Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы

 

Использование: медицина, получение конъюгатов пероксид-дисмутазы с полиалкиленгликолем . Сущность изобретения: фермент связывают через аминогруппу лизина и СО-связь с полиэтиленгликолем или изопропоксиполиэтиленгликолем с мол.м. 40000-200000, предпочтительно 40000- 150000, одна концевая группа которого модифицирована в карбоксильную, амино-, карбоксамидоили альдегидную группу. Для связывания одной молекулы фермента берут 1-8, предпочтительно 2-6, молекул полимера. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 9/96

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4742978/13 (86) РСТ/0$88/02530 (29.07.88) (22) 02,02.90 (31) 081009 (32) 03.08.87 (33) US (46) 15.11.92, Бюл. ¹ 42 (71) Ди Ди Ай Фармасьютикэлс, Инк. (US) (72) Марк Сайфер, Ралф Сомэк и Л.Дейвид

Випльямс (US) (56) ЕР ¹ 0200467, кл. С 12 N 9/02, опублик.1986, Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения конъюгатов или аддуктов пероксид-дисмутазы (ПОД), в которых по крайней мере часть аминогрупп, карбоксильных или сульфгидрильных групп соединена с полиалкиленгликолем (ПАГ), например, полиэтиленгликолем (ПЭГ) или полиэтилен-полипропилен-гликолевым сополимером, где молекулярная масса ПАГ больше 20000 и желательно, чтобы средняя молекулярная масса ПАГ составляла

40000-1000000дальтон, Указанные для ПАГ молекулярные веса определены эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖК) с использованием ПЗГ в качестве эталона. Предпочтение отдается ПАГ со средней молекулярной массой большее 40000, но не более чем

200000. В частности предпочитается средняя молекулярная масса ПАГ 50000-150000.

Подобные ПАГ могут быть неразветвленными или разветвленными и незамещенными,5U 1776275 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО КОНЪЮГАТА Cu, Zn-ЗАВИСИМОЙ ПЕРОКСИД-ДИСМУТАЗЫ (57) Использование: медицина, получение конъюгатов пероксид-дисмутазы с полиалкиленгликолем. Сущность изобретения: фермент связывают через аминогруппу лизина и СО-связь с полиэтиленгликолем или изопропоксиполиэтипенгликолем с моп.м.

40000 — 200000, предпочтительно 40000—

150000, одна концевая группа которого модифицирована в карбоксильную, амино-, карбоксамидо- или альдегидную группу.

Для связывания одной молекулы фермента берут 1-8, предпочтительно 2-6, молекул полимера. 2 з.п.ф-лы, 1 табл. или замещенными С1-4-алкильной группой.

Особо ценными молекулами ПАГ, предотвращающими связь с двумя молекулами

ПОД, являются молекулы ПАГ, в которых одна из концевых групп является такой С1-4алкилэфирной группой, как изопропоксигруппа.

Использовали ПЭГ или метокси-ПЭГ с низкой молекулярной массой — обычно ок, 5000 и меньше, присоединенные к пероксид-дисмутазе (ПОД) и другим белкам для того, чтобы получить аддукты с разной степенью(а) повышенной живучести в сыворотке и (б) пониженной иммуногенности.

Однако степень модификации протеиновых групп с низкомолекулярным ПЭГ или метокси-ПЭГ, необходимых для достижения целей (а) и (б), часто вызывает значительные потери ферментативной или биологической. активности белков.

Цель изобретения — пролонгирование действия целевого продукта.

177б275

45

55

Пероксид-дисмутаза (ПОД) представляет собой внутриклеточный фермент, ответственный за катализ превращения радикала пероксида в кислород и перекись водорода.

Предметом настоящего изобретения является также получение коныюгата с противовоспалительной активностью, что показывает, например, обычный тест с отеком лапы, индуцированным каррагенаном.

Эта активность делает продукт особенно перспективным для лечения ревматических заболеваний. Продукт проявляет большую живучесть, чем нативный ПОД-протеин ин виво и замедление дезактивации его в почках. Поэтому особенно важно отметить, что предлагаемый продукт сохраняет ферментативную активность в течение длительного периода времени, проявляя низкий уровень иммуногенности, Согласно новой концепции настоящего изобретения используют нити ПАГ с высоким молекулярным весом (свыше 20000), Используемый в настоящем изобретении ПАГ может представлять собой любой растворимый в воде полимер алкиленоксида, например, полиэтиленоксид, или определенные сополимеры этиленоксида и пропиленоксида. ПАГ может быть неразветвленным или разветвленным и замещен в одной или нескольких гидроксильных группах С1-4-апкокси или другой группой. Однако молекулярный вес ПАГ-полимера, используемого в получении предлагаемого коньюгата, превышает 20000 и составляет предпочтительно 40000-200000. Использование полимеров с молекулярным весом выше 200000 тоже возможно, но им не отдается предпочтение из-за их более высокой вязкости и склонности расщепляться под воздействием сдвиговых усилий.

Предлагаемые аддукты ПАГ-ПОД и другие аддукты ПАГ имеют молекулярные веса в пределах от ок, 85000 до ок. 2000000 дальтон, предпочтительно от ок. 90000 до

1000000 дальтон (считая на ПЭГ-эталон с известным молекулярным весом), Далее, предлагаемые аддукты ПАГ-ПОД и другие аддукты ПА(обычно сохраняют почти всю активность нативного протеина. (Следует отметить, что приведенные в настоящей заявке молекулярные веса основаны на ПЭГэталоне с известным молекулярным весом.

Для целей калибровки ВЭЖХ принимается, что эквивалентные молекулярные веса протеина, т.е. молекулярные веса, Основанные на протеиновых эталонах с известным молекулярным весом, приблизительно в 5 — 8 раз выше).

Усовершенствование предлагаемых коньюгатов по сравнению с известными продуктами заключается в том, что в результате присоединения меньшего числа нитей

ПАГ исходная активная молекула подвергается. менее сильной химической модификации, так что в большей степени сохраняется ее первоначальный характер. Так, эа счет использования меньшего числа нитей высокомолекулярного ПАГ согласно настоящему изобретению получаемые в результате аддукты сохраняют в основном

Bclo или почти всю активность исходной молекулы, проявляя повышенную стойкость в кровотоке. Другое преимущество предлагаемых аддуктов заключается в том, что, используя высокомолекулярный ПАГ, можно получить более крупные аддукты с той же самой степенью модификации, что и в прежних решениях. Кроме того, в определенных назначениях крупные аддукты ПАГ имеют явные преимущества. Например, предлагаемые аддукты ПЭГ-ПОД, полученные по предлагаемой методике с использованием нитей ПЭГ с молекулярным весом в пределах 40000-130000 v иллюстрирующие принцип настоящего изобретения, имеют период полураспада в сыворотке мышей ок.

Зб часов и более, что выше, чем у известных аддуктов ПЭГ-ПОД.

Аддукты ПАГ-ПОД содер>кат предпочтительно 1 — 10, более предпочтительно 2 — 8 и в частности 2-6 цепей, присоединенных к молекуле протеина. Число цепей, необходимых для получения достаточной живучести в сыворотке, снижается с увеличением длины цепей.

Типичными предлагаемыми препаратами ПОД являются содержащие медь и цинк препараты ПОД, получаемые на основе соответствующего бычьего фермента и из ферментов других животных (например, овцы, лошади, свиньи, собаки, кролика, курицы) или из человеческих клеток. Доступны также препараты ПОД, содержащие ионы других металлов, например железа или марганца.

Пригодным является также фермент с аднородными структурами, который получен иэ микробных культур, в которых клонировали и зкспрессировали такие структуры, ПОД может также оказаться не идентичным со встречающимися в природе белками вследствие ненадежности процесса трансляции в таких микробных культурах ввиду того, что предлагаемые продукты имеют пони>кенную иммуногенность.

Кроме того, было обнаружено, что в том случае, когда препарат ПОД содержит микроколичества белков, которые отличны от

ПОД и в других случаях делают такой препа1776275

10

35

55 рат иммунологически ненадежным для повторного парентерального введения, в данном случае предлагаемый процесс связывания с ПОД может дать довольно ценный продукт, поскольку иммуногенность загрязняющих белков значительно снижается.

Для процесса связывания можно испольэовать ряд традиционных реакций.

Предпочтительная реакция осуществляется путем образования реакционноспособного карбоната-полузфира — ПАГ-О-CO-X, где Х представляет собой пригодную отщепляемую группу, с использованием таких реагентов, как карбонилдиимидазол, р-нитрофенилхлорформиат или бис-N-cymцинимидилкарбонат, Активированный ПАà — ПАГ-Π— СΠ— Х подвергают реакции с белком в условиях, не разрушающих его ферментэтивную активность, что ведет главным образом к образованию уретановых связей типа

ПАà — О-СΠ— NH-протеин, присоединенных через аминогруппы белка, например, v-ЙН2-группу лизина.

Так. карбонилдиимидаэол можно под,вергать реакции с концевыми гидроксильными группами ПАГ. Реакционную массу резко охлаждают в водном растворе при нейтральном значении рН, после чего активированный ПАГ (полиал киленгликоль-карбонилимидазол) выделяют путем диализа и/или методом эксклюзионной хроматографии, .Реакцию ПАà — Π— СΠ— NCH — CH=NCH с ПОД осуществляют в растворе с помощью избытка активированного ПАГ.

Согласно одному варианту выполнения этой реакции раствор ПОД и активированного ПАГ сушат вымораживанием. Связанные продукты целесообразно выделить эксклюэионной хроматографией, Но можно пользоваться и другими процессами очистки, в том числе ионообменной хроматографией, Согласно другой реакции связывания полиалкиленгликоль растворяют в инертном органическом растворителе. Полученная в результате реакционная масса показывает слабощелочную реакцию и ее можно подвергать реакции с цианурхлоридом.

Непрореэгировавший цианурхлорид удаляют путем оса>кдения ПАГ с помощью петролейного эфира. Остаточный растворитель выпаривают с получением 2 — ПАà — 6— хлор-1,3,5-триазина. Полученные в результате эктивированные полимеры подвергают реакции с ПОД в пригодном буфере, например растворе бората. Непрореагировэвший ак-.ивированный ПАГ удаляют и полученный продукт выделяют хроматографией. Таким образом получают 4 — окси—

1,3,5-триазина, к которому в положении 2 присоединена полиалкиленгликолевая группа ПАГ-О-, в.то время как в положении

6 присоединена r. -аминогруппа реакционноспособной лизиновой группы ПОД.

Кроме того, одну или несколько гидроксильных групп ПАГ-ОН можно перевести в карбоксильную (карбоксильные), например, путем реакции с ангидридом янтарной кислоты или с этилбромацетатом и щелочью или окислением концевой группы -OCHzCHzOH с помощью перманганата щелочного металла с образованием соединения ПАГ с простыми эфирами уксусной кислоты

ПАГ-О-CHz — СООН. Карбоксильные группы затем активируют общеизвестными методэми, пригодными для модификации белков, например, путем образования сложного ¹ оксисукцинимидного эфира путем реакции с карбодиимидом и N-оксисукцинимидом, или образования ацилаэида путем нитрозирования ацилгидразида. Активированный

ПАГ затем подвергают реакции с протеином в условиях, не разрушающих ферментативную активность протеина, причем эта реакция через аминогруппы протеина (например, концевую NHz-группу и r. -аминогруппы лизина) ведет преимущественно к амидным связям (Г1АГ-C(=0)NH-протеин).

Концевую гидроксильную группу Г1АГ можно также перевести в аминогруппу, например, осуществляя сначала реакцию с тионилбромидом, в результате чего образуется ПАГ-В r, а затем проводят аминолиз с помощью избытка аммиака, в результате чего образуется ПАГ-NH. Через амидные связи амино-ПАГ можно затем непосредственно присоединять к карбоксильным группам белка, используя такие реагенты, как водорастворимый карбодиимид или реактив К.Вудварда. Однако можно и перевести аминогруппу в карбоновокислотную группу, например, реакцией с ангидридом янтарной кислоты, которую затем активируют и подвергают реакции с белком вышеописанным образом.

Концевую группу -CHzOH ПАГ можно также перевести в альдегидную группуСН(=0), например, реакцией окисления с помощью MnOz. Альдегидную группу затем подвергают гидроалкилированию, исходя. из свободных аминогрупп белка, например, с помощью цианборгидрида, с получением связи главным образом через вторичные

1776275

35

55 аминные группы с образованием мостика

ПАà — ОСН2СН2МН-протеин.

Наряду с аминогруппами белков для связывания с ПАГ можно также использовать карбоксильные и сульфгидрильные группы белков, Как выше упоминалось, предпочтение следует отдать тем реакцйям связывания, в течение которых отщепляются только неароматические группы, содержащие углерод, кислород, серу, азот и водород как часть мостика. связывающего ПАГ с белком.

Конь1огат ПОД можно выделить иэ реакционного раствора предпочтительно после диалиэа в целях удаления посторонних ионов путем известного процесса лиофилизации. Если желательно или необходимо, коньюгат ПОД можно подвергать дальнейшей очистке путем ионообменной хроматографии, электрофореза и/или гельфильтрации, В результате традиционного метода фильтрации через микропористый фильтр в стерильные ампулы. при желании после доведения ионной силы, например, с помощью хлористого натрия и/или фосфата натрия до изотонии, получают стерильный раствор, пригодный для применения путем впрыскивания.

Предлагаемые фармацевтические составы включают предлагаемые коньюгаты

ПАà — ПОД и фармацевтически совместимый носитель.

Фармацевтический состав предпочтительно представляет собой стерильный вводимый иньекцией препарат, например стерильный1 иньецируемый водный раствор.

Раствор можно приготовить известными методами, используя вышеуказанные фармацевтически приемлемые носители. Кроме того, стерильный иньецируемый раствор может представлять собой раствор или взвесь в нетоксичном пригодном для парентерального введения раэбавителе или растворителе.

Предлагаемые составы включают зффективнук> дозиметрическую единицу коньюгата ПОД при концентрации, могущей вызвать желаемую реакцию при введении доэиметрической единицы составов приемом, соответствующим конкретному фармацевтическому носител1о. Так, жидкие составы обычно содер>кат ок. 0,5 — 40 мг коньюгата белка в каждых 0,25 — 10 мл, предпочтительно в каждых ок, 0,5 — 5 мол, за исключением раствора для внутривенной инфузии, которые могут быть более разбавленными и содержат, например, 0,5 — 200 глг коньюгата белка ПОД в каждых 50-1000, предпочтительно в каждых 100 — 500 мл инфузионного раствора. Таблетки, капсулы и суппозитории обычно содержат 0,1 — 25, предпочтительно 1-10 мг коньюгата белка на дозиметрическу1о единицу.

Предлагаемые коньюгаты ЛОД наподобие известного продукта орготеина успешно можно использовать для лечения целого круга воспалительных заболеваний, включая такие заболевания, лечение которых синтетическими противовоспалительными средствами ограничено вследствие токсичных побочных действий, вызываемых длительным введениегл подобных средств, Конкретно говоря, коньюгаты ПОД можно использовать для уменьшения токсичности кислорода, повре>кдений после повтор. юй перфузии, вос пал ител ьн ых и роцессов и вызванных ими осложнений, касающихся, например, мочевых путей и суставов, у разных млекопитающих, Они пригодны для смягчения симптомов и структурных деформаций, связанных с посттравматическим артритом и такими ревматическими заболеваниями, как бурсит, тендинит L1 остеоартрит.

Пример 1, 50 г ПЭГ (полиэтиленоксида 100000 или Polyox — продукта фирмы

Union СагЬЫе, представляющего собой изопропоксилированный ПЭГ с молекулярным весом l00000 (no данным этикетки изготовитегтя), определенным измерением характеристической вязкости, и со средним молекулярным весом ок, 50000 по данным

ВЭЖХ растворяли в 1 л сухого пиридина, после чего добавляют 22 г ангидрида янтарной кислоты. Полученную смесь перемешивают 38 часов при GO С, Лотом в вакууме при температуре ниже 60 С удаляют растворитель, а полученный остаток вновь растворяют в 500 мл воды. Раствор промыва1от гексаном и продукт экстрагируют 1000 мл хлороформа. Потом удаля1от хлороформ в вакууме при 40 С, Полученный продукт растворяют в бензоле, Сукцинилированный ПЭГ вновь два раза осаждают из бензола с помощью петролейного эфира.

Водный раствор этого сукцинилированного

ПЭГ подвергают фракционированию по размерам молекул для удаления низкомолекулярнаго ПЭГ путем ультрафильтрации использованием аппаратуры типа Millipore

Mini(an оснащенной отделительной глембfJ раной с молекулярным весом 300000 (белковый стандарт), Фракционированный продукт высушивают в вакууме. Последующий анализ с помощью водной эксклюзионной ВЭЖХ показывает повышение среднего молекулярного веса сукцинилированного

ПЭГ от ок, 50000 до ок. 80000, что является результатом ул ьтрафил ьтраци и, Ф ракцио1776275 нированный по размерам молекул сукцинилированный ПЭГ активируют с помощью

N-оксисукцинимида. 12 г сукцинилированного ПЭГ с молекулярным весом 80000 (0,15 ммоль) растворяют в 120 мл сухого

ДМФ, после чего с перемешиванием добавляют 300 мг (2,6 ммол ь) N-оксисукцинимида. После полного растворения добавляют 2,4 ммоль дициклагексилкарбодиимида. Полученный раствор перемешивают в течение 30 минут при 40 С. а затем ему дают стоять в течение 5 суток при 24 С.

Затем смесь фильтруют через фильтр из стекловолокна. Фильтрат выпариваютдосуха в вакууме при 40 С. Остаток растворяют, слегка нагревая, в 200 мл сухого толуола.

Твердый И-аксисукцинимидил-ПЭГ осаждают путем добавления 400 мл петролейнаго эфира. Полученный продукт собирают в вакууме на фильтре из стекловолокна и его повторно осаждают из толуола с помощью петролейнага эфира и, наконец, его высушивают в вакууме. Данные ВЭЖХ показывают, что молекулярный вес аддуKTB в результате активации не меняется.

35

Раствор, содержащий 80 мг бычьего ПОД, содержащего медь и цинк. (2.46 ммоль, 4400 ед/мг, фирмы DDI Pharmaceuticals, Inc,) в 39 мл 0 1 M буферного раствора фосфата калия (рН 8,0) добавляют к раствору, содержащему 4 г (50 ммоль) сухого N-оксисукцинимидил-производного ПЭГ, и полученную смесь растворяют при 24 С.

Данные ВЭЖХ показывают, что реакция связывания в основном завершается за 1,5 ч, что следует из исчезновения непрореагировавшей ПОД и появления лика УФ-абсорбирующего высокомолекулярного аддукта с молекулярным весом ок. 200000.

Свободный Г1ЭГ, который не связывается с ПОД, отделяют от аддукта ПЭГ—

ПОД путем ионообменной хроматографии.

Фракции, содержащее ПЭГ-ПОД, собирают путем повышения ионной силы буфера элюирования (рН 9) с использованием NaCI. Фракции ПЭà — ПОД диализуют против воды в целях удаления буферных компонентов и затем концентрируют путем высушивания вымораживанием или выпариванием в вакууме.

В качестве примера дается описание свойств характерного продукта, элюированного 50 мЫ МаС(, Аддукт содержит 24 мг белка ПОД и 165 мл связанного с белком

ПЭГ. Содержание белка определяют биуретной реакцией, а содержание ПЭГ—

ВЭЖХ, используя метод обнаружения показателя преломления и поправляя значение на долю показателя преломления, приходящуюся на белок. Согласно определению средний молекулярный вес связанного с белком ПЭГ составляет 72000. Этот молекулярный вес ПЭГ, высвобожденного из аддукта лротеолиэом. в сочетании с данными, показывающими, что соотношение белка ПОД (молекулярный вес 32000) и ПЭГ в аддукте составляет 24 мг с 165 мг, дает соотношение 3 нитей ПЭГ на молекулу ПОД, На основе полученного таким образом числа нитей ПЭГ на молекулу ПОД вычисляют молекулярный вес аддукта 220000 (72000 х 3

+ 3?000/8). Это результат согласуется с молекулярным весом, полученным ВЭЖХ.

Активность ПОД вышеуказанного аддукта определяют с использованием пробы цитохрома С llo методике McCord u Firdovich (J.8 ioI.Chem,244, 6049 — 6055 /1969 r./), Удельная активность аддукта П Э Г вЂ” ПОД (ок.4317 ед./мг белка) составляет 98% активности нативнаго исходного фермента (4400 ед./мг). Итак, продукт сохраняет почти полную нативную ферментативную или биологическую активность и в то же время удовлетворяет другим требованиям изобретения.

Производное ПЭà — ПОД, полученное как описано в настоящем примере, сравнивают с высакочистой, немодифицированнай исходной ПОД для определения его потенциала иммунологической сенсибилизации (активности вызывать анафилактические реакции). В этих целях на мышах-самках породы Свисс Вебстер проводят испытание с сенсибилизацией и заражением для проверки напряженности их иммунитета

10 мышей иммунизируют в течение 2 недель

4-кратным подкожным введением 0,075 мг белка на дозу, а затем их подвергают повторному заражению внутривенным введением того же соединения с содер>канием

0,04 мг белка с интервалом в 21 день. В группе мышей, которым вводилась немодифицированная ПОД, после пятого повторного заражения погибло пять животных и три из остальных пяти показывали признаки анафилаксии, в то время как группа мышей, которым вводилась та же доза ПЭà — ПОД, не показывала никаких признаков анафилаксии.

Когда в таком же испытании используют аддукт ПЭà — ПОД, содержащий в молекуле

ПОД примерно 6 нитей ПЭ Г с молекулярным весом 5000, после пятого заражения погибло 2 из 10 мышей и 4 из остальных показывали признаки анафилаксии. Из этого вытекает, что предлагаемая ПЭà — ПОД, содержащая 3 нити ПЭГ с молекулярным весом

72000 в молекуле ПОД менее иммуногенна, чем ПЭà — ПОД, содержащая вдвое больше нитей ПЭГ с молекулярным весом 5000.

1776275

5

20

30

50

Пример 2. По методике, описанной в примере 1, связывают высокомолекулярные

ПЭГ с бычьей ПОД, содержащей медь и цинк. В испытаниях было обнаружено, что продукты с 5 нитями ПЭГ с молекулярным весом 100000 или с 3 нитями ПЭГ с молекулярным весом 120000 менее иммуногенны, чем нативная ПОД или продукт, содержащий 4 нити ПЭГ с молекулярным весом

35000.

Пример 3. Аналогично методике по примеру 1 сравнивают устойчивость к сыворотке нативной ПОД и ПЭà — ПОД с использованием взрослых мышей-самок породы

Свисс Вебстер. Им вводят внутривенно 100 мкг ПОД. Регулярно отбирают пробы крови и плазму анализируют D целях установления специфической активности ПЭГ-ПОД по электрофо ретическому методу, обеспечивающему отделение ПЭà — ПОД от ПОД мышей.

Один из анализированных аддуктов ПЭГ—

ПОД содержит 2 нити ПЭГ с молекулярным весом ок. 65000 и другой — 4 нити ПЗГ с молекулярным весом ок. 40000. Период полураэложения натионой ПОД мышей составляет 5 — 10 минут, о то время как период полуразложения двух указанных аддуктов

ПЭ Г вЂ” ПОД превышает 36 часов, а активность

ПЗ Г вЂ” ПОД в крови этих животных обнаруживается не менее чем в течение 9 дпей, Другой препарат, содержащий в среднем

2,6 нити с молекулярным весом ок. 45000, показывает период полуразложения свыше

36 часов.

Пример 4. Водный раствор ПЭГ (фирмы Union Carbide) с молекулярным весом согласно этикетке 100000 (средний вес, определенный по характеристической вязкости), но имеющий средний молекулярный вес ок. 50000 согласно измерени)о по

ВЭЖХ, подвергают фракционированию по размерам молекул путем ультрафильтрации с использованием аппаратуры типа Millipor

Minitan, оснащенной отделительной мембраной с молекулярным весом 300000(белковый стандарт). Фргкционирооанный продукт высушивают в вакууме. Последующий анализ с помощью ВЭЖХ показыоает повышение среднего молекулярного веса пробы от 50000 до 100000, что является результатом ультрафильтрации. К раствору 3,77 г фракционированного таким образом ПЭГ в 100 мл сухого ацетонитрила добавляют 1,39 г хлорангидрида циануровой кислоты в 2,8 мл сухого ацетонитрила.

Раствору дают стоять в течение 3 суток при

24 С, после чего его разбавляют одинаковым объемом ацетонитрила и осветля)от фильтрацией. Растворитель упаривают под . вакуумом при 30 С, а остаток вновь растворяют в 120 мл сухого толуола. Продукт осаждают добавлением 360 мл сухого гексана, Продукт еще раз осаждают из толуола, применяя петролейный эфир, и затем высушивают в вакууме, в результате чего получают ПЭГ, активированный хлорангидридом циануровой кислоты. Данные эксклюзивной ВЭЖХ показывают, что молекулярный вес ПЗГ в результате активации не меняется.

Разные количества активированного вышеописанным образом ПЭГ испытывают в целях определения их способности соединяться с бычьей ПОД, содержащей медь и цинк и наличествующей в постоянном количестве 1 мг/мл. Конечные концентрации

ПЭГ составляют 5- 100 мг/мл. По истечении реакционного периода в 24 часа при 24ОС смеси анализируют с помощью ВЭЖХ и УФоблучения для выя вления количеств образованной ПЭà — ПОД и остаточной ПОД.

Как показывают данные таблицы, при весовом соотношении ПЭГ с ПОД 50:1 (молярное соотношение 16,6:1) 90% ПОД превращается в ПЭà — ПОД со средним молекулярным весом 150000. При более оысоких соотношениях Г1ЭГ с ПОД повышаются количества ПОД, превратившейся в

ПЭà — ПОД, и молекулярный вес аддукта.

Полученные размеры аддуктов показывают, что в этих условиях при использовании циануровой кислоты в качестве связующего вещества до двух нитей ПЭГ с молекулярным весом 100000 могут быть присоединены к

ПОД, Живучесть продуктов в сыворотке мышей измеряю для продуктов ПЗГ-ПОД в весовом соотношении 10;1 и для реакции

ПЗГ с ПОД в весовом соотношении 75:1, приведенных о таблице. Для измерения используют те же методы, что и в примере 3.

Периоды полуразложения для обоих испытанных продуктов составляют не менее

36 часов.

Пример 5. 10 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 100 КД (ПЭГ 100 КД фирмы Union Carbide) сушат вымораживанием в течение суток для удаления влаги из пробы. Высушенный ПЭГ 100 КД растворяют примерно в 45 мл сухого ацетонитрила.

Потом добавляют 5,12 r 1,1-карбонилдиимидазола, после чего полученную реакционную массу выдерживают при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Затем ее резко охлаждают в деионизованной воде в целях разрушения избыточного карбонилдиимидазола.

Поддерживают значение рН 7 для предупреждения гидролиза активированного

ПЭГ. Потом смесь диализуют в течение су13

1776?75

ВЭЖХ. 55

Пример 7. Повторяют вышеописанный процесс с помощью человеческой ПОД.

В этих целях 20 мл проб активированного, сукцинилированного ПЭГ помещают в стеклянные трубки. Затем добавляют 100 мкл ток при 4 С против 4 л дистиллированной воды, сменяя воду минимум 10 раз. для удаления ацетонитрила и имидазола, После диализа. активированный ПЭГ хроматографируют на колонке типа Sephacryl S-400 в деионизированной воде для отделения активированного ПЭГ 100 К от низкомолекулярных фрагментов.

К полученному активированному ПЗГ добавляют ПОД в количестве, достаточном для получения молярного соотношения 3 молей ПЭГ на моль ПОД. В этих целях к смеси (объем 108 мл) добавляют 92,8 мг

ПОД. Затем полученную смесь для получения желаемого продукта ПЗà — Π— СО-ПОД 4 раза сушат вымораживанием.

Пример б. К раствору 30 г полиэтиленгликоля в 1100 мл сухого диоксана при

35 С в азотистой атмосфере с перемешиванием медленно добавляют 10 r гидрида натрия. После перемешивания в течение еще одного часа при 25 С добавляют 15 мл этилбромацетата, Раствор перемешивают при

25 С в течение 30 минут, а затем в течение

2 часов при 45 С, после чего реакцию завершают путем добавления 200 мл воды, Затем с перемешиванием добавляют 400 мл петролейного эфира. Потом выбрасывают органическую фазу и вязкую водную фазу промывают петролейным эфиром, Водную фазу, содержащую этиловый эфир ПЭГ, разбавляют до объема ок. 1 л и омыляют путем повышения температуры до 60—

70ОС в течение 5 часов. Наконец карбоксильные группы ПЗ Г превращают в свободную кислоту путем подкисления до значения рН 2. Оставшуюся бромуксусную кислоту удаляют путем диализа или гельфильтрации. Полученный таким образом простой эфир ПЭГ можно использовать вместо сукцинилированного ПЭГ, используемого в примере 1.

Итак, используя 9,4 r активированного

ПЭГ с молекулярным весом 40000 и 7,9 мг бычьей ПОД, получают аддукт, содержащий в среднем 3,3 нити ПЗГ на молекулу ПОД.

Молекулярный sec продукта, определенный методом ВЭЖХ, составляет ок. 140000. Этот аддукт проявляет значительно сокращенную иммуногенность в мышах.

Используя 6,5 r полиэтиленгликоля с молекулярным весом 120000 и 87 r бычьей

ПОД, получают аддукт с молекулярным весом ок. 245000, определенным методом

50 раствора 3 мг/мл человеческой ПОД в 0,2молярном фс".фат-боратном буфере. После перемешивания отбирают пробы каждой реакционной массы (по 2 мкл) и резко охлаждают в 58 мкл 0,01-молярного буфера, содержащего ацетат натрия и уксусной кислоту в соотношении 1:1, в микротрубке емкостью 250 мкл. Для наблюдения за ходом реакции пробы реакционной массы подвергают электрофорезу при рН 8,5 и напряжении 250 В в течение 15 минут с последующим окрашиванием тетразолиевым синим.

Через 3 — 3,5 ч при комнатной температуре растворы резко охлаждают 45 мкл 0,03молярного ацетатного буфера (1:1) на мг

ПЗГ. Добавлением 0,1 мл реакционного буфера со значением рН 8 и 0,9 мл (30 ммоль) ацетата значение рН доводят до 6,4. После падения значения рН путем разбавления в соотношении 1;! 0 прекращают дальнейшее связывание ПЭГ с ПОД и гидролиз продукта. Через 30 — 45 минут реакция заканчивается.

Продукт ПЭà — ПОД с нитями ПЭГ с молекулярным весом 19000 Д наподобие свободной ПОД через 1 день после впрыскивания уже нельзя было обнаружить в сыворотке мышей, в lo время как нити ПЭГ с молекулярным весом 30000 Д дают продленную живучесть продукта. Итак, человеческую ПОД можно использовать для предлагаемых целей.

Пример 8. Для установления противовоспалительной активности проводят испытание о -ека лапок мышей, индуцированного каррагенаном. В этих целях 0,03 мл

1,0% каррагенана в физиологическом растворе подкожно впрыскивают в правую заднюю лапку мышей-самок породы Свисс

Вебстер. Через 30 минут животным подкожно вводят 100 мкл испытуемого соединения, полученного путем разбавления физиологическим раствором с последующей стерилизацией фильтра. Через сутки после впрыскивания каррагенана умерщвляют мышей, а потом ампутируют и взвешивают их задние, . лапки. Вес отека вычисляют, исходя из веса правой лапы после впрыскивания препарата, иэ которого вычитают вес необработанной левой лапы, Вычисляют средние и стандартные отклонения веса отсека для каждой группы обрабатываемых мышей, включая группу контрольных мышей, обработанных всего лишь физиологическим раствором.

При дозировке 30 мг на мышь аддукт с

2,6 нити ПЭГ с молекулярным весом 45000 оказывается более эффективным в уменьшении отека. чем аддукт с 3,4 нити ПЭГ с

1776275

Зависил1ость молекулярного веса аддукта от соотношения ПЗГ и ПОД

Г1ЭГ: ПОД ревращение П аддукт, % (М;У) 25

29

62

IOO

1,7

3,3

6,6

1b,7

24,0

) 00

+ Определение по ВЭЖХ на колонках типа TSK FVt, Откалиброванных торговыми эталонами ПЭ Г.

Составитель И. Чаплина

Редактор R. Трубченко Техред M.Mîðãåíràë Корректор П. Гереши

Заказ 4047 TIlPBM Подписное

ВНИИПИ Государственнсго комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035, Москва, K-35, Раушская наб., 4/5

Произзодственно-издательский I "II6Ièíàò "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 молекулярным весом 21000 (уменьшение на 43% и 14% соответственно), Аддукт с 3 нитями ПЭГс молекулярным весом 120000 гоказывает уменьшение отека на 41% при дозировке в 10 мкг/мышь. В атом 5 испытании нативная ПОД, содержащая медь и цинк, оказывается неактивным даже при дозировке 300 мкг/мышь, что наблюдается и при дозировке 100 мкг на мышь аддукта с 14 нитями ПЭГ с молекулярным весол 10

5000, П р и M е р 9. Для установления антигенности пользуются иммуноиспытанием конкурирующего связывания фермента в тверцой фазе (ELISA} для измерения взаим- !5 ной рсакционной способности соединаний

ПЭГ-ПОД на основе бычьей ПОД, содержащей медь и цинк, с кроличьими антителами, направленными на вь,сокочистуl<> нативную бычью ПОД, содержащую медь и 20 цинк. Предлагаемые коньюгаты требуют меньшего количества нитей ПЗГ для сокращения антигенности, чем соединения, полученные с более короткими нитями, например, с нитями ПЭГ с молекулярным 25 весом 5000. Например, аддукт, содержащий в среднем соответственно 2,6 нити ПЗГ с молекулярным весом 45000 и 4 нити ПЭГ с молекулярным весом 35000, показывает антигенность, соответственно в три и 10 раз 30 ниже, чем у аддукта с 6 нитями ПЭГ с молекулярным весом 5000. Антиген ность аддукта с 4 нитями ПЗГ с молекулярным весом

35000 в два раза нил<е антигенности аддукта с 14 нитями ПЭГ с молекулярным весом 35

5000, Среди аддуктов, полученных с ислом нитей ПЭГ менее 4, аддукты с ПЭГ с моггекулярным весом в пределах 100000120000 менее антигенны, чем аддукты с таким же числом более коротких нитей. Так, аддукт ПОД с 2 нитями ПЭГ с молекулярным весом 120000 был в 5 раз менее антигенным, чем аддукт с 2 нитями ПЭГ с молекулярным весом 35000, Формула изобретения

1. Способ получения водорастворимого коньюгата Cu,Zn-зависимой пероксид-дисмутэзы, предусматривающий связывание фермента через аминогруппу лизина и СОсвязь с кислородсодержащим полимером алифатического ряда, имеющим концевую группу, полученную в результате модификации, отличающийся тем, что, с целью пролонгирования действия целевого продукта, из ряда кислородсодер>кащих полимеров алифатического ряда используют полиэтиленгликоль или изопропоксиполизтиленгликоль с мол,м. 40000-200000, одна концевая группа которого модифицирована в сло>кноэфирну о карбоксильную, амино-, карбоксамидо- или альдегидную группы, причем для связывания с молекулой фермента берут 1-8 молекул модифицированНОГО г1олимера.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что использу от модифицированный полимер с мол,м. предпочтительно 40000—

150000;

3. Способ по и. 1, отличающийся тем, что к каждой молекуле Cu,Zn-зависиМоМ пероксид-дисмутазы присоединяют, предпочтительна,2 — 6 молекул полимера.

Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы Способ получения водорастворимого коньюгата с @ , z @ - зависимой пероксид-дисмутазы 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к энзимологии, а именно к способу стабилизации фермента уриказы

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии

Изобретение относится к микробиологической промышленности

Изобретение относится к способам стабилизации ферментов, содержащих SH-группы, а именно к способу стабилизации уреазы в растворе

Изобретение относится к способу стабилизации водного раствора или суспензии металлопротеазы, а также к водному раствору металлопротеазы, стабилизированному для лучшего использования, хранения и транспортировки такого фермента

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения потерь активности ферментов при тепловом обезвоживании ферментных растворов

Изобретение относится к области биохимии и используется для стабилизации растворов конъюгатов антител или антигенов

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым твердым ферментным композициям, включающим смеси из, по меньшей мере, одного стабилизированного солью ферментного состава, по меньшей мере, одного носителя в форме частиц и, по меньшей мере, одной гидрофобной жидкости

Изобретение относится к способам получения и очистки димера рибонуклеазы, которые могут использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу повышения устойчивости фермента урокиназы к нагреванию, и может быть использовано для инактивации вирусов, присутствующих в препарате

Изобретение относится к способам приготовления и очистки димера лизоцима, которые могут в частности, использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций

Изобретение относится к биохимической технологии, а именно к способам хранения (консервации) протеиназ и других ферментов, применяемых в медицине, биотехнологии, научных исследованиях
Наверх