Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови

 

Использование: медицина, методы определения активности или содержания факторов свертывания или продуктов их превращения в крови. Цель изобретения - повышение специфичности способа, его упрощение и ускорение. Сущность изобретения: спектрофотометрически определяют количество фибринмономера и продуктов деградации фибрина, осаждаемых из плазмы добавкой ристомицина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОспАтент сссР) с

17j

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 О (40 (л) (21) 4891235 /14 (22) 17.12.90 (46) 07.12.92. Бюл, М 45 (71) Тюменский государственный медицинский институт (72) А.Ш.Бишевский, С,Л.Галян, С.А.Ральченко, В.Г;Соловьев, И.В.Нелепченко и

А.А. В акулин (56) Актуальные вопросы гоматологии.—

Томск, 1976, В. 1, с. 47-48. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФИБРИНМОНОМЕРОВ.

Способ относится к биохимии, точнее, к способам исследования активности или содержания компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях.

Известен способ обнаружения фибринмономеров, основанный на том, что при их наличии в плазме после добавления к ней

50 этанола появляется желеобразная масса (В.Г.Л ычев "Анализ и методика распознавания основных нарушений гемостаза и условий формирования геморрагического синдрома при лейкозах" Дисс. на соиск. ученой степени канд, мед, наук. Барнаул, 1975).

Желатинизация плазмы рассматривается как признак наличия в ней фибринмономеров.

Согласно описанному способу, кровь стабилизируют охлажденным раствором цитрата натрия, содержащим Р-аминокапроновую кислоту(0,1 M), отделяют плазму центрифугированием беэ осаждения тромбоцитов, к 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы добавляют 0,15 мл 50% зтанола, . Ж 1779693 А1 (я)5 С 12 Q 1/56, G 01 N 33/68

И ПРОДУКТОВ ДЕГРАДАЦИИ ФИБРИНА В

ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Использование: медицина. методы определения активности или содержания факторов свертывания или продуктов их превращения в крови. Цель изобретения— повышение специфичности способа, его упрощение и ускорение. Сущность изобретения: спектрофотометрически определяют количество фибринмономера и продуктов деградации фибрина, осаждаемых из плазмы добавкой ристомицина, встряхивают пробирку при комнатной температуре или на холоде и через 10 мин учитывают результат, Появление желеобразного сгустка рассматривается как свидетельство присутствия в плазме фибринмономеров, если сгусток появляется не позже 10-й минуты. В части случаев при добавлении к плазме 50% этанола образуется не гель, а крупнозернистые частицы, что оценивают либо как слабоположительную реакцию, либо как отрицательную.

Существует способ выявления фибринмономеров, дополняющий вышеописанный — протаминсульфатный тест (Lipinski В., Worowski К. Thromb. 0iath.

Haemorrh, 1968. ч. 20, N 12, р. 44): в цитратной плазме, обедненной тромбоцитами, добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата, встряхивают, через 10 и 30 мин определяют, образовался ли в плазме сгусток или гель, что рассматривается как положительный результат, 1779693

Недостатки метода: 1) субъективность в оценке результатов, т,к. появление хлопьев, зернистости и мути не принимается во внимание, а учитывается только крупный сгусток; 2) возможность ложноположительных результатов.

В связи с этим, протаминсульфатный тест используется только в совокупности с зтаноловым тестом. В итоге, оба указанных метода, используемые порознь или одновременно. отличаются субъективизмом в оценке результатов и не позволяют оценить количество продуктов.

Существует и количественный метод определения суммы фибринмономеров и продуктов деградации фибрина (Л.П. Цывкина и И.Л,Маркина В кн.: Актуальные вопросы гематологии. — Томск, 1976, — В. 1. — С.

47-48) путем установления количества фибриногена, осаждаемого ристомицином, Этот метод по технической сущности и достигаемому результату принят нами эа прототип, Суть его заключается в том, что определяется разница в содержании фибриногена в плазме до и после обработки ее ристомицином: к 0,1 мл бедной тромбоцитами плазмы добавляют 0,1 мл раствора ристомицина (8 мг/мл), возникший сгусток удаляют, а в плазме затем определяют содержание фибриногена, осаждая его сульфитом натрия или сульфатом аммония, с помощью нефелометрии. Предварительно определяют содержание фибриногена в исходной плазме. Разница в содержании фибриногена до и после осаждения фибринмономеров и продуктов деградации фибрина характеризует суммарное количество фибринмономеров и продуктов деградации фибрина.

К недостаткам метода относится:

1. Неспецифичность, обусловленная тем, что в плазму добавляют большое количество ристомицина, которое осаждает не только исследуемые продукты, но и фибриноген, а также тем, что определение количества исследуемых продуктов проводят косвенно, а именно — по разнице между содержанием фибриногена до и после добавления ристомицина. 2. Трудоемкость и относительно большая продолжительность анализа, обусловленная; а) необходимостью определять фибриноген два раза; б) использованием для определений способа. включающего осаждение фибриногена и нефелометрическое его определение.

Цель изобретения — повышение специфичности, сокращение продолжительности и снижение трудоемкости определения, Поставленная цель достигается в заявляемом способе путем добавления к плазме ристомицина в оптимальном количестве, т.е. в таком, которое осаждает только исследуемые продукты и не осаждает других белков, в частности, фибриногена.

Это обеспечивается добавлением ристоми10 цина в количестве, создающем его конечную концентрацию в плазме, близкую к

0,5 мгlмл. Использование зкспериментально обоснованного количества ристомицина обеспечивает повышение специфичности способа, т,к. этим путем достигается избирательное осаждение растворимых комплексов мономерного фибрина и продуктов деградации фибрина

Сокращение продолжительности и снижение трудоемкости достигается тем, что отделившийся после добавления ристомицина осадок растворяют в 1 М едком натрии и непосредственно определяют оптическую плотность раствора, которая позволяет рассчитать суммарное содержание фибринмономеров и продуктов деградации фибрина.

Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключае.тся;

1. В повышении специфичности, достигаемой: а) тем, что добавление к плазме экспериментально обоснованного количества ристомицина избирательно и специфично осаждает фибриномономеры и продукты деградации фибрнна, не вызывая в отличие от способа-прототипа соосаждения фибриногена; б) тем, что в предлагаемом способе путем спектрофотометрии проводится определение непосредственно исследуемых продуктов, в то время как в способе-прототипе об их содержании судят по степени убыли фибриногена после добавления ристомицина.

2. В сокращении продолжительности и снижении трудоемкости, что достигается отказом от двукратного определения фибриногена в исследуемой плазме с помощью нефелометрии, используемых в способепрототипе, и проведении прямой спектрофотометрии раствора исследуемых продуктов.

Способ осуществляется следующим образом:

1. 2 мл венозной крови, стабилизированной 3,8% раствором цитрата натрия (1:9), помещают в коническую пробирку и центрифугируют 15 мин с ускорением 375 g.

1779693

2. Отделяют 0,5 мл плазмы в сухую пробирку и цинтрифугируют 20 мин с ускорением 1500 g, плазму переносят в сухую пробирку.

3. К плазме добавляют 0,1 мл раствора 5 ристомицина (2,5 мгlмл), экспонируют 5 мин при комнатной температуре, 4. Смесь плазмы с ристомицином центрифугируют 5 мин с ускорением 1500 g.

5, Недостаток удаляют и добавляют в 10 пробирку 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендируют осадок и центрифугируют 5 мин с ускорением 1 500 g.

6, Надосадок удаляют и повторяют промывание физиологическим раствором 2-й 15 раз, после чего к осадку в пробирке добавляют 3 мл 1 М раствора едкого натра, помещают в пробирку на 3-5 мин на кипящую водяную баню — происходит растворение осадка. 20

После охлаждения раствор помещают в кварцевую кювету с рабочей длиной 10 мм, и при 280 нм определяют оптическую плотность против 1 М едко о натра.

Расчет производится по формуле: 25

А280 n Ь 10

15,1 где С вЂ” концентрация фибринмономеров и 30 продуктов деградации фибрина в г/л плазмы;

А во — оптическая плотность исследуемого раствора при 280 нм;

n — коэффициент пересчета на 1 мл 35 плазмы;

b — коэффициент пересчета с учетом разведения осадка едким натром;

10 — коэффициент перехода от концентрации e к г/л; 40

15,1 — оптическая плотность 1 раствора фибриногена.

Существенные отличительные признаки заявляемого решения.

1. Добавление к исследуемой плазме 45 ристомицина в количестве 0,5 мг на 1 мл в течение 5 мин обеспечивает выпадение фибринмономеров и продуктов деградации фибрина. Строго заданная концентрация ристомицина обеспечивает специфичность 50 способа, т,е. осаждение только исследуемых продуктов.

2. Определение фибринмономеров и продуктов деградации фибрина позволяет оценить их суммарное количество в 55 одной пробе, что наряду с использованием прямой спектрофотометрии снижает трудоемкость и продолжительность анализа, Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. а) Кровь у здоровых доноров взяли в шприц со стабилизирующим раствором (3,8 р-р цитрата натрия) в соотношении

1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение 15 мин; б= 0,5 плазмы из каждой пробирки перенесли в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 g, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки; в) к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл); г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 g, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия. суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 g, 5 мин); д) повторили пункт "r" и удалили надосадок; е) к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню

HB 3 мин, ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя и ри 280 н м (см.табл. 1), Пример 2, а) Кровь трех больных с механической желтухой взяли в шприц со стабилизирующим раствором (3,8 р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение

15 мин. б) 0,5 мл плазмы из каждой пробирки перенесли в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 g, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки; в) к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 раствора ристомицина (2,5 мг/мл); г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 g, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 g, 5 мин); д) повторили пункт "г" и удалили надосадок; е) к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 M раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню на 3 мин;

1779693

Таблица 1

Таблица 2 ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (cM.òàáë.2), Пример 3. а) Кровь взята у трех белых крыс, которым предварительно ввели в вену тромбин (0,120 мг/100 г массы), т.е..создали экзогенную тромбинемию, что ведет к появлению фибринмономеров и продуктов деградации фибрина, на стабилизатор (3.8 р-р цитрата натрия) в соотношении

1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 g в течение

15 мин; б) 0,5 мл плазмы из каждой пробирки перенести в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 g. 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки; в) к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл): г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 g, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 g, 5 мин); д) повторяли пункт "г" и удаляли надосадок; е) к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню нд 3 мин; ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (см,табл.3), Формула изобретения

5 Способ опреДеления суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови путем обработки плазмы ристомицином, отделения полученного осадка с последующим из10 мерением оптической плотности и расчетом, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности способа, его упрощения и ускорения, проводят смешивание плазмы и ристомицина в объемном

15 соотношении 5:1, при этом используют ристомицин в конечной концентрации 0,5 мг/мл, полученный осадок растворяют в 1 М растворе едкого натра, оптическую плотность определяют при 280 нм, а количество фиб20 ринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме С рассчитывают по формуле

Огво и b 10

25 15,1 где 0 во — оптическая плотность раствора при 280 нм;

n — коэффициент пересчета на 1 мл плаз30 мы;

Ь вЂ” коэффициент пересчета с учетом разведения осадка едким натром;

15,1 — оптическая плотность 1 раство- ра фибринмономера;

35 10 — коэффициент перехода от концентрации в к г/л, 1779693

Таблица 3

Составитель А. Бышевский

Техред М.Моргентал Корректор Л. Филь

Редактор С. Кулакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4417 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5