Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае, используемый для получения липополисахарида

 

Использование: биотехнология, диагностика инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: получение нового штамма Klebsiella pneumoniae, стабильно продуцирующего лимополисахарид (ЛПС). Штамм Kl.pneumoniae выделен из клинического материала больного диареей. Наиболее благоприятной питательной средой для культивирования штамма служит мясопептонный бульон с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов. Урожайность штамма на этой среде составляет 5,42 г сухой массы на 5 л бульонной культуры. Выход целевого продукта в пересчете на 1 л питательной среды составляет 150 мг сухого вещества. Полученный ЛПС оЕ-ладает стабильными антигенными свойствами. При иммунизации лабораторных животных титр образующихся антител составляет 1:16- 1:32. 4 табл. (/т с

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕспуБлик

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ф 4H ° lt

-,".-Ьт т;.е. 1

\.,т ет

К ПАТЕНТУ (21) 4921 020/13 (22) 26.03.91 (46) 15.01.93. Бюл. N 2 (71) Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены и

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии им, Г.Н. Габрического (72) Л.Д.Мартыненко, А,В.Алещукина и

А.M.Ïîíoìàðåâà (73) Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ К1 ЕВЯ!Е А

PNEUMONIAE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности в процессе технологического производства липополисахарида (ЛПС) как антигена.

Штамм Klebsiella pneumonlae выделяют из клинического материала больного диареей, он депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им

Л,А.Тарасевича под номером 211 и характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки: грамотрицательные палочки, спор и жгутиков не имеют, неподвижные; при окраске в тушевом препарате по Бурои установлена продукция капсулы, размер которой достигает до 1/2

„„SU ÄÄ 1788965 А3 (я)з С 12 N 1/00 // С 12 R 1;22 (57) Использование: биотехнология, диагностика инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: получение нового штамма Klebsiella pneumonlae, стабильно продуцирующего лимополисахарид (ЛПС).

Штамм Kl.pneumonlae выделен из клинического материала больного диареей. Наиболее благоприятной питательной средой для культивирования штамма служит мясопептонный бульон с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов. Урожайность штамма на этой среде составляет 5,42 г сухой массы на . 5 л бульонной культуры. Выход целевого продукта в пересчете на 1 л питательной среды составляет 150 мг сухого вещества.

Полученный Л ПС of ладает стабильными антигенными свойствами. При иммунизации лабораторных животных титр образующихся антител составляет 1:16 — 1;32. 4 табл.

«Д диаметра тела бактериальной клетки. Злектронно-микроскопические признаки: палоч- QQ ки с закругленными концами, размер клетки Ср — длина 2,01+ 0,21 мкм при m=957ь, ширина

1,24+ 0,08 мкм при m = 957;, При просмотре более 1000 клеток жгутики не обнаружены.

Культуральные признаки: на мясопептонном бульоне через 3 ч при +37 ч-0,5 С наступает легкое диффуаное помутнение ) ° среды, через 16 — 18 ч — помутнение с плен- (,А) кой на поверхности среды с наслоением на стенки пробирки. На плотных питательных средах образуют через 18-24 ч при

+37 ч-0,5 С колонии, которые выглядят следующим образом, Рост на среде Зндо: колонии темно-розового цвета с более темной окраской в центре, выпуклые с легким серо-металлическим

1.788965 блеском, маслянистые, диаметр колоний

1,0 — 1,5 мм, признаков диссоциации нет, Рост на среде К-2: колонии светло-желтого цвета, с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1.0 — 1.5 мм. признаков диссоциации нет.

Рост на среде Ворфеля-Фергюсона: колонии прозрачные, беловатого цвета, выпуклые. маслянистые, диаметр колоний

1,5 — 2,0 мм, признаков диссоциации нет.

Рост на мясопептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легко снимаются, диаметр 1,0 — 1.5 мм. признаков диссоциации нет.

Факультативный анаэроб, оптимальные условия роста - аэробные; рост в диапазоне температур 12-43 С, оптимум+37 C.

Оптимум рН питательной среды 6,8-7 0.

Биохимические признаки;

Штамм К.pneumoniae 211 ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, дульцит, адонит, инозит, сорбит и глицерин; до кислоты — ксилозу и рамнозу. Неподвижный.

Утилизирует малонат натрия, цитрат Козера и Симонса. Не образует сероводород и индол. Обладает положительной уреазной активностью. Дает положительную реакцию

Фогес-Проскауэр и отрицательную с метиловым красным, что свидетельствует о ферментации глюкозы с . образованием ацетилметилкарбинола (ацетоина). Обладает лизиндекарбоксилазой и не обладает орнитиндекарбоксилазой, аргининдегидролазой и фенилаланиндеэаминазой.

Антигенная структура: серотипирование проводят с использованием набора сывороток по капсульному (К) антигену ВНИИ

ВС им. С.Мечникова.

Штамм Klebsielia pneumoniae 211 серотипирован по Е-антигену, как К.pneumonia

К16.

5, Чувствительность к антибиотикам; ..

По результатам исследования методом стандартных дисков штамм чувствителен к неомицину, канамицину, гентамицину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину; устойчив: к мономицину. стрептомицину, эритромицину, метилиллину, левомицетину, ристомицину, полимиксину, бензлипенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандомицину; ампициллину, линкомицину, фузидину."

Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма, Способы хранения могут быть следующие.

Лифоильно высушенные штаммы в ампулах на сахароэожелатиновой спеде хранят в холодильнике при+4 С.

На полужидком голодном агаре следующего состава:

Бульон питательный, содержащий 0,60,9 общего азота, рН 7,2 — 7,4 1000 мл;

Агар 2 — 4 г.

Способ приготовления среды: агар расплавляют в горячем бульоне, фильтруют, разливают по 8 — 10 мл в пробирки, стерилиэуют при 121 С 30 мин, Культуру засевают 2 — 3 уколами в столбик среды, помещают в термостат (37 С) и

15 ды 3 сут, Диализат центрифугируют (6000 об/мин 30 мин). В супернатанте содержится

ЛПС и нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты (НК) осаждают цетавлоном, 2 -ный водный раствор цетавлона прибавляют к су55 после 18 — 20 часового инкубирования заливают 1,0 мл стерильного вазелинового масла. Хранят при +4 С в течение 2-3 мес.

Пример 1. LUraMM* Klebsiella

20 pneumoniae находится в ампулах в лиофильно высушенном состоянии, Для производственного процесса производят оживление культуры. С этой целью ампулу вскрывают, содержимое разводят в 2.0 мл мясопептон25 ного бульона, Затем культуру инкубируют в термостате при 37 С вЂ” 3 ч, Живая культура дает диффуэно-мутящий рост.

В качестве инокулята используют смыв суточной агаровой культуры плотностью 5 — 6

30 млрд м.т./мл. Культивирование проводят при 37,1:" 0,1 С на стационарной установке с емкостью реактора 10 л в течение 4-6 ч, Скорость вращения мешалки 400 об/мин, скорость подачи воздуха 0,2 л/мин. Исполь35 зуют четыре среды: мясопептонный бульон с различными добавками (МПБ) (3 варианта) — среды с белковой основной, среду Ворфеля-Фергюсона — с углеводной основой. Объем питательных сред — 5 л, р Н 7,2 0,1.

40 Результаты культивирования штамма представлены в табл.1.

Стабильная урожайность штамма в среднем составляет 4,5 г сухой массы на 5 л бульонной культуры.

45 Бактериальную массу ресуспендируют в дистиллированной воде (t = 65 — 68 С) в

2,5-кратном объеме к весу осадка, затем приливают эквивалентный объем 90 водного раствора фенола, подогретого до 6550 68 С, Водно-фенольную эмульсию бактериальной массы выдерживают на водяной бане йри той же температуре в течение 30 мин, после чего охлаждают до 4 С и диализуют против проточной холодной во1788965

Выход ЛПС

Основа среды

Среда для культивирования

Урожайность г сухого Ф выхода вещес тва штамма, г сухой массы

Белковая основа

16,45

4,56

О, 750

3,71

0,448

12,1

Углеводная основа

Среда Ворфеля-фергюсона

2,22

0.3

13,5 пернатанту, содержащему ЛПС и КК, в соотношении t 1. Суспензию выдерживают

30-40 мин при+4 С и затем осаждают центрифугированием (6000 об/мин — 30 мин).

В полученном супернатанте содержит- 5 ся ЛПС, в осадке — НК, Лиофильно высушенный препарат ЛПС взвешивают и определяют процент выхода липополисахарида от исходного количества сухой бактериальной массы. 10

Выход целевого продукта в пересчете на 1 л питательной среды составляет 150 мг сухого вещества. Наибольший выход ЛПС отмечен на среде МПБ с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов. 15

Пример 2. В полученных сериях ЛПС (см, пример 1) определяют общее содержание липидов сульфованилиновым методом и углеводов феноловым методом, Результаты представлены в табл,2. 20

Как видно из данных табл.2 количественное соотношение общих липидов и углеводов в 1 г сухого вещества целевого продукта различных серий стабильно. Это соотношение находится в пределах 1:0,02- 25

1:0,04., Пример 3. Отбирают серию ЛПС. полученную из биомассы бактерий, накопленной на мясопептонном бульоне с 25% глюкозы и набором микроэлементов. Ото- 30 бранным препаратом ЛПС иммунизируют

Мясопептонный бульон 5,0 л рН - 7,2+ О,1

Мясопептониый бульон с 0,25

ГЛЮКОЗЫ с комплексом микроэлементов

МПБ с добавками:

КН1РО, - 0,02ь, Na

NgSO> - 0,021,, К $0„- 0,024

10! C1 - О, 08.ь CaC1 — О, 013

FeSO - 0,01, МпЯО,, - 0,23

CuSO> 0,04 » NaC1 - 0,5Ф

ЭДТА-Na — 0,08ь

NaC1 - 0,23, К SO> — 0,1 Ф

HgSO) 7H О - 0,025Ф сахароэа - 2ь дрожжевой экстракт - 0,2Ф сухой лабораторных животных (кроликов породы

Шиншилла, белых крыс) с полным адъювактом Фрейнда. Затем определяют титр антител к ЛПС по Ухтерлони.

Результаты представлены в табл.3.

Как свидетельствуют данные в табл.3, отобранная серия ЛПС обладает стабильными антигенными свойствами с колебаниями титров антител в пределах не ниже 1:16.

Пример 4. Проводят контрольные серии культивирования штамма на мясопептонном бульоне с 0,25% глюкозы и набором микроэлементов, Результаты представлены в табл.4.

Как следует из данных, представленных в табл.4, проведенные исследования в 1987 . г. и в 1988 r. позволяют сделать вывод о том, что штамм К.pneumoniae ¹ 211 при культивировании на мясопептонном бульоне с

0,25% глюкозы и набором микроэлементов характеризуется стабильным выходом биомассы, при этом образующийся ЛПС обладает стабильными биологическими свойствами. Таким образом, полученный штамм может быть эффективно использован в производственном процессе для получения ЛПС.

Формула изобретения

Штамм бактерий Klebslella pneumonlae

ГИСК ¹ 211, используемый для получения липополисахарида.

Таблица1

5,42 0,562 10,4

1788965

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Составитель М.Серова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С,Пекарь

Редактор

Заказ 82 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, )К-35, Раушская наб„4/5

Проиэводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101