида.

Затем смесь выдерживают всю ночь при интенсивном перемешивании при комнатной температуре, затем выпаривают органический растворитель при температуре

ЗО

55 ниже 40 С и устанавливают рН равным 4,2 с помощью уксусной кислоты, Проводят снятие трех бензилоксикарбонильных защищающих групп с помощью стандартной методики, добавляя к раствору

50 r 2,5% Pd/Ñ и прибавляя по каплям при комнатной температуре 50 мл муравьиной кислоты. После фильтрации угля on decal(le и промывки водой получают 1900 мл обогащенных вод, имеющих следующий состав: амикацин 11,52 г/л канамицин А 2 г/л

В В-К11 0,25 г/л ди/НАВА/KANA 1,3 г/л что соответствует стехиометрическому выходу амикацина 65, считая на исходный диацилат.

Этот раствор абсорбируют на ионообменной смоле типа Зеролит (торговое название Ром энд Хаас) в слабокислой.форме после установки рН, равным 7,5.

Канамицин элюируют при линейном градиенте аммиака от 0,5 н до 1,5 н и выходит он из колонки первым после амикацина.

Собирают фракции 300-350 и концентрируют в вакууме для полного удаления всего аммиака и достижения конечной концентрации амикацина 20 .

Для подкисления до рН 2,5 используют

50 мас, / масс/объем серную кислоту и проводят обработку углем, После 30 минут перемешивания при комнатной температуре уголь отфильтровывают, остаток промывают и осаждают метанолом дисульфат амикацина.

После 2 часов перемешивания при комнатной температуре полученный белый твердый продукт отфильтровывают и после промывки и сушки в вакууме при 45 С в течение 16 ч вес продукта составляет 33,3 г.

Целевое основание амикацина составляет 68%, как определено жидкостной хроматографией (при микробиологическом титре 690 мкгlмг), другие параметры находятся в соответствии с данными для амикацин сульфата, Пример 2. Суспендируют 50 г 3,6 — ди-N-бензилоксикарбонилканамицина А, имеющего по данным жидкостной хроматографии содержание 89,5 (59,3 ммоля), содержание воды 3,3 и содержащего в качестве основной примеси 1,3,6 -три-N-бенl эилоксикарбонилканамицин А, в 1500 мл деионизированной воды. После 30 мин перемешивания прибавляют ледяную уксусную кислоту в количестве, необходимом для установления величины рН, равной 6 + 0,2.

8 этой точке практически получают раствор; Прибавляют активный сложный эфир

N-оксисукцинимида 1-/-/-гамма-бензилок1776262 сикарбонил амино-альфа-оксимасляной кислоты при комнатной температуре в виде раствора в метиленхлориде (25 г соответствует 80,6 ммоля) в 1000 мл растворителя, Смесь интенсивно перемешивают в те- 5 чение 2 ч и выдерживают при перемешивании всю ночь.

После отделения органической фазы устанавливают рН 10 с помощью 3 н. раствора аммиака. 10

Образовавшийся при этом белый осадок отфильтровывают на. воронке Бюхнера в вакууме и промывают водой.

Слабокристаллический продукт сушат в вакууме при 30 С в течение примерно 30 15 часов.

Пблучают 30,9 г 3,6 -ди-N-бензилоксиI карбонил-1-N-tL-/-/- бензилоксикарбониламино-о-оксибутирол)-канамицина А, имеющего титр 70 / (жидкостная хроматогра- 20 фия).

Основными примесями являются: исходный диацилат: 1 триацилат(М-1, N-3 и N-6 с бензилоксиl карбонильными группами): 2%, 25 потери при сушке: 4-5 (3 часа при

105 С), сульфатная зола: 0,15 /.

Пример 3. 53,4 г З,б-ди-N-бензилокI сикарбонилканамицина А (анализ- 89,5, 30

63,4 ммоля) суспендируют в 1000 мл воды и растворяют в 38,5 мл уксусной кислоты, после чего в течение 30 мин перемешивают при комнатной температуре, а рН доводят до значения, указанного в табл. 1, с по- 35 мощью 30 NaOH, Затем перемешивают еще 30 мин при комнатной температуре и одновременно добавляют 34,9 r N-бензилоксикарбонил-NHABA-N-гидроксисукцимида, растворенно- 40 го в 1442 мл метиленхлорида, Затем смесь энергично размешивают при комнатной температуре в течение ночи, после чего органический растворитель выпаривают при температуре ниже 40 С, а рН 45 доводят до значения 4,2 с помощью уксусной кислоты, Разблокировку трех бензилоксикарбонильных групп осуществляют стандартным способом путем добавления к раствору 50-r 50

2,5 Pd/С и добавления по капле при комнатной температуре 50 мл муравьиной кислоты, После фильтрации угля на декалите и промывания водой получают прозрачный 55 раствор с композицией реакционных продуктов, описанных в таблице в соответствии с различными значениями рН во время стадии ацилирования.

Раствор абсорбируют на ионообменнике типа zегоllt (торговая марка ROHM u

HAAS) (после того как рН доводят до значения 7,5) в слабокислотной форме.

Канамицин элюируют с использованием линейного градиента аммиака от 0,5N до

1,5N с выпуском из колонки сначала канамицина, а затем амикацина.

Фракция 300-350 собирают и концентрируют в вакууме с целью полного удаления аммиака и достижения конечной концентрации амицина 20, Затем осуществляют подкисление при рН 25с использованием 50 масс./об. HzS04 и обработку активированным углем.

После 30 минутного перемешивания при комнатной температуре уголь отфильтровывают, остаток промывают, а дисульфат амикасина осаждают метанолом, После 2-часового размешивания при комнатной температуре, полученное белое твердое вещество фильтруют, промывают и высушивали в вакууме в течение 16 часов при 45 С, после <его указанное вещество имеет массу, указанную в последней колонке таблицы 1..

Анализ амикацинового основания, про- веденный с помощью жидкостной хроматографии (с микробиологической активностью

690 MKr/ìr) показывает 68, что находится в соответствии с другими определениями.

Пример 4, 53,4 r З,б-ди-N-бензилокI сикарбонилканамицина А (88, 62,4 ммоля) суспендируют в 100 мл воды и растворяют в

38,5 мл уксусной кислоты, после чего в течение 30 минут перемешивают при комнатной температуре, а рН доводят до значения 6 с помощью 30 Na0H, Затем после 10-минутного перемешивания очень быстро добавляют 35 r N-бензилоксикарбонил-L-HABA-N-гидроксисукцинимида, растворенного в 1220 мл хлороформа.

Смесь энергично размешивают в течение 4 часов, затем выделяют растворитель путем дистилляции при температуре ниже

40 С, а рН доводят до значения 4,2 с помощью уксусной кислоты.

Удаление трех бензилоксикарбонильных защитных групп осуществляют стандартным способом путем добавления к раствору 50 г 2,5 g Pd/С и добавления по капле при комнатной температуре 50 мл муравьиной кислоты, После фильтрации угля на декалите и промыва ия водой получают полный раствор (1850 мл) со следующими композициями:

Амикацин 12,12 г/л.

Канамицин А 2,1 г/л, 1776262

ВВК 1l 0,31 r/ë, ди(НАВА) КАМА 1,4 г/л, Выходы амикацина составляют 61 на исходный диэцетат. Раствор абсорбируют на ионообменнике типа Zегоllt (Торговая 5 марка ROHM и HAAS) в слабокислотной форме (после доведения pH до 7,5), Канамицин элюируют с использованием линейного градиента аммиака от 0,5N до

1,5N, после чего следуют амикацин и другие 10 родственные побочные продукты.

Фракции, содержащие преимущественно амикацин, концентрируют в вакууме до конечной концентрации амикацина 20 масс. Для получения наиболее высоких вы- 15 ходов во время осаждения сульфата добавляют HgSO4 (50 мас, . до рН=2), обрабатывают углем, фильтруют и добавляют метанол, После 2-часового рэзмешивания при 20 комнатной температуре получают более твердое вещество, которое после фильтрации, промывания и высушивания в вакууме при 45 С в течение lб часов имеет массу

32,32 г. 25

Анализ показывает содержание амикацина 69 (определенное с помощью жидкостной хроматографии, микробиологическая активность 705 мкг/мг), П.р и м е р 5, 84,6 г 3,6-ди-N-бенэилок- 30 ! сикарбонилканамицин А (89;, 0,1 ммоля) суспендируют в воде (1500 мл) и рН доводят до значения 6 с помощью уксусной кислоты, затем в течение 30 минут размешивают при комнатной температуре и одновременно к 35 раствору добавляют 60,0 г К-бензилоксикарбонил-L-НАВА-N-гидроксисукцинимид а, растворенного в 2000 мл 1,2-дихлорэтана, После энергичного перемешивания в течение 5 часов органический растворитель 40 выделяют (с выходом 90%) путем дистилляции при температуре ниже 40 С.

Три бензилоксикарбонильные защитные группы удаляют путем гидрогенизации с использованием 70 r 2,5 Pd/Ñ и добав- 45 лением по капле при комнатной температуре 80 мл муравьиной кислоты, После фильтрации угля получают раствор {2500 мл), содержащий следующие ком- 50 поненты:

Амикацин 14,0 г/л, Канамицин 4г/л, .

ВВ-К11 0,41 г/л, ди(НАВА)КАМА 1,8 г/л, 55 что соответствует стехиометрическому выходу амикацина 59,7о .

Амикэцин выделяют из родственных побочных продуктов с помощью адсорбции на ионообменнике типа 2его1!т(Торговая марка

POHM и HAAS) в слабокислотной форме (после доведения рН до 7,5).

Фракции. содержащие амикацин собирают и концентрируют в вакууме для удаления аммиака.

Амикацин при концентрации 15 мас. обрабатывают-50 мас, HzSO< при рН 2,5 и после обработки эктивированным углем кристаллизуют.

После 2-часового рэзмешивания при комнатной температуре получают белое твердое вещество, которое фильтруют и промывают метанолом, после высушивания в вакууме при 45 С поскучают 51,3 r амикэцинсульфата;

В табл. 1 представлены результаты проведения опытов при различных рН.

Ацилирование, проводимое всоответствии со способом настоящего изобретения, 3,6 -ди-N-замещенного канамицина А в ус-! ловиях контролируемого рН и в гетерогенной фазе, обеспечивает стереоселективность, которая является неожиданно высокой, так как предпочтительно образуется амикацин вместо ВВ-К11 или продуктов, происходящих иэ двойного ацилирования у

N-1 и N-3 — атомов. Кроме того, очень важным является тот факт, что согласно настоящему способу в конечном продукте может присутствовать в качестве возможной примеси только продукт, называемый ВВ-К11, и продукт дицилирования в К-1 и N-3" в положениях, токсичность которых ниже, чем у продукта, называемого ВВ-К29, который является основной потенциальной примесью, которая образуется в соответствии с другими известными способами синтеза.

Предложенный способ дает хорошие показатели по выходу и чистоте продукта, является особенно безопасным с точки зрения промышленнь1х гигиенистов, так как используют почти безвредные. реагенты и растворители и способ легко осуществляется, так как не нужно выделять промужеточные продукты, Проводят несколько экспериментов для сравнения летальной дозы, токсичности и острой общей переносимости (телерактности) продукта, доступного в продаже от фирмы Бристоль Майерс (ВВ-КВ), амикацина, полученного в соответствии со способом настоящего изобретения, и потенциальных примесей (ВВ-К11, ВВ-К29 и диацилат с (=

НАБА в й-1 и N-З"), на мышах при внутривенном введении (каудальная вена) на группе из l0 животных. Величины ЛД о вычисляют по методу Финней-Пробитса.

Результаты представлены в табл.2.

Приведенные выше данные показывают, что по предлагаемому способу получают

17762б2

С! 2 ! Н С ОС конечные продукты, у которых возможные примеси, хотя они и имеются в конечных продуктах в очень незначительных количествах, являются всегда намного менее токсичными, чем SB-К29, который может 5 присутствовать при известных синтезах.

Формула изобретения

1. Способ получения амикацина формулы!

СН2С61-!5

OH

СН20Н Н

НО

Н2!

ОК

Таблица 1

Таблица 2

Составитель H.Hàðûøêoâà

Техред M,Mîðãåíòàë Корректор Л.Ливринц

Редактор А.Бер

Заказ 4046 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям.при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Н2!

OH и включающий ацилирование при комнат10 ной температуре в водной среде эфиром

НО Н2 Н2 N-бензилоксикарбонил-!-(+4-амино-2-окс0 о имаслячной кислоты и N-оксисукцинимида, HO 1 !Н2 взятом в виде раствора в низшем хлоралкане, с"последующим удалением защитных

ОН 15 групп, отличающийся тем, что, с целью

О, !Н л,!И

0 упрощения процесса и повышения выхода 2 целевого продукта, ацилированию при рН

О

4,5 — б,5 подвергают непосредственно производное канамицина А формулы l!.

20 2. Способ по и, 1, отличающийся исходя из производного канамицина А, за- . тем, что в качестве низшего хлоралкана исщищенного в 3 и б положении бензилокси- пользуют хлористый метилен, хлороформ карбонилом формулы !! или i,2-дихлорэтан.