Способ получения 2-кето-l-гулоновой кислоты
Изобретение относится к способам ферментативного получения 2-кето-1 -гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе L-аскорбиновой кислоты. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Способ получения 2-кето-Ыулоновой кислоты включает культивирование микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с L-сорбозой, при этом на стадии ферментации в питательную среду вносят редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию L - сорбозы 2-40%. рН среды 5-9 и температуру 25-35°С, а культивирование осуществляют в течение 10-120 ч. 7 табл. (Л С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4355956/13 (22) 17.06,88 (46) 15.01,93, Бюл. М 2 (31) 154100/87 (32) 19.06.87 (33) JP (71) Такеда Кемикал Индастриз, Лтд(ЗР) (72) Икуо Ногами, Такэмаса Ямагути, Масахиде Ока и Хидео Сирафудзи (JP) (56) Selene, 230, I44, 1985.
Европейский патент N. 221707, кл. С 12
Р 7/60, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧ ЕНИЯ 2-КЕТО-L-ГУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ
Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения 2-ке. то- -гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе L-аскорбиновой кислоты.
Известен способ получения 2-кето-L-гулоновой кислоты из D-глюкозы с использованием единичного бактериального штамма, полученного введением гена редуктазы 2,5-дикето-D-гликоновой кислоты микроорганизма рода Corynebacterium в микроорганизм рода Erwinia применением методов генной инженерии. Однако этот способ неприемлем для использования в промышленности с точки зрения количеств образующейся 2-кето-L-гулоновой кислоты, Наиболее близким техническим решением является способ получения 2-кето- = гулоновой кислоты путем культивирования рода Pseudoglvconobacter в питательной среде с -сорбоэой, „„SU „„1788967 АЗ (57) Изобретение относится к способам ферментативного получения 2-кето-1=гулоновой кислоты, применяемой в качестве промежуточного соединения в синтезе )=аскорбиновой кислоты. Цель изобретения повышение выхода целевого продукта. Способ получения 2-кето-1=гулоновой кислоты включает культивирование микроорганизмов рода Pseudogluconobacter в питательной среде с 1:сорбоэой, при этом на стадии ферментации в питательную среду вносят редкоземельный элемент в количестве
0,000001-0,1 мас.,(„при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию L — сорбозы 2-40, рН среды 5-9 и температуру 25-35 С, а культивирование осуществляют в течение 10 — 120 ч, 7 табл.
Цел ь изобретения .— повь1 шение выхода целевого продукта.
Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, включает, например, следующие штаммы, описанные в опубликованной заявке на Европейский патент %
221707:
Beudogluconobacter Saccharoketogenes
К591:FERM BP-1130 JFO 14464.
Р s e u d î g I u с о п о Ь а с t e r
Saccharoketogenes 12-5:FERM BP-1129, J FO 14465P scud îg Iu ñîïî Ьасter
Saccharoketogenes ТН 14-86:FERM В Р-1.128
14466, P s e u d o g I u с о п о Ь а с t e r
Saccharoketogenes 12-15, FERM BP-1132, JFO 14482, P scud og Iu ñîïî Ьасter
Saccharoketogenes 12-4:FERM BP-1131, JFO
14483, 1788967
25
35
P seudîgIuсoпоЬасter
Saccharoketogenes 12-3: РЕЕМ ВР-1133, JFO 14484, В последующем такие бактерии рада
Pseudogtuconobacter Saccharoketogenes могут называться бактериями окисления, Используемые в настоящем изобретении редкоземельные элементы включают, например: скандий (Sc), иттрий (Y), лантан ((а), церий (Се), празеодий (Pr), неодий (Nd), . самарий (Sm), европий (Eu), гадолиний (Gd), тербий (Tb). диспрозий (0y), гольмий (НЬ), эрбий (Er), тулий (Tm), иттербий (Yb), лютеций (Lu)..
Эти редкоземельные элементы могут быть введены в виде металлического поp0lllKQ или ила. Или же эти элементы могут . быть использованы в виде их соединений, таких как их хлориды, карбонаты, сульфаты, нитраты, оксиды и оксалаты. Элементы могут быть использованы по отдельности или . сочетанием одного или более редкоземельного элемента, например, одновременно могут быть использованы карбонат церия с хлоридом лантана. Кроме того, может быть использован cblpoA продукт, полученный в ходе выделений и очистки соответству ощих элементов, .
Количество редкоземельного элемента, вводимого в культурную среду, выбира,ог и такбм интервале концентраций, которые не ингибируют рост используемого микроорга
" низма, Как правило, эффективное количество находится в интервале от 0,000001 до 0,1, предпочтительно от 0,0001 до 0,05% (мас. /об.).
Что касается способа введения элемента в культуральную среду, то элемент r oæåò быть введен в культурную среду предварительно или же может подаваться периодически илй йепрерывно в ходе кул>ьтйвирования, . В предлагаемом способе при добавле нйи к культуральной среде исходного продукта (L-сорбозы) все количество его может быть добавлено к культурной среде ri начале культивирования, или >ке L-сорбоза может . быть добавлена несколькими порциями, или непрерывйо к жидкой культуре, Концентрация 1=сорбозы в культуральной среде может составлять 2- 40% (мас,/об.), предпочти"тельно5 30% (мас./об.) впересчете накультурную среду.
В культуральной среде, используемой для культйвйрования вышеуказанной бактерии окисления, источниками питания, усва иваемыми бактериальными штаммами, являютсй источники углерода, источники азота, неорганические соли, органические, соли и следовые питательные вещества.
В качестве источника углерода может быть использована L-сорбоза как таковая, Кроме того, в качестве дополнительного источника углерода могут быть использованы, например: глюкоза, фруктоза, глицерин, сахароза, лактоза, мальтоза, мелассы и т.п.
Источники азота включают, например: различные аммониевые соли (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония), содержащие азот неорганические или органические соединения, такие как; замоченный кукурузный экстракт (далее сокращенно обозначаемый как ЗКЭ), пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевая мука мука из хлопковых семян, мочевина и т.п
В качестве неорганических солей в дополнение к вышеперечисленным солям редкоземельных элементов могут быть использованы соли калич, натрия, кальция, магния, железа, марганца, кобальта, цинка, меди и фосфорной кислоты
B качестве следовых питательных веществ нельзя не указать на такие добавляемые вещества, являющиеся сущестренныл1 фактором роста вышеуказанных бактерий, как СоА, пантогеновая кислота, биотин, тиамин и рибофлавин, Кроме того, может быть добавлен флавиновый манонуклеотид (далее сокращенно обозйачаемый ФМН), проявляющий промотирующее действие на рост и-образование 2-кето-1 -гулоновой кислоты, другие витамины, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, тиосульфат натрия и т.п, в виде отдельных соединений или содер>кащих l1x природных продуктов.
Эти компоненты культуральной среды могут быть предварительно добавлены в культуральную среду одной порцией, Или же часть этих компонентов или все их количестно может быть добавлено в жидкую культуру периодически или непрерывно, В качестве способа культивирования может быть использована стационарная культура, встряхиваемая культура или перемешиваемая культура и т.п. Однако для массового производства рекомендуется так называемая погруженная культура.
Разумеется; условия состояния культуры меняются в зависимости от конкретного вида штамма, конкретного вида штамма, конкретного состава культуральной среды и т.п, Короче, условия могут быть выбраны для каждого конкретного случая такими, при которых целевой продукт может быть получен с наибольшей эффективностью, Например, рекомендуют температуру культивирования в 25-35 С и значение рН культуральной среды желательно в 5-9, 1788967
При культивировании в рекомендованных условиях в течение 10 — 120 ч 2-кето-L-гулоновая кислота накапливается в самой высокой концентрации, В этом случае, поскольку по мере накопления целевого продукта. значение рН падает, для поддержания оптимального уровня рН, требуемого для микробиологического получения 2-кето-L-гулоновой кислоты, могут быть добавлены соответствующие основные соединения, например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, Или же для поддержания оптимального уровня рН к культуральной среде может быть добавлена соответствующая буферная система.
В настоящем изобретении при культивировании . микроорганизма рода
Pseudogtuconobacter в жидкой среде, содержащей 1=сорбозу в присутствии редкоземельного элемента с образованием и накоплением 2-кето-L-гулоновой кислоты в культуральной среде, количество аккумулируемой 2-кето-L-гулоновой кислоты может быть значительно увеличено путем смешивания вышеуказанной бактерии окисления с другим микроорганизмом по сравнению с использованием одной только бактерии окисления, то есть микроорганизма, принадлежащего к роду Pseudogluconobacter.
Перемешиваемые бактерии включают, например, бактерии. принадлежащие к родам Bacillus, Pseudomonas, Proteus, gitrobacter, Еntегоbacter, Erwinia, Хапйотопаз, Flavobacterium, Mickococcus, Еscherichia и т.п.
Более конкретно используют слег.,ющие бактерии:
Bacillus cereus JFO 3131, Bacillus cereus>F0 12201
Bacillus Licheniformis J FO 12108, Bacillus megaterum JFO 12090, Bacillus pumilus JF0 3022, Bacillus amyloliquefaciens JFO 13719, Bacillus subtilis JFO 3967
Pseudomonas matlophilia JFO 12056
Proteus incostans JFO 12692
Proteus inconstans JFO 12930, Citrobacter freundii JFO 13544, Еntегоbacter cloacae JFO 3320.
Erwinia herbicoIa JFO 12686
Xanthomonas pisi JFO 13556
Flavobacterium meningosepticum J FO
12535, Micrococcus variaus JFO 3765, Echerichia coli J FO 3366.
Жидкая культура. полученная культивированием любой из перечисленных бактерий в соответствующей среде при 20-40 С в течение 1-4 дней, может быть использована в качестве затравочной культуры подме5
55 шиваемого микроорганизма. Как правило, рекомендуют применять для засева количество, составляющее 1/10-1/1000 от бактерии окисления (Pseudogluconobacter). При проведении смешанного культивирования. путем подмешивания к бактерии окисления подмешиваемого микроорганизма в таком количестве, которое промотирует рост,бактерии окисления, в результате происходит окисление 1=сорбозы в 2-кето-L-гулоновую кислоту при более высокой концентрации сорбозы и в течение более короткого периода времени по сравнению с использованием одной только бактерии окисления, Бактерия, используемая в качестве подмешиваемого микроорганизма, желательно, не обладает или обладает слабой способностью ассимилировать L-сорбозу, являющуюся исходным продуктом настоящего изобретения, или 2-кето- -гулоновую кислоту, являющуюся целевым соединением настоящего изобретения. Другие условия культивирования такие же, что и в случае применения одной только бактерии окисления.
Кроме того, могут быть эффективно использованы и стерилизованные культуры определенных видов бактерий, отличных от вышеуказанных бактерий окисления, в качестве компонента культуральной среды. Используемые бактерии включают, например, бактерии рода Bacillus. Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia u Erwinia. Более конкретно используют следующие бактерии:
Bacillus cereus J FO 3131
Bacillus subtilis JFO 3023, Bacillus pumllus JFO 12089
Bacillus megaterium JF0 12108
Bacillus amyloliquefaciens JFO 3022
Pseudomonas frifolii JFO 12056
Citrobacter freundii JFO12681
Escherichia соИ JFO 3546
Erwinia Ьегbicola JFO 12686
Эти бактерии могут быть культивированы в средах, в которых происходит их рост при 20 — 40 С в течение 2 — 4 дней. Полученная культура может быть стерилизована и добавлена к культуральной среде бактерии окисления настоящего изобретения в количестве 0,5 — 5 об. / с целью промотировать рост бактерии окисления, Образовавшаяся и аккумулированная в результате 2-кето-L-гулоновая кислота может быть выделена и очищена известными способами, основанными на использовании ее свойств.
2-кето-L-гулоновая кислота может быть выделена в виде свободной кислоты или же она может быть выделена, например, в виде
1788967. натриевой, калиевой, кальциевой или аммониевой соли.
В качестве способа выделения может быть использован, например, способ, в котором бактериальные клетки удаляют фильтрованием или центрифугированием по мере необходимости, после чего раствор концентрируют с добавлением активиро ванного угля или без добавления его и отделением образовавшихся кристаллов фильтрованием и их перекристаллизацией с получением целевого соединения, может быть использована экстракция растворителем, хроматография, высаливание и т.п. Эти способы могут быть использованы по отдельности, в сочетании или повтором.
При получении 2-кето-1=гулоновой кислоты в свободном состоянии она может быть превращена. например, в натриевую, калиевую, кальциевую или аммониевую соль. а при получении кислоты в виде соли, та может быть превращена соответствующим способом в свободную кислоту или другую соль, Образующуюся в культуральной среде
2-кето-L-гулоновую кислоту определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях.
Условия проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии:
ВЭЖХ вЂ” система 655А.
Колонка — SCH 101Н (сульфонированный полистирольный гель), 300 х 7,9 мм.
Скорость потока 0,8 млlмин деление—
50 кг/см, . Подвижная фаза — разбавленная серная кислота (рН 2,1).
Детектирование — УФ (214 нм) и дифференциальный рефрактометр, Время удерживания — 7,2 мин для 2-кето-1=гулоновой кислоты и 8,33 мин для. 1сорбозы.
Нижеследующие примеры дополнительно в подробностях иллюстрируют настоящее изобретение, но без ограничения
его объема. Все приведенные для культуральных сред процентные отношения даны в мас./об., если нет особых указаний. В ыхода для культур в примерах соответствуют мольному выходу 2-кето-L-гулоновой кислоты в пересчете на используемую L-сорбозу, Пример 1, Среду затравочной культуры (20 мл), содержащую 2% D-глюкозы, 1% пептона, 1% сухих дрожжей и 2% СаСОз, помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 минут при 120 С в автоклаве. Колбу засевают одной петелькой штамма
Pseudogluconobacter Saccharoketogenes (J FO
14464. FERM BP-1130), выращенного в среде скошенного агара (табл.1) при 30 С в течение
3 дней и культивированного при встряхивании(200 об/мин), при 30 С в течение 2 дней.
Полученную культуру (2 мл) переносят в ту же среду, что была описана выше, и культивируют в тех же. условиях с получением второй затравочной культуры
В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% 3 КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Na2S20s .5Н20, 0,1% FeS04,7Í20,0.005% СеС!з.7Н20, 3,5%
10 щают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% йа2$0з.5НгО, 0,01% FeS04.7Н20. 0,05% Сег(СОз).8Н20, 3,5% СаСОз (Ака darna) и 9,5% 1-сорбозы (стерилизуют отдельно), и выдерживают в автоклаве 20 мин при 120 С.
Каждую из вышеуказанных вторых затравочных культур (1.25 мл) помещают в колбу Эрленмейера, содержащую ферментативную среду, и культивируют 3 дня при встряхивании и 30 С. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Полученные результаты приведены в табл.2, где указаны количества образовавшейся 2-кето-L-гулоновой кислоты (мг/мл) вместе с количествами, полученными при культивировании в среде без добавления
Се(СОз)з
Пример 3. Штамм Pseudogluconobacter
Saccharoketogenes ТН14-86 (JFO 14466, FERM ВР-1128) культивируют по методике.
СаСОз (Ака dame) и 9,5% 1 -сорбозы (стерилизуют отдельно) и выдерживают 20 мин при 120 С в автоклаве.
Полученную среду засевают вышеука15 занной второй затравочной культурой (1,25 мл) и культивируют при встряхивании и 30 С в течение 2 дней, Полученный в результате ферментативный раствор содержит 86,4 мгlмл 2-кето-1=гулоновой кислоты (выход
20 84 4%) в соответствии с анализом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ферментативный раствор, полученный в результате культивирования тем же способом, но без добавления в среду
25 хлорида цезия, содержит 51 мг/мл 2-кето-1гулоновой кислоты (выход 49,8%), П р им е р 2. Штаммы Pseudoluconobacter
Saccharol BP-1131), 12-5 (JFO 14465, FERM BP-1129), 30 12 — 15(З F0-14482, FERM B P-1132) и 22 — 3 (J FO 14484, FERM BP-1133) культивируют способом примера 1 с получением вторых затравочных культур. В колбу Эрленмейера на 200 мл поме1788967 10 описанной в примере 1, с получением второй затравочной культуры, В колбу Эрленмейера на 200 мл помещают ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% 3КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Na2.Sz03,5Н20, 0,1% РеЯ04, 5% СаСОз (Ака dama) и 10,5% L-сорбозы (стерилизована отдельно), и выдерживают 20 минут в автоклаве при 120 С. Вышеуказанную вторую эатравочную культуру (1,25 мл) переносят в колбу Эрленмейера с ферментативной средой и культивируют 2 дня при встряхивании и 30 С. В этих условиях культивирование встряхиваемой культуры проводят путем добавления 0,01% хлорида иттрия, лантана, церия, неодия, самария, европия, гадолиния, тербия, диспрозия, гольмия, эрбия или иттербия, или оксида празеодия или 0,05% оксида скандия при 30 С в течение 2 дней. Полученный в результате ферментативный раствор анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Количество образовавшейся 2-кето-1гулоновой кислоты в культуральной среде (мг/мл) приведено в табл.3. . Пример 4. По методике примера 1 культивируют штамм Pseudogluconobacter Saccharoketogenes TH14-86 использованием той же ферментативной среды, что и в примере 1, в которую добавле11 оксид, хлорид, карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид. сульфат или карбонат, нитрат или оксалат лантана, или оксид, хлорид, сульфат или карбонат церия в количествах, указанных в табл.,4. В данном случае время культивирования 30 ч..Количество образовавшейся в ферментативном растворе 2-кето-L-гулоновой кислоты (мг/мл) определяют с помощью высокоэффективной >кидкостной хроматографии. Полученные результаты приведены в табл.4, где также даны результаты для культур без добавки редкоземельного элемента. Пример 5. Микробиальные клетки Bacillus megaterium (JF0 12108), выраще11ные в среде скошенного arapa (состав в табл.1) при 28 С в течение 2 дней, суспендируют в 10 мл стерилизованной воды и все количество переносят в колбу Сакагучи, содержащую затравочную культуру примера 1 (500 мл), и культивируют при возвратно-поступательном встряхивании (85 встряхиваний в мин) и 28 С в течение 2 дней с получением затравочной культуры ВасИЬв megaterium. Среду (30 литров, рН 7), содержащую 4% сахарозы, 0,65% К2НР04. 0,05% сульфата аммония, 4% муки хлопковых семян, 0,05% NaCI, 0,05% MgSO<.7H20 и 0,05% кальциевой соли пантогеновой кис35 55 мл с эатравочной культурой примера 2 (20 мл) высевают одну петельку микробиальных клеток Bacillus megaterium JF012108, выращенных в течение 2 дней при 28 С на среде скошенного агара, и подвергают культивированию при встряхивании и 28 С в течение 2 дней с получением культуры подмешиваемого микроорганизма. L-сорбозу (72 г) растворяют в воде до объема в 300 мл, после чего в воде растворяют или суспендирую ЗКЭ (60 г), сухие дрожжи (6 г), сульфат аммония (9 г), FezS0q.7Н20 (3 г), ФМН (3 мг), тиамин (3 мг), биотин (1,5 t1r) и актокол (0,5 г) до общего объема в 800 мл. Отдельно суспендируют в воде до объема 1000 мл СаСОз (240 r, Acadama) и Се2(СОз)з.8Н20 (150 мг). После выдерживания каждой из сред 20 минут в автоклаве при 120 С их загружают в ферментатор на 5 литров, который предварительно стерилизуют Вторую затравочную культуру вышеуказанного штамма ТН14-86 (300 мл) и затравочную культуру подмешиваел1ого микроорганизма (4 мл) высевают в ферментатор и начинают культивирование в следулоты, загружают в ферментатор на 50 литров и выдерживают в автоклаве 20 мин при 125 С. Ферментатор засеивают затравочной культурой Bacillus megaterlum (1 л) и 5 культивируют 4 дня в следующих условиях: перемешивание 200 об/мин, аэрация — 24 л/мин, внутреннее давление 1 кг/см, температура 28 C. Полученну1о культуру выдерживают в автоклаве 20 мин при 120 С, 10 хранят в холодном месте и в качестве одного из компонентов ферментативной среды используют стерилизованную культуру Вас!Низ megaterium (далее называемой мега-бульоном). 15 Затравочную культуру примера 1(20 мл) помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С. Одной петелькой микробиальных клеток Pseudogluconobacter TH14-86, выращенных 20 на среде скошенного агара (состав табл.1} при 28 С в течение 4 дней, засевают содержимое вышеуказанной колбы и культивируют 2 дня при 30 С и встряхивании. Полученную культуру (20 мл) помещают в 25 колбу Эрленмейера на 1 л, содержащую культуральную среду (200 мл), в которой содержится 2% D-глюкозы, 3% (об,/об.) мегабульона, 1% ЗКЭ, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% пептона, 0,3% сульфата ам30 мония 112% CaC03 (Acadama), и культивируют 2 дня при 30 С и встряхивании с получением второй затравочной культуры штамма ТН14-86, Отдельно в колбу Эрленмейера на 200 1788967 ющих условиях: температура 30 С, аэрация 2,4 л/мин, скорость перемешиванил 800 об./мин. Отдельно растворяют в воде до объема 900 мл 1 -сорбозу (528 r) и LaC!s.7Hz0 (150 мг). Растворяют в воде до общего объема в 100 мл сульфата аммония (6 г) и FeS04.7Н20 (3 г). Полученные растворы выдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С, после чего смешивают в асептических условиях. На 6-й час после начала культивирования эту смесь непрерывно добавляют в ферментатор и добавление заканчивают за 24 ч. После завершения добавления смеси культивирование продолжают еще 8 ч (общее время культивирования 38 ч), За это времл усвоение L-сорбозы в культуре полностью завершается и в результате получают 3,16 литра ферментативного раствора, содержащего 176 мг/мл 2-кето-L-гулоновой кислоты (выход 86%). Отдельно в вышеописанных условиях проводят культивирование, однако ни Се2(СОз)з,8Н20, ни аС!з.7Н20 не добавляют. B этом случае при продолжении культивирования еще 22 ч после добавления смеси происходит полное усвоение L-сорбозы (полное время культивирования 52 ч), В полученном в результате ферментативном растворе (3,09 л) содержится 161,4 мг/мл 2-кето-L-гулоновой кислоты (выход 77,1%). Пример 6, К перемешиваемому ферментативному раствору примера 5, содержащему 176 мг/мл 2-кето-1-гулоновой кислоты (1 л). добавляют примерно 260 мл 6N серной кислоты и образовавшиеся нерастворимые вещества, такие как сульфаты и клетки, удаляют центрифугированием. Полученный раствор (1150 мл) пропускают через колонку, заполненную катионообменной смолой 1R 120 В (H -тип) (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Элюат и промывные растворы объединлют и пропускают через колонку, заполненную углем для хроматографии (200 мл), после чего колонку промывают дистиллированной водой (150 мл). Объединенный раствор элюата и промывных вод (1450 мл) концентрируют до 250 мл при пониженном давлении и примерно при 50ОС, Концентрат оставляют на сутки при 5ОС с отделением 2-кето-1=гулоновой кислоты, Образовавшиеся кристаллы отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством охлажденной воды, 50%-ным холодным метанолом и холодным метанолом, Полученное вещество сушат над пятиокисью.фосфора при пониженном давлении с получением 156 г (выход 81,1%) бесцветных кристаллов моногидрата 2-кето-L-гулоновой кислоты. Температура плавления 171 С (с разложением). Элементный анализ для CGHioOT.H20 (%) Вычислено: С 33,97; Н 5,62 Найдено: С 33.91, Н 5,65 Удельное вращение — (а)р — 48" (с=1,0, Н20) Пример 7, Одной петелькой микроби10 альных клеток штамма Pseudogiuconobacter Saccharoketogenes ТН14-86 засевают колбу Эрленмейера на 200 мл со средой (20 мл), содержащей 2% О-глюкозы, 3 об.% мегабульона, 1% ЗКЭ. 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% пептона, 0,3О/ сульфата аммония и 2% СаСОз и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30 С и встряхивании. Полученную культуру (2 мл) переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл с той же средой (20 мл) и культивирование проводят тем же способом с получением второй затравочной культуры бактерии окисления, Ферментативную среду (25 мл), содержащую 2% 3КЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% gaz$20g 5Н20, 0,1% FeS04.7Н20. 5, СаСОз и 12,5% =сорбозы (стерилизуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и выдерживают 20 мин в автоклаве при 120 С. Отдельно стерилизованный СеС4,7НzO в количестве, указанном в табл.5, добавляют в колбу Эрленмейера, содержащую вышеприведенную ферментативную среду, и содержимое колбы засевают вышеописанной второй затравочной культурой (1,25 мл) и затравочной культурой подмешиваемого микроорганизма, приготовленного в примере 5 (0,1 мл). Количества образовавшейся при культивировании встряхиванием ферментативного раствора (30 C. 3 дня), 2-кето- -гулоновой кислоты приведены s табл,5. Пример 8, По методике примера 7 культивированием штамма ТН14-86 бактерии окисления получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (25 мл), содержащую2% ЗКЭ,0,5% сухихдрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% Ма2$20з.5НгО, 0,1% Ее$04.7НрО, 2.5% СаСОз и 7,5% L-сорбозы (стерилиэуют отдельно), помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Отдельно стерилизованный СеС!з.7Hz0 в количестве, укаэанном . в табл.6, помещают в колбу Э рленмейера в указанную ферментативную среду, которую засевают выше приведенной второй затравочной (1,25 мл), Количества 2-кето- -гулоновой кислоты (мг/Mn) в ферментативном растворе, пол13 1788967 Таблица 1 Таблица 2 Цифры в скобках означают усредненный выход. ученном культивированием встряхиванием при 30 С в течение 3 дней, приведены в табл.6, Пример 9. По методике примера 7 культивированием штамма ТН14-86 бактерии окисления получают вторую затравочную культуру. Ферментативную среду (20 мл), содержащую 2% ЗКЭ, 0,5% сухих дрожжей, 0,3% сульфата аммония, 0,05% NazS2Oa.5Í2O, 0,1% FeSO4.7ÍãO, 5% СаСОз, 12% 1.- сорбозы, а такжедобавки, указанные в табл,7, в соответствующих количествах помещают в колбу Эрленмейера на 200 мл и стерилизуют. Содержимое кол. бы засевают вышеуказанной второй затравочной культурой (1 мл) и подвергают культивированию в течение 2 дней при 30 С и встряхивании. Количество образующейся 2-кето-L-гулоновой кислоты (мгlмл) в полученной культуре определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные результаты приведены в табл.7, где также указаны результаты, пол5 ученные при культивировании без добавок. Формула изобретения Способ получения 2-кето-1=гулоновой кислоты путем культивирования микроорга- ° 10 ниэмов рода Pseudog1uconobacter в питательной среде с -сорбоэой, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, на стадии ферментации в питательную среду вносят 15 редкоземельный элемент в количестве 0,000001-0,1 мас.%, при этом в процессе культивирования поддерживают концентрацию L-сорбоэы 2-40%, рН среды от 5 до 9 и температуру 25-35 С. а культивирование 20 осуществляют в течение 10 — 120 ч, 1788967 ифры в скобках означают усредненный выход, ифры в скобках означают усредненный выход. Таблица 3 Таблица 4 1788967 17 Таблица 5 ифры в скобках означают усредненный выход. Таблица 6 ифры в скобках показывают усредненный выход, Таблица 7 Составитель Н.Афанасьева Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор 3.Лончакова Редактор Производственно-издательский комбинат"Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 82 Тираж,-Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5
