Способ получения сорбента для выделения фибронектина

 

Сущность изобретения: сорбент получают путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, причем в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакрилатные группы в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы в 1-3%- ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8-9. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4844578/05 (22) 29,06.90 (46) 30,11.92. Бюл. М 44 (71) Научно-производственный центр медицинской биотехнологии и Институт биоорганической химии им. M.M,Øåìÿêèíà (72) M.À.Ãðèí, А.Е.Иванов, Г.А.Афанасенко, В.П.Зубов, В.В.Жильцов и В.В.Гузеев (56) Regnault Ч., Rivat С., Sfoltz J. Affinity

purification of human plasma fibronecfin on

immobilized gelatin — J.Chrom. 1988, ч.432, р.93 — 102. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ

ВЫДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕКТИНА

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения биоспецифического сорбента для выделения и очистки биологически-активного белка — фибронектина.

Фибронектин — высокомолекулярный полифункциональный гликопротеин, который принимает участие в различных функциях клеток, включая адгезию клеток, формирование экстрацеллюлярного матрикса и изменения цитоскелета, клеточную подвижность, фагоцитоз, дифференцировку и онкологическую трансформацию.

Известен способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на Сефарозе CL-4В, активированной бромцианом. Полученный таким способом сорбент содержит желатина 3-5. мг на 1 мл геля и имеет емкость по фибронектину — 1 мг на 1 мл геля. Элюция буфером, содержащим 3М мочевину, приво«. « Ы„„1777951 А1 (я)5 В 01 J 2й/30, С 07 К 3/20

/ (57) Сущность изобретения: сорбент получают путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, причем в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакрилатные группы в количестве 2 — 90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы в 1 — 3%ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8 — 9. 3 табл. дит к десорбции высокоочищенного фибронектина с 65 выходом.

Однако недостаточно высокий выход белка, низкие механические и гидродинамические характеристики сорбента не позволяют использовать его в крупномасштабной . хроматографии фибронектина, Известен способ получения сорбента для выделения фибронектина, основанный на иммобилизации желатина на карбоксиметилцеллюлозе, активированной тионилхлоридом. Элюция белка с сорбента осуществляется 4 — 4,5 M раствором мочевины при рН 7,4-7,5. Использование данного сорбента позволило повысить выход фибронектина в 1 5 раза по сравнению с желатинСефарозой и достигнуть 90% чистоты белка.

Однако желатин-KM целлюлоза, представ. ляющая собой набухающий в воде пористый мягкий органический гель не может быть использована для препаративной наработки фибронектина.

1777951 с активацией силикагеля и последующей сшивкой желатина бисакриламидом. Ука- 10

30 ванный фибронектин с производительностью 0,043 — 0,067 мг/млх

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к настоящему изобретению является способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на силикагеле, активированном глутаровым диэльдегидом и нитритом натрия. Иммобилизацию желатина проводят одновременно занный способ позволяет получить сорбент с повышенной емкостью (1,3 — 2,2 мг фибронектина на 1 мл носителя). Полученный сорбент обладает высокой стабильностью и не теряет своих свойств при 50-кратном использовании в течение 3-х месящев работы.

Основным недостатком вышеуказанного способа является его двухстадийность и использование целого ряда органических реагентов, в том числе высокотоксичного биса криламида.

К недостаткам указанного способа также можно отнести то, что полученный согласно ему сорбент не предназначен для препаративного выделения фибронектина, а служит лишь для аналитического определения фибронектина в плазме крови. Использование сорбента для препаративной очистки фибронектина иэ плазмы ограничено малой производительностью сорбента при хроматографии (допустимая скорость потока плазмы через колонку объемом 2,5 мл составляет 0,25 — 0,5 мл/мин). В связи с этим сорбент по способу-прототипу позволяет получить биоспецифически сорбирохмин.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение производительности сорбента в процессе выделения фибронектина, Поставленная. цель достигается описываемым способом получения сорбента для выделения фибронектина, заключающимся в том, что в качестве активированной матрицы для связывания желатина используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиэкрилатной оболочкой, содержащей активные A-Hèòðîôåíèëàêðèëàòíûå группы в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, Процесс иммобилизации проводят путем инкубации матрицы с 1-3% раствором желатина в растворе бикарбоната натрия при р Н 8-9.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Получение сорбента для выделения фибронектина (желатин-МПСПА).

В колбу, содержащую 250 мл 2% раствора желатина в 0,3 M растворе бикарбоната натрия с рН 8,5, вносят 50 r биосорбента

МПС-ПА, перемешивают и инкубируют в течение суток при умеренном встряхивании, после чего в реакционную смесь добавляют

5 мл зтаноламина, перемешивают и выдерживают еще сутки. Полученный сорбент промывают физиологическим раствором, 0,05

М трис-HCI буфером рй 7,5, содержащим 1

M NaCI и 4 M мочевину для удаления несвяэавшегося желатина и уравновешивают в

002 М цитратном буфере рН 7,5, содержащем 0,01 M эпсилон-аминокэпроновую кислоту и 1 М NaCI и используют для выделения фибронектина из бычьей плазмы. Емкость полученного сорбента составила 2,2 мг фибронектина на 1 мл сорбента, Пример 2. Синтез сорбента проводят аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 1% раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,0 Ml фибронектинэ на 1 мл сорбента, Пример 3. Синтез сорбента проводят аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 3% раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,5 мг фибронектина на 1 мл сорбента, Используемый диапазон концентраций желатина является оптимальным по параметру числа активированных групп, находящихся на сорбенте.

Пример 4. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 8,0, Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Пример 5. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят лри рН 9,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,4 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Пример 6. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 7,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 0,8 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Пример 7. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят лри рН 9,5. Полученный сорбент обрабатывэкп по примеру 1. Он имеет емкость 1,0 мг фибронектинэ на 1 мл сорбента.

Пример 8. Хроматографическое выделение фибронектина из бычьей плазмы на желатин-МПС-ПА.

На колонку размером 1х3,2 см (объем

2,5 мл), заполненную сорбентом по примеру

1, наносят со скоростью 5 мл/мин 25 мл бычьей плазмы. Колонку промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1.

1777951

50

M NaCI и 0,01 M эпсилон-аминокапроновую кислоту до нулевого значения поглощения при 280 нм, и далее элюируют специфически сорбированный фибронектин 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,5, содержащим 1 M

NaCI и 4 M мочевину. Собирают фракции объемом 3 мл и измеряют их оптическую плотность при 280 нм, Элюат обессоливают на Сефадексе G-25, используя 0,02 М цитратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 M

NaCI и 0,05 M трилона Б. Производительность сообента в процессе выделения фибронектина составила 0,44 мг/мл мин.

Сравнительные характеристики сорбента, полученного заявленным способом и известным, представлены в табл.1.

Емкость и производительность сорбентов, полученных по примерам 1-8, при пропускании 25 мл бычьей плазмы со скоростью 5 мл/мин через колонку с 2,5 мл сорбента, а также выход фибронектина в данных примерах представлены в табл.2.

Из данных табл.1 и 2 следует-, что при сохранении емкости и увеличении производительности сорбента, полученного по описываемому способу, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу в 10 — 11 раз. выход фибронектина не уменьшается (0,22 мг/мл по описываемому способу против 0,215 мг/мл по способу-прототипу).

Пример 9, Препаративное выделение фибронектина из бычьей плазмы в режиме

in batch.

В 1400 мл бычьей плазмы вносят 400 мл биосорбента желатин-МПС-ПА, полученного по примеру 1. Проводят сорбцию в объеме при перемешивэнии в течение 1 ч.

Супернатант удаляют, сорбент промывают .

0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1 М NaCI и 0,01 M эпсилон-аминокапроновой кислоты для удаления неспецифически сорбированных белков до нулевого поглощения при 280 нм. Отмытый сорбент вносят в 400 мл 0,1 M трис -НС1 буфера рН 7,5, содержащего 8 М мочевины и 2 М NaCI. Элюцию проводят в объеме в течение 15 мин. После удаления элюата вторично проводят элюцию и так до полной десорбции фибронектина с сорбента, Затем элюат обессоливают на Сефэдексе G-25, используя 0,02 M цитратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 M NaCI и 0,05 М трилон Б.

Таким образом, полученный описываемым способом сорбент может быть использован в крупномасштабном производстве фибронектина.

Проведен сравнительный эксперимент по излучению кинетики сорбции фибронектина на известном (Желатин-Силикагель) и полученном (Желатин-МПС-ПА) сорбентах.

Сравнение проводили с использованием

100 мл бычьей плазмы и 30 мл указанных сорбентов, Результаты представлены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, максимальная емкость известного сорбента достигается за 1 ч, тогда как описываемого сорбента — за 10 мин. Таким образом, и в

batch — варианте сорбции сорбент ЖелатинМПС-ПА оказывается в 10 раэ производительнее, чем Желатин-Силикагель (для

Желатин-МП С-ПА производительность равна 2,2/10 = 0,22 мг/мл мин, тогда как для

Желатин-Силикагеля — 1,5/60 = 0,025 мг/млх

Хмин)

Препарат фибронектина, полученный с использованием сорбента по описываемому спосабу, характеризуется высокой гомогенностью по данным электрофореза в

ПААГ. Сорбент выдерживает непрерывную эксплуатацию в течение 4 месяцев без заметных изменений емкости и производительности.

Таким образом, описываемый способ позволяет упростить процесс получения сорбента для выделения фибронектина за счет одностэдийности и исключения использования токсичных соединений и повысить производительность сорбента при сохранении его специфической емкости.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения производительности сорбента в процессе выделения фибронектина, в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные и-нитрофенилакрилатн ые группы, в количестве 2 — 90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы, в 1 — 3 Д-ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8-9, 1777951

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Составитель Л, Платонова

Техред М.Моргентал Корректор И. Муска

Редактор С. Кулакова

Заказ 4154 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Параметры хроматографической очистки фибронектина на сорбенте по предлагаемому способу и по способу-прототипу