Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях

 

Использование: спор об отцовстве, судебная медицина, диагностика и лечение генетических расстройств, а также предрасположенностей. Сущность изобретения: способ заключается в том, что осуществляют гибридизационный анализ геномной ДНК путем скрининга библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с последовательностью 33,6 или 33,15 и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей или части выставки. 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 Q 1/68

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) рр ЯЩЩ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ f,ц,т ..щ"-ииив .й

У Дио wÃ(À

«., у ф«С««. %« .««М««

К ПАТЕНТУ (57) Использование: спор об отцовстве, судебная медицина, диагностика и лечение генетических расстройств, а также предрасположенностей. Сущность изобретения: способ заключается в том, что осуществляют гибридизационный анализ геномной

ДНК путем скрининга библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с последовательностью 33,6 или 33,15 и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей ипи части выставки. 1 з,п. ф-пы, 4

СО

43 4

О (21) 4203449/13 (62) 4202341/13 (22) 06.10.87 (23) 18.03.87 (31) 8606719 (32) 19,03.86 (33) GB (46) 15.01.93. Бюл. М 2 (71) Империал Кемикал Индастриз ПЛС (GB) (72) Алек Джон Джеффрис (GB) (56) G B, 2166445, кп, С 12 Q 1/68, 1985, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Изобретение может быть использовано для получения полинуклеотидов и зондов, которые могут найти применение в спорах и ри установлении отцовства или в судебной медицине, ипи с целью предотвращения, диагностики и лечения гейетических расстройств или предрасположенностей.

Описаны различные ДНК-последовательности, которые могут быть использованы в качестве зондов для "полиморфизма человеческого и животного гономов.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что могут быть получены полинуклеотиды и полинуклеотидные зонды, каждый из которых является специфическим для одного единственного информативного генетического участка.

До настоящего времени было известно весьма ограниченное число гипервариабельных областей в человеческой ДНК, к ним относятся минисателлиты: 5 ген инсулина, 3-ген с-На- ZasL, ген коплагена типа!! и между генами глобина rp 2 и ф р 1, а также

„„Я „„1788970 А3 участок О 14 S 1, определенный безымянным клоном ДНК, полученным из тепомерной области длинного плеча хромосомы 14.

Это минисателлиты существенно отпйчаются друг от друга своей вариабельностью, которая заключена в одном случае только в

6 различных аллелях. обнаруженных в гипервариабельной области коллагена, а в других их число превышает 80, как, например, в случае области D 14 S 1. Общее число гипервариабельных областей в человеческом геноме пока не известно, но вероятнее всего, оно большое, В действительности, человеческий геном может содержать по крайней мере 1500 гипервариабельных, областей, Установлено, что можно клойировать

ДНК-фрагмент, идентифицированный при помощи гибридизации фрагментов геномной ДНК с полинуклеотидным зондом, способным дифференцировать ДНК при помощи сравнения с более чем одной полиморфной минисателлитной областью ил

1788970 гипервариабельным участком, например, с Detroit 55,1,: CCL 110, использованием зондов 33,6 и 33,15, кото- RPMI 6666,:,. CCL 113 рые были предложены и описаны в вйше- RPMI 7666 .... CCL 114 упомянутой заявке,", и-. получить из. него": CCRF-CEM СС(119 полинуклеотид или зонд, способный к гиб- 5 CCRF-$В СС1 120 ридизации с ДНК-фрагментом, который со- НТ-1080 СС(121 держит минисателлит, который является " HG-261 CCL 122 специфичным относительно определенной СНРЗ (M,W,) СС1 132 области или участка на геноме; вышеупомя- 0 47 (Ma Do) СС(135 нутая область или участок и представляет 10 HEL 299 СС 137 собой информативный генетический уча- LL24 CCL151 сток. В настоящем изобретенйи использо-, . XFLI, - - ; ", : " СС 153 ван информативный генетический участо)с М-1003 CCL 154 как участок, в котором можно выявить по MRC-5 СС1 171 крайней мере 3 различных аллеля s любой 15 IMR-90 СС1 186 пробе из 100 случайно выбранных индиви- . LS 174Т - - CCL 188 дов, Этот факт заключается в том, что уча- LL86(LeSa) CCL 190 сток (область) имеет аллельную вариацию 0 97А(А!Му) СС! 191 не менее 3. Существенным здесь является HLF-a СС(199 то, что проба из 100, 500 или 1000 индивидов 20 CCD-13Lu CCL 200 действительно. подбирается случаййо, "так CCD-BLu CCL 201 как обычно вполне возможно идейтифици - CCD-11lu CCL 202 ровать 100, 500 или 1000 йндивидов, кото- " CCD-14Âã CCL 203 рые имеют менее 3 аллелей в данной CCD-16Lu СС1 204 информативной генетической областй йри 25. CCD-18Lu СС1 205 помощи просеивания.достаточно большого CCD-19Lu CCL 210 количества членов общей популяции; " Приведенные выше линии клеток можЧем выше этот полиморфизм в данной но получить из АТСС, 12301 Паклаун информативной генетической области, тем Драйв, Роквилл, Мерилэнд 20852-1776, более эффективным и информативным бу- 30 США, а их список имеется в каталоге АТСС дет специфический зонд для этой области линий клеток и гибридов. Все вышеупомяпри идентификации индивида с целью уста- нутые линии клеток сданы на хранение в новления отцовства или судебной эксперти- АТСС по 1985 r, зы. (относительно применений к человеку 35 Таким образом, настоящее изобретенастоящего изобретения выражение "ин- ние использует минисателлит, который явформативный генетический участок", как ляется специфическим относительно оно здесь используется, может быть опреде - определенной области или участка в геноме, I лено как область, в которой можно разли- " имеет аллельную вариацию, равную не мечить по крайней мере 3 аллеля в ДНК, 40 нее3. Изобретение включает клонирование экстрагированной,из любых 20 линий кле- фрагмента ДНК, идентифицированного при ток из списка, йриведенного ниже. Эти лй- помощи гибридизации фрагментов геном нии клеток сданы на хранен ие в нойДНКс полинуклеотидным зондом, котоАмериканское .собрание типов кулЬтур рый способен дифференцировать ДНК по (АТСС): ...:, : .: . " 45 более чем одной полиморфной минисателЛИНИЯ . НОМЕР: литной области или гипервариабельному

КЛЕТОК, . КУЛЬТУРЫ участку; и получение из него полинуклеоВ АТСС - " тида, способного к гибридизации с фрагHela.... CCL2 " "- "" ментом" ДН К, который содержит

RPMI 2650,: CCL30 50 минисателлит, специфический относиDetroit 532 СС1 54:": " " тельно определенной области или участка

Detroit525, ...... СС 65 : " " " в геноме, и имеет аллельную вариацию, Detroit 529 CCL 66 " "" равйую не менее 3 (100)., Detroit 510 СС1 72 " Полинуклеотидный зонд содержит наWl-38 ., СС1 75 " " 55 ряду с меченой компонентой или компоненCitrullinenia .: ., CCL 76 " :- - -"""""той-марквром полинуклеотид, содержащий ЕВ-3 .-,.- CCL 85 " .""" по крайней мере три тандемных повтора

ВАЛ! СС1 83 (при пб крайней, мере 70% гомологии) поJIYOYE(P-2003):::.: CCL87 -: "": " следовательностей, которые гомологwxьf"

Wl-26 . CCL 95 " " минисателлитной области генома в такой

1788970 степени, которая позволяет осуществить гибридизацию зонда с соответствующим фрагментом ДНК, полученным при помощи расщепления пробы ДНКэндонуклеазой рестрикции.

Каждый повтор содержит ядро, которое имеет по крайней мере 70;(, гомологичность с минисателлитной ДНК из различных геномных участков, ядро имеет длину от 6 до

16 нуклеотидов, общее число нуклеотидов внутри повторяющего блока, которые не участвуют в формировании ядра, не превышает 15.

В предпочтительном варианте вышеупомянутый ДНК-фрагмент содержит минисателлит из минисателлитной области или гипервариабельного участка, который может быть обнаружен при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности, комплементарной последовательностии: (А) AGGG СТ GG А GG . (1) (в которой Т является Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности, комплементарной последовательности:

AGAGGTGGGCAGGTGG (2) (в которой Т является Т или U), Рассматривается также нуклеотидная последовательность с ДНК-фрагментом, полученным в результате расщепления геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, причем вышеупомянутый фрагмент ДН К содержит минисателлит из вышеупомянутой минисателлитной области или гипервариабельного участка. отличающийся тем, что:

1) вышеупомянутая область или участок имеют аллельную вариацию (как она была определена выше), равную по крайней мере

3 (100), и

2) вышеупомянутая область или участок могут быть обнаружены при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности (включая также комплементарн ые последовательности): (А) А G G G G СТ G G А G G (1) (где Т обозначает Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности (включая комплементарные последовательности);

AGAGGTGGGCAGGTGG (2),где

Т вЂ” Т или U.

В изобретении используются следующие термины.

Гипервариабельность.

Область человеческой, животной или растительной ДНК называется гипервариа5

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGG CCAGG

GAGPGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

55 GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6

GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGÀGGÒGÒÒGG

50 бельной, если она может находиться в многочисленных формах, например, в том, что касается длины или порядка.

Минисателлит, Область человеческой, животной или растительной ДНК, которая составлена из тандемных повторов короткой ДНК-последовательности. Все повторяющиеся блоки не обязательно должны обладать совершенной идентичностью.

Полиморфизм.

Если ген или любой фрагмент ДНК обладает изменчивостью от одного индивида к другому или между данными спаренными хромосомами индивидов, то говорят, что он полиморфный, Тандемная последовательность.

Это полинуклеотидная последовательность, которая точно или с некоторыми изменениями повторена в ряд. В общем случае, последовательность называется состоящей из тандемных повторов, если такой повтор содержится по крайней мере три раза.

$ гомологичности, При сравнении двух повторяющихся или тандемных повторяющихся последовательностей А и B гомологичность в процентах выражается числом пар оснований в А, которое меньше числа вставок, замещений или удалений пар оснований в В, которое необходимо было бы осуществить для того. чтобы получить А, выраженное в процентах.

Таким образом, гомологичность в процентах между двумя последовательностями

ATGC u AGC равна 75 .

Согласованное ядро (последовательность).

Последовательность, которая может быть идентифицирована как ближайшая пара среди нескольких повторяющихся последовательностей; в общей случае среди повторяющихся блоков двух или более различных минисателлитов.

Полинуклеотиды, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть идентифицированы при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего любую одну последовательность, выбранную из следующих последовательностей:

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC8

TGTGTGTAATGGGTATAGG CAGGG ССССОИ

AAGGGGGTCTGGYX 9

1788970 (в которых У яяввлляяееттсся я СС, Т или U, X является

G или С, R является А или G, а Т является Т или U) или их тандемных повторов," или 6оследовательностей, комплементарных к ним, В общем случае, полинуклеотиды и зоны специфичны относительно определенного участка при- очень строгих условиях гибридизации. В этом отношении выражение "специфичный" относительно определенного участка используется в- связи с полинуклеотидом или зондом с тем, чтобы показать, что полинуклеотид или зонд можно использовать при условиях гибридиза ции, которые" гарантируют, что полинуклеотид или зонд гибридизируется только с одним единственным специфичным участком.

Однако, необходимо иметь в виду, что зонды, специфичные относительно определенного участка, если их используют при менее строгих условиях гибридизации, способны дифференцировать ДНК при помощи сравнения с более чем одной полиморфной минисателлитной областью или гипервариабельным участком и, таким образом, их можно использовать для идентификации других информативных генетических участков. ::. Повторы; которые не являются точными, именуются в соответствующих местах как несовершенные повторы, Такие повторы, тем не:менее, могут быть "узнаны" как точные повторы, В общем случае, это будет означать,что ймеется в среднем по крайней мере 70% гомологичность между всеми повторяющимися блоками. В предпочтительном варианте существует rio крайней мере

80%, в более предпочтительном варианте по крайней мере 85%, особенно предпочтительном — 90% гомолотичнбсть между всеми повторяющимися блоками, Необходимо иметь в виду, однако, что неуклеотидная последовательность или "повторяющийся блок" не обязательно повторяется целиком, если это необходимо, Число повторяющихся блоков в предпочтительном варианте должно быть не ме- нее 5, в еще более предпочтйтельном варианте не менее 10, В общем случае, изменяется в области от 10 до 40, но, в прин- ципе, может быть" произволь н ым чйсл ом," даже в области 1-10000.

В предпочтительном варианте полинуклеотиды и полйнуклеотидные зонды содержат любую последовательность, выбранную из формул с 3 по 9, приведенных вы ше.

Изобретение позволяет идентифицировать информатйвную генетическую область в человеческом гвноме M йри этом" позволяет получить зонды, специфические относительно ой ределенн ых областей, причем каждый зонд, специфичный, относительно определенной информативной геномной

5 области. Была осуществлена, в частности, идентификация шести различных информа тивных генетических участков, причем эти участки обладают очень высокой гетерозиготйбСтью в испытываемой популяции (не

10 мейее 90%) и они находятся среди наиболее пблиморфных йз изолйровайных до сих пор.

Заявитель получил специфйческий относительно определенной области зонд для каждой области, эти зонды были обозначе15 ны рЛ9Х,ЛМЯ1,AMSS,ЛМЯ31,ЛMS32и

Л М3 4> (они"соответствуют определенным выше зондам), Степень индивидуальности генотипов, определенных при помощи, специфичности

20 отно с и т ел ьно области зондов, может быть оценена из гетерозиготности (Н) в каждой области, Средняя аллельная частота q в некотором участке задается при помощи (1-Н). а вероятность того, что два случайно вы25 бранйых индивиуа включают один и тот же генотип; равна q (2 — q). Эта вероятность необоснованного связывания двух индивидов изменяется от 0,02 для Л MS 8 до 0,0002 для

Л MS 31, причем эта оценка является консер30 вативной в том смысле, что неоднородность по q снижает эти вероятности, Вероятность необоснованного связывания для всех шестй мйнисателлитных зондов равна прибли — 16 зительно 10, что сравнимо с

35 вероятностью того, что два случайно выбранных фингепринта ДНК, обнару>кенных при помощи одного зонда, специфичного относительно нескольких областей, идентичны (см. патент Великобритании ¹

40 2166445). Напротив, вероятность того, что две области идентичны для данного гипервариабельного участка, задается формулой 1/4 (1 + q) . Вероятность идентичности для всех шести зондов равна 0,0004 по:

45 сравнению с примерно 10-7 для фингепринта ДНК с использованием одного зонда, специфичного относительно, нескольких"областей.

Эти структуры обеспечивают высокую

50 степень индивидуальной специфичности, "хотя она не столь высока по сравнейию с той, которую можно по11учить при использовании зондов относительно нескольких областей или при использовании последо55. BBTBRbKQA гибридизации с зондами, специфичными относительно определенной области (см, выше). Оба типа зондов, объединенные зонды или отдельные зонды, специфичные относительно определенной с 9 Х 1

1788970

10 области, могут оказаться особенно эффективными при изучении клеточных химер.

В приводимых ниже примерах используемые зонды 33,6 и 33,15 описаны в патентной публикации Великобрита- 5 н ии М 2166445. Они содержат повторя ющуюся последовательность: (А) А G G G СТ G G А G G u

A G A G G T G G G C A G G T G G соответственно. 10

Пример 1. ДНК выделяют из белых кровяных клеток и из трансформированной вирусом Энстейна-Барра линии клеток лимфобластов. Осуществляют переваривание рестриктазами. Фрагменты двунитевой 15

ДНК зондов изолируют при помощи электрофореза на бумаге ДЕ81, а затем снабжают P-меткой при помощи любой олигонуклеотидной затравки. Однонитевой минисателлитный зонд 33,15 получают в со- 20 ответствии с описанием, данным Джеффрисом и др. (1985), Nature, 314, стр. 67-73.

Клонирующий гипервариабельный фрагмент. 25

600 мкг ДНК линии клеток лимфобластов, обработаной ферментом Sau ЗА, фракционируют при помощи электрофореза в

0,5 -ном агарозном геле и фракции соответствующих размеров собирают с исполь- 30 зованием электроэлюирования на мембрану для диализа, После двух циклов и репаративного гелевого электрофореза фрагмент g подвергают 1000-кратной очистке (выход 150 нг ДНК) 20 нг этой очищенной 35 фракции подвергают лигированию с 60 нг

ДНК АЬ 47.1, выделенной после расщепления ферментом Bam Hl, упаковывают в лабораторных условиях и помещают на пластинки с культурой Е.coli Wh 95/803, sup 40

Е, sup F, 1.sd Rg, hsd М, ton А, trpR, metP лизогенные для Р2 с тем, чтобы отобрать рекомбинанты; Полученную в результате библиотеку рекомбинатного фага 1500 просеивают при помощи гибридизации на пла- 45 стинке с минисателлитным зондом 33,15.

Четыре положительные пластинки снова распределяют по пластинкам и отбирают на культуре Е.coli ЕД8910(803, sup Е, sup F, гес

В21, res С22, RSdS) и ДНК рекомбинантного 50 фага выделяют. Sau ЗА-вставку рекомбинантного фага g3 субклонируют по сайту Bam

Hl в плазмиду pU C13 и культивируют в res

А-производной культуре Е.coll J М83, J М83, Л (res А-sr IP) 306:Тп10. 55

Анализ ДН К-последовательности, ДНК- ping 3 обрабатывают ультразвуком, отбирают по размеру и клонируют в сайт Sma 1 ДНК М13 mp 19, Чтобы определить ДНК-последовательности области из тандемных повторов в Pg 3, анализируют последовательность у 12 случайных клонов при помощи процедуры анализа концов

ДНК. 8 из этих клонов получают из минисателлитной области тандемных повторов в

ply 3 и используют для определения согласованной повторяющейся последовател ьности. Клоны М13, содержащие области с 5 и 3 -концами, обнаруживают при помощи гибридизации с P-мечеными зондами А и

В (см. черт.1, описанный ниже) и анализируют последовательность с тем, чтобы on ределить последовательность боковых областей, а также начальные и концевые пункты минисателлита.

Результаты, Изоляция специфичного минисателлита.

Индивид III 9 из родословной Гуджарати, описанный Джеффрисом и др. (1986) Am.

J. Hum. 6епес, 39. стр,11-24) подвергают анализу на (СНПГП) сохранение наследственных признаков гемоглобина плода и ее фингепринт ДНК, обнаруженный после обработки Sau ЗА при помощи минисателлитного зонда 33,15, содержит полиморфный фрагмент в 8 2 т.п.о. (тысяч пар оснований) (фрагмент "g"; черт,1а), который имеет тенденцию образовывать сочетания с СНПГП у других членов этого рода. Этот ДНК-фрагмент подвергают очистке от других минисателлитных фрагментов с использованием двух циклов препаративного гелевого электрофореза. ДНК из индивида III 9 переваривают ферментом Sau ЗА, а фрагменты длиной 6-9т.п.о. собирают при помощи препаративного электрофореза. Эти фрагменты снова подвергают электрофрезу.

Отдельные порции ДНК III 9 обрабатывают ферментом Sau ЗА, каждую фракцию подвергают электрофорезу в 0,8 -ном агарозном геле и проводят дотгибридизацию с минисателлитным зондом 33,15. Фрагмент

g (8,2 т,п.о,), который гибридизуется с

СНППГ, подвергают примерно 1000-кратной очистке во фракцию 3.

Фрагмент "g", обнаруженный в продукте обработки ферментом Sau ЗА и подвергнутый очистке приблизительно в 1000 раз, клонируют в А L 47,1 и затем переносят на

Р2-лизогенную rec + культуру Е.coli с тем, чтобы отобрать рекомбинатный фаг, Полученную в результате библиотеку просеивают при помощи гибридизации с зондом

33,15. При этом получают четыре положительных бляшки. Их снова помещают на пластины (Π— 8 pfu (бляшку) {С гес В, rec С культурой Е.coll) с тем, чтобы получить

1788970

12 бляшки нормального размера (1 мм в диаметре). Далее два клона Ад 1 и ilg 3 анализируют и обнаруживают, что они содержат Sau

ЗА-вставки размерами 7,7 и 7,8 т,п,о. соответственно. Оба эти клона получают из полосы q, но они короче полосы д на 0,5 и 0,4, т.п.о. соответственно. Так как не было какой-либо неоднородности в размерах Sau

ЗА-вставки как в клонеЛд 1, так и клонеЯд 3, выращенных на res В, res С культуре Е.col! (эти данные здесь не приведены), отсюда следует, что часть вставки была "утеряна" в каждом клоне в процессе их первоначального переноса íà rec+ культуру Е,coli.

Выходы ДНКАд 1 и ilg 3 были очень низкими (1% от выхода рекомбин этной ДН К 1

47.1), что указывает на необычные свойства роста таких минисателлитных клонов, Поэтому Sau ЗА-вставку субклонируют в PU C13 и переносят в rec А-производную культуры

Е,coli J М83. Полученный в результате субклон, р il, g 3 содержит Sau ЗА-вставку в 7,1 т,п.о., что на 0,7 т.п.о. короче, по сравнению с вставкой в g3.

Организация минисателлитного фрагмента g, Структуру минисателлитного фрагмента в равд 3 определяют при помощи рестрикции и анализа ДНК-последовательности, Карта для Sau ЗА-вставки в р it g 3 построена при помощи эндонуклеазы сечения

Alu I (А), Dde I (!), Нае lil (Н), МЬ II (M), Pst (P) и Sau 3A(S), Сайты сечения для Hinf I или

RS al отсутствуют. Вставка в 7,14 т.п.о, содержит 171 тендемный повтор последовательностии в 37 п.о. (пар оснований) плюс 747 п.о. боковых для ДНК, ДН К вЂ” последовательность гипервариабельного фрагмента g содержит область с

5 и,3 конец и минисателлит вместе с повторяющимися последовательностями трех случайных областей (а — с) из этого минисателлитэ, начало" обращенного Alu-фрагмента, несколько простых областей последовательности в 5 — области, согласованную последовательность (соп) минисателлитного повторяющегося блока в 37 п.о. второй повторяющийся блок в области "с" содержит сайт рестрикции Нае III, и эта область образует внутренний сайт Нае III e мин исателл ите.

Клон р А g 3 содержит минисателлит в

6,3 т,п.о., лишенный сайтов рестрикции, за исключением единственного внутреннего сайта Нае III, Этот минисателлит составлен из 171 повтора блока в 37 п,о „который содержит последовательность G T G G G С А

G G . Эта последовательность в точности соответствует наиболее инвариантной час5

15

25 плотностью сайтов рестрикции. Начало 5 —

55 ти последовательности ядра в 11 — 16 п.о., которая ранее была идентифицирована как сочетающаяся C несколькими различными человеческими минисателлитами. Повторяющиеся блоки не являются полностью однородными. Анализ последовательности нескольких случайно выбранных областей внутри этого минисателлита выявляет ограниченное количество изменений повторя ющейся последовательности, Большинство вариантов, включающих делецию в 4 п.о., который продуцИрует под множество повторяющихся блоков в 33 п,о„распространены по более чем одному повторяющемуся блоку. Один вариант(трансверсия А С в области С) создает единственн ы и внутрен ний сайт Нае III и он является единственным, обнаруженным в одном повторяющемся блоке. Начал ьн ые и кон цевые повторя ющиеся блоки минисателлита больше отличаются последовательностями, чем внутренние повторы, Минисателлит в р А g 3 содержит боковую не повторяющуюся ДНК с нормальной области состоит из головной части обращенного Alu-элемента. Оставшиеся 5 - и 3 области, определенные с использованием зондов гибридизации а и Ь, являются уникальной последовательностью ДНК и гибридизация осуществляется только на этом участке ДНК (эти данные не приведены). 5 область содержит значительное количество

ДНК с простой последовательностью (полипурин и (АСС)п), Минисателлитный фрагмент g обнаруживает единственный полиморфный участок.

Для того, чтобы определить, можно ли использовать полный клонированный минисателлитный фрагмент в качестве зонда гибридизации для специфического обнаружения соответствующего участка в человеческой ДНК Sau ЗА-вставку из р А g 3 подвергают гибридизации в присутствии конкурентной ДНК человека, обработанной ферментом Hinf I.

При помощи рЯ g 3 обнаружено Менделево наследование полиморфных ДНКфрагментов. 8 мкг человеческой ДНК обрабатывают ферментом Hinf I, подвергают электрофорезу в 0,8% ном агарозном геле, гибридизуют с Sau ЗА-вставкой из р Л g

3 в 1 х SSC* при температуре 65 С в присутствии 6%-ного раствора полиэтиленгликоля и 50 мкг/мл конкурентной ДНК плаценты человека после гидродинамического фрагментирования с ИСпользованием щелочи, и промывают в 0,2 х SSC при температуре

1788970

65 С. При помощи р it g 3 обнаруживают единственный участок, который является гетерозиготным во всех" указанных индивидах. Наследование аллелей является менделевым.

П ри весьма строгих условиях (0,2 x SSC, 65 С) обнаруживают либо один, либо два прогибридизировавшихся фрагмента во всех проверенных индйвидах. При помощи рil. g 3 обнаруживают фрагмент g в 8,2 т.п,о, в ранее обследованных родственных индивидах III 8, что подтверждает клонирование полосы g. При менее строгих условиях (1 х SSC, 65 С) обнаруживают дополнительный, слабо гибридизующийся, полиморфный ДНК-фрагмент, ДНК-фрагменты, обйаруженные при помощи р 2 g 3 и ри очен ь строгих условиях, класс ифи цированы как аллели одной области. Этот участок не связан с полом и, как было установлено, не является существенным, но половые связи в двух больших родословных были исследованы не полностью (исследовали 61 потомка, Z = 0,18 при д = 0 43; эти данные не приведены). Он ведет себя как аутосомная-область и расположен на 7 хромосоме.

Полиморфное изменение в минисателлитном участке.

Продукты обработки ферментом Hinf I

ДНК из 79 случайно выбранных британцев кавказского происхождения отбирают при помощи вставки из р А g 3, сначала отдельно, а затем в группах по 14 человек (1 мкг

ДНК от индивида), подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле длиной 35 см с тем, чтобы получить максимум аллельного разрешения. Длину минисателлита в самом коротком типичном аллеле определяют при помощи геномной карты этого фрагмента в гамозиготе, используя боковые зонды а и b одной копии, Количество повторов на аллель очень приблизительное и зависит от пропорции в минисателлите повторяющихся блоков в

37 — 38 п.о. За исключением короткого типичного аллеля, оставшиеся аллели попадают в выборку либо однажды (42 аллеля), либо дважды (12 аллелей), либо три раза (12 аллелей), либо четыре раза (5 аллелей). Такое распределение не очень сильно отличается от ожидаемого, если все эти аллели встречаются редко (g = 0,0081, 2 (4 ф,р.) = 4,0) и оно, следовательно, согласуется с простой моделью одного типичного корОткого аллеля (g= 0,165), причем в этой популяции одинаково редко присутствуют 103 аллеля (g= 0,0081 на аллель).

По крайней мере 77 различных аллелей могут быть "разрешены" в этой популяционной пробе, причем количества повторов изменяются в области от 14 до примерно 525 на аллель. Гомозиготы в этой популяционной пробе все гомозиготны с самым коротким аллелем. Приведенные оценки для числа аллелей и средней частоты для редких аллелей ограничиваются разрешением гелевого электрофореза и реальные числа для аллелей различной длины в этой пробе могут быть больше.

Распределение длин аилелей не совсем произвольно, а содержит"три класса аллелей с коротких (14 — 16 повторов), средних (41 — 68 повторов) и длинных (107 — 424 повтора). Бимодальное распределение длин аллелей было ранее отмечено"для кавказцев в гипервариабельной области, расположенной от 5 до гена человеческого инсулина (NMure, 1982, 295, стр. 31 — 35), хотя такая бимодальность не очевидна для негрев.

Изоляция фрагмента g подтверждает. что большие и высокополиморфные ДНКфрагменты в фингепринте ДНК могут быть клонированы с тем, чтобы получить специфичные относительно определенной области зонды, пригодные для изучения отдельных гипервариабельных областей.

Несмотря на то, что фрагмент g можно клонировать в бактериофагiL полученные в результате клоны проявляют необычные свойства роста на гес культуре Е.coli. Это может приводить к изъятию минисателлитных клонов из известных амплифицированных человеческих библиотек в фаге.

Клонированный минисателлит не стабилен как относительно внешних, так и внутренних возмущений при субклонировании в pU

С13 в rec А культуре Е.coll. Рекомбинантный р А g 3 теряет примерно 30 повторяющихся блоков по сравнению с фрагментом р 2 g 3. следовательно, не полностью отражает организацию фрагмента g.

Клонированный ДНК-фрагмент имеет ожидавшуюся структуру для минисателлита, что подтверждает тот факт, что фрагмент

g не был получен из ДНК с более длинным сателлитом. Несмотря на присутствие как последовательности "ядра" в каждом повторяющемся блоке, так и части Alu — последовательности в 5 -области, клонированный фрагмент9 в присутствии конкуретной человеческой ДНК действует как специфичный относительно определенной области зонд.

Неудача при использовании р А 9 3 с целью эффективного обнаружения других, содержащих ядро, минисателлитов, объясняется

16

15 присутствием дополнительной неядерной

ДНК в каждом повторяющемся блоке.

Клонированный минисателлит проявляет полиморфизм по длине, что вероятно объясняется аллельной вариацией как в количестве повторяющихся блоков, так и в отношении повторяющихся типов с длиной

37 и 33 п,о, в каждом аллеле, В каждой случайной популяционной пробе из 158хромосом можно обнаружить один распространенный и по крайней мере 76 редких аллелей, Этот участок является гораздо более полиморфным, чем большая часть, или даже все клонированные человеческие гипервариабельные области, которые охарактеризованы до настоящего времени, включая селекцию относительно коротких клонированных минисателлитов.

Гетерозиготность в этом участке составляет не менее 96,8, причем большая часть гомозигот рождается из короткого распространенного аллеля, Новые аллели на этом участке возникают либо в результате изменения количества повторов, либо за счет сдвига рамки в процессе репликации ДНК, либо за счет неравного обмена. Предположив наличие случайного дрейфа мутации, вычисляют параметр 4 NeV (0), где Ne — эффективный размер популяции, а V — скорость мутации на одну гамету, исходя из количества различных аллелей, отмеченных в популяционной пробе. Заявитель рассчитывает, что он содержится в диапазоне 60 — 90 для этого участка, в зависимости от того, включал или не включал распространенный короткий аллель, Так как Ne для человека равен примерно 10, скорость мутации V в аллели новой длины в этом участке равна приблизительно

0,002 на одну гамету. Это значение для V занижено, так как количество обнаруженных аллелей лимитируется разрешением гелевого Электрофореза и так как не существует бесконечного числа потенциальных разрешаемых аллелей. Средняя длина ДНК минисателлита на этом участке составляет 5 т.п,о, и, следовательно, скорость мутации (рекомбинации) на 1 т.п.о. минисателлита составляет > 4 х 10 по сравнению с 10 на 1 т.п.о., установленную для других, содержащих более короткое ядро, минисателлитов и среднЕй скоростью мейотической рекомбинации 10 на 1 т.п.о. для человеческой ДНК (Nature, 1985, 314, стр,67-73), Таким образом, скорость образования новых аллелей в этом участке минисателлита гораздо более высокая.

По-видимому, скорость мутации для коротких аллелей является относительно небольшой, что может служить объяснением того, 20

25 ка

5

55 как самый короткий аллель мог дрейфовать, чтобы обеспечить значительную частоту в популяции, не подвергаясь разрушению в результате неравных обменов в течение этого процесса.

Способ фингепринта ДНК представляет собой эффективное средство для индивидуальной идентификации и для установления семейного родства, например, в спорах об отцовстве и иммиграции, Точность этого способа определяется низкой средней вероятностью того, что некоторая полоса имеется у двух случайно выбранных индивидов, Для британцев кавказского происхождения величина Х была оценена как 0,2 для Hine -фрагментов фингепринта ДНК, с длиной более 4 т.п.о. В тех случаях, когда полоса встречается у нескольких индивидов (то есть, когда полоса одного индивида сочетается у второго индивида с полосой той же подвижности и авторадиограммой интенсивности), то не ясно, представляют ли сочетающиеся полосы идентичные аллели одного и того же минисателлитного участИспользуя зонды 33,6 и 33,15 фингепринта ДНК, можно заметить расщепление до 34 диспергированных аутосомных участков у больших групп людей, состоящих из братьев и сестер. Для большей части проанализированных участков только один из двух аллелей был отмечен во всей совокупности разрешенных фрагментов фингепринта ДНК значительных размеров (> 4 т.п,о,), что наводит на мысль, что существуют большие различия по размерам между минисателлитными аллелями, причем много аллелей расположено в плохо разрешаемой (< 4 т.п,о.) области фингепринта ДНК, Это также можно заметить для клонированного минисателлита; Hinf 1-аллели на этом участке варьируются по длине от 1,7 до 20,4 т.п.о., а распределение частот аллелей показывает, что оба аллеля из этого участка могут быть разрешены в фингепринте ДНК только для 40О индивидов в то время, как ни один из аллелей не обнаружен у 14 человек.

При помощи минисателлитных зондов

33,6 и 33,15 обнаружены примерно 60 гипервариабельных участков.

В приводимом ниже примере 2 используют следующие материалы и приемы. а) Клонирование селекции больших минисателлитов.

Собирали 5 мг ДНК крови от каждого из 40 случайно выбранных индивидов, гидролизуют ферментом Sau ЗА, а фрагменты в 5 — 15 т.п.о, изолируют при помощи препаративного электрофореза в 0,6 Д-ном агарозном геле с последующим электроэлю17

18 ированием на мембрану для диализа. Очищенную фракцию подвергают электрофорезу âo втором препаративном геле с тем, чтобы удалить все СЛеды загрязняющих небольших Sau ЗА-фрагментов. 50 нг фракции в 5 — 15 т,п.о. лйгируют с 100 нг 147.1 — ДНК, полученной после расщепления ферментов

8am Hl (Gene, 1980, 20, стр.249 — 259), упаковывают в лабораторных условиях, создают библиотеку и отбирают с использованием человеческих минисателлитных зондов 33,6 и 33,15. Положительные бляшки изолируют в соответствии с описанием, приведенным в примере 1, с тем, чтобы получить MC-ceрии рекомбинантного фага.

Ь) Изоляция минисателлитных зондов гибридизации.

ДНК рекомбинатного фага переваривают ферментом Sau 3А и большой фрагмент для вставки отделяют от малых фрагментов векторов при помощи электрофореза в агаре с низкой температурой гелеобразования, Гелевый срез, содержащий вставку. растворяют в 3 объемах воды при температуре

65 С, а порции, содержащие 10 нг ДНК вставки, снабжают меткой с использованизг ем P при помощи олигонуклеотидной затравки, с) Гибридизации по Саузерну, Пробы геномной ДН К обрабатывают рестриктазами и подвергают электрофорезу.

ДНК переносят на фильтры, фиксируют при помощи ультрафиолетового облучения и проводят предварительную гибридизацию при 65 С в течение 5 мин в 0,5 М фосфате натрия, 7% ДСН (додецил сульфата натрия), 1 ММ ЭДТА (рН 7,2), Затем фильтры гибридизуют в течение ночи с 0,5 мг/мл P-меченой ДНК зонда (удельная активность примерно 10 имп/мин/мкг ДНК) в присут9 ствии 25 мкг/мл разрезанной однонитевой конкурентной ДНК плаценты человека. После гибридизации фильтры промывают при температуре 65 С в 40 мм раствора фосфата натрия, 1 ДСН (рН 7,2), затем промывают при температуре 65 С в 0,1 х SSC (15 мм

NaCl. 1,5 мм тринатрий цитрата, рН 7,0), 0,1/ ДСН, Фильтры оставляют на авторадиографию в течение от 3 часов до 1 недели при температуре — 80 С в присутствии интенсифицирующего экрана, d) Определение тандемной повторяющейся последовательности MC-рекомбинантов.

Каждую МС-рекомбйнантную ДНК подвергают обработке ультразвуком. отбирают фрагменты размером 0,3 — 0,6 т.п,о. и клонируют в сайт Sma 1 M 13 mp 19. Рекомбинантный фаг отбирают при помощи гибридизации бляшек с P-меченой МСзг вставкой ДНК. 10 строго положительных однонитевых ДНК фага из данных рекомбинантов сравнивают парами при помощи

С-теста. Большая часть ДНК разбивается на

5 две группы в соответствии с С-тестом и поэтому весьма правдоподобно, что они получены из длинной тандемно повторяющейся области А MS-вставки. Два М13-рекомбинанта каждой из двух комплементарных

10 групп анализируют на состав "последовательности при помощи метода концевого лечения леотидных цепей (Сангер, Никлен и

Кулсон (1977), Proc. Natl. Acad) с тем, чтобы определить повторяющуюся последова15 тельность каждого МС-рекомбинанта на обеих нитях.

Пример 2. а) Выделение гипервариабельных зондов ДНК .

Sau ЗА-фрагменты после селекции по

20 размеру в области 6-15 т,п.о, из ДНК, собранной у 40 случайно выбранных индивидов, клонируют в векторе с Замещенным сайтом Bam HILL 47.1. Так как человеческие минисателлиты могут обладать существен25 ной аллельной вариацией по длине, применение объединенных человеческих ДНК с целью клонирования больших Sau 3А-фрагментов, должно увеличить количество кло- нируемых гипервариабельных участков, 30 которые содержат большие Sau 3А-аллели.

Из библиотеки, состоящей из 2000 реком- бинантов, изолируют 5 фагов при помощи гибридизации с человеческим минисателлитным зондом 33,15, а дополнительные 5

35 фагов обнаруживают при помощи зонда

33,6 с тем, чтобы получить МС-серии рекомбинантов.

Для того, чтобы определить, может ли каждый А MS-рекомбинант действовать как

40 специфический относительно определенной области зонд для гипервариабельного минисателлита, Sau ЗА-вставку каждого рекомбинанта подвергают гибридизации в присутствии человеческой конкурирующей

45 ДНК, гидролизованной рестриктазой Hinf 1 оттрех случайно выбранных индивидов, при гидролизе рестриктазой Alu 1 для Я MS 32, минисателлитные тандемные повторяющиеся блоки которого содержат сайт Hinf 1.8

50 из 10 рекомбинантов гибридизуют с одним или двумя большими вариабельными ДНКфрагментами в каждой из испытуемых человеческих ДНК. Четыре рекомбинанта, обнаруженных при помощи зонда 33,6 Я MS

55 8, 40, 41 и 47) гибридизуются в ту же структуру вэриабельных ДНК-фрагментов и, следовательно, они получены из того же гипервариабельного участка, 2 мкг пробы

ДНК от трех, не связанных между собой

1788970

19 индивидов переваривают ферментом Hinf

1, подвергали электрофорезу в 0,8 -ном агарозном геле, гибридизуют по Саузерну с

P-мечеными Sau ЗА-вставками из р il g 3 (пример 1),il, М$8 и Л М$40, как это описано в пункте материалы и методы. Фильтры промывают в 0,1 х SSC при температуре 65 С, а затем получают авторадиограмму в присутствии интенсифицирующего экрана в течение 1 дня или 1 недели. il М$8 и Л М$40 обнаруживают один и тот же гипервариабельный участок и дополнительные вариабельные ДНК-фрагменты.

Оставшиеся рекомбинанты Л MS 1, 31, 32 и 43 получают из других участков, которые не включают ранее охарактеризованный р Л g 3-участок (см. пример 1). Хотя ни один из этих Л М$-рекомбинантов не дает фингепринтов ДНК сложных вариабельных фрагментов, большинство Л MS-зондов еженедельно подвергают кроссгибридизации в дополнительные полиморфные ДНК-фрагменты, если авторадиограмму снимают более длительное время.

Два Л MS-рекомбинанта, обнаруженные при помощи зонда 33,15, Л MS 3 и il MS 30, не имеют специфичного участка в человеческой ДНК, гидролизованной Hinf 1 или Sau

3А как в присутствии человеческой конкурирующей ДНК, так и без нее.

Таким образом. несмотря на известные ранее трудности при клонировании больших и нестабильных человеческих минисэтеллитов, заявитель смог показать, что по крайней мере некоторые из самых больших и наиболее вариабельных ДНК-фрагментов, обнаруженных в фингепринте ДНК, поддаются клонированию в бактериофаге ilnpu условии, что эти вставки стабилизированы при помощи переноса фага в культуру-хозяина гес ВС Е.coli.

Ь) Определение блоков повторяющейся последовательности клонированных минисателлитов.

Случайные сегменты ДНК-вставки из каждого Л MS-рекомбинанта анализируют на состав последовательности с тем, чтобы определить, каждый ли клонированный гипервариабельный участок состоит из тандемно повторяющегося минисателлита.

Показано, что есе i1.MS-клоны состоят главным образом из тандемных повторяющихся блоков, длина которых изменяется в области от 9 п.о. для il MS 1 до 45 п.о, для il MS

43.

Случайные сегменты каждого клонированного минисателлита анализируют для того, чтобы определить согласованный повторяющийся блок. Переменные позиции в каждом типе согласованности указаны сле20

25 чаще всего связана с этими большими и

5

20 дующими символами: R, г= А или G; Y, Y= С или Т; N, n = любое основание, Минисателлит в MS 8 состоит из двух перемежающихся между собой повторяющихся блоков длийой

29 и 30 пар оснований.

Ни в одном минисателлите нет повторяющихся блоков, полностью однородных.

Минисателлит Л М$ Я состоит из перемешанных множеств в двух очень похожих, но различных повторяющихся блоков длиной

29 и 30 п.о. Концы минисателлитов в Л М$ рекомбинантах до сих пор не определены, Таким образом изолированы пять новых гипервариабельных участков, каждый из которых состоит главным образом из тэндемно повторяющегося минисателлита.

Повторяющиеся тандемом блоки из р Л 9 3, Л MS 1, Л MS 31 и Л MS 32 содержат последовательность ядра. Однако, копии последовательности ядра являются несовершенными и простые сравнения повторяющихся блоков этих минисателлитов очевидно не дают возможности определить новую последовательность ядра, которая сильно вариабельными участками. Напротив, представляется весьма правдоподобным, что с большими минисателлитаMè может быть связан широкий спектр производных ядра, Минисателлиты Л MS 8 и Л MS

43 содержат в высшей степени нестандартные версии последовательности ядра. При помощи простых сравнений Л MS 8, Л MS 43 и 33,6 нельзя четко представить новую специфичную последовательность, которая связана главным образом с этими тремя участками, c) Менделево наследование и вариабельность участков, Пять новых минисателлитов k MS 1, 8, 31,32 и 43 содержат(каждый) единственный большой и вариабельный участок. Менделево наследование всех участков подтверждают при помощи анализа сегрегации в больших горизонтальных родословных с использованием СЕРН-программы, Пробы

ДНК по 1 мкг из СЕРН-семейства 1423 обрабатывают феоментом Alu 1, гибридизуют по Саузерну с P-меченой Sau 3A-вставкой

3 из ilMS 31.

Степень аллельной вариабельности для каждого зонда оценивают при помощи анализа частоты сочетания аллелей между случайно выбранными англичанами. Пробы по

1 мкг ДНК гидролизуют ферментом Hinf 1, гибридизуют по Саузерну с il MS 43. Все индивиды являются гетерозиготными, что указывает на то, что степень гетерозиготности в этом гипервариабельном участке до1788970

21 статочно высока (H> 0,86, р> 0,95). Более точная оценка гетерозиготности может быть сделана при помощи сравнения аллелей в каждом индивйде с аллелями у шести ближайших "соседей" на авторадиограмме с 5 тем, чтобы оценить степень сочетания аллелей между отдельными индивидами. У всех обследованных индивидов $ = 0,11, откуда средняя частота аллеля 9 может быть оценена как g = 1 — (1-8) = 0.056, а гетерозигот- 10 ность как (1 — g) = 94 . Она представляет собой минимальную оценку гетерозиготности в условиях ограниченного разрешения гелевого электрофореза.

Все участки оказались высоковариа- 15 бельными с гетерозиготностью, изменяющейся в области от 90% для 1 М$8 до 99 для il MS 31 (см. таблицу 1), Степень вариации длины аллелей в дальнейшем анализируют при помощи сравнения сйектра 20 аллелей, обнаруженных в объединенных из

15 и 150 индивидов. Пробы ДНК от одного индивида (а), из обьединейной пробы 15 индивидов (b) и из объединенной пробы 150 человек (с) гидролизуют ферментами Alu 1 25 (для А MS 32) или Hinf 1 (для всех оставшихся зондов), проводят гибридизацию по Саузерну с гипервариабельными зондами, Все индивиды были случайно выбранными жителями Северной Европы, Индивиды "а" 30 включают в объединенные "b", а всех индивидов объединения "b" включают в объединение "с". Можно заметить, что 1 MS 43 обнаруживает вторую вариабельную область, представленную короткими Hinf 1-ал- 35 лелями, отмеченными символом 0; в дальнейшем эту область более детально не изучали, Для слабо вэриабельного участка il. MS

8 имеется два преобладающих аллеля дли- 40 ной 5,3 и 7,2 т.п.о. плюс 7 аллелей с меньшей частотой, обнаруженных в группе из 15 человек. Тот факт, что эти два преобладающих аллеля не являются результатом ошибки при взятии пробы у этих 15 индивидов, под- 45 тверждается таким же преобладанием их в группе из 150 индивидов, Аналогично, А MS

43 (гетерозиготность 94 ) обнаруживает 7 основных аллелей, которые согласуются в группах из 15 и 150 индивидов. Напротив, 50 наиболее вариабельные участки А MS 1, 31 и 32, и р 1 g 3, гетерозиготность которых, изменяется в области 97-990, не обнаруживают аллелей с значительной частотой популяции, которые сочетаются с равной интенсивностью у обоих групп индивидов.

Разброс длин аллелей у кавказцев также изменяется между такими гипервариабельными участками (см. таблицу 1).

22

Большинство аллелей избMS 31 распределно довольно равномерно на относительно узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п.о., в то время, как аллели из А MS 1 варьируют по размеру от 2 до 20 т.п.о. В некоторых случаях имеется очевидная неравномерность распределения аллелей по длине, в частности, в А MS 43.проявляются два преобладающих класса размеров аллелей 5-6 т.п,о, и 8 — 14 т.п.о„а в р il g 3 проявляются три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5 — 15 т,п.о. Обнаруженные участки являются в высшей степени вариабельными, а в действительности, они являются самыми вариабельными среди большей части полиморфных участков, выделенных до сих пор из ДНК человека..

Пример 3, Чувствительность минисателлитных зондов, Авто радиографический сигнал гибридизации по Саузерну, полученный после гибридизации в течение ночи, достаточно насыщен при концентрации ДН К зонда > 0,1 нгlмл, причем также сигналы могут "быть легко получены от 60 кг и даже меньшего количества человеческой геномной ДНК.

Аналогично, в зависимости от генотипа ис пытываемых индивидов, с использбванием этих зондов можно об на ружитъ.2% и меньше ДНК одного индивида.

Проведен анализ чувствительности спе- цифичных относительно определенной области зондов и их применения с целью проведения судебной экспертизы в двойном преступлении изнасилбвание/убийство, Подозреваемый 1 был обвинен в убийстве У, но судебное расследование во всей очевидностью показало, что обе жерт.-, вы X u Y были убиты одним и тем же челове-, ком. Выделяли и аналйзировэлй ДНК из следующих судебных образцов: "а" — волосы жертвы Х, взятые через два дня после убийства, "Ь" — смесь спермы и влагалищной жидкости, извлеченная из лобковых волос жертвы Х; "с" — Свежая кровь подозреваемого L, "d" — кровь из сердца, взятая через день после убийства у жертвы У; "е" — влагалищный мазок у жертвы У, содержащий сйерму. кровь и влагалищную жидкость, "f" — пятно на юбке жертвы У, содержащей сперму и кровь, Пробы "а" и "b" хранили e ñóõoì виде. при температуре 4 С в течение,3 лет, пробы

"d" и "е" хранили при температуре 40 С в течение 2 месяцев, а пробу "Г хранили в сухом виде при температуре 4 С в течение

2 месяцев. ДНК извлекали, гидролизовали

Hinf 1 и подвергали гибридизации по Саузерну с меченой P- il, MS 1-вставкой. ДНК

- 32 анализировали в каждой пробе, за исключе23

1788970 нием проб "е" и "f". Авторадиограмму получали в течение одной недели в присутствии интенсифицирующего экрана. Пятна спермы "Ь", "е" и "Г содержат два гибридйэирующихся фрагмента ДНК, которые не могут п ри надлежать жертве. Кроме того, проба

"b" содержала аллели жертвы, полученные из влагалищной ДНК. Аллели спермы "b", "е" и "f" неразличимы, что наводит на на мысль, что жертвы Х и У были на самом деле изнасилованы одним и тем же мужчиной.

Аллели подозреваемого L не сочетались с аллелями пятен спермы.

Эти результаты подтверждали при помощи гибридизации с АМ$31 и при помощи анализа фигнепринтов ДНК более значительных количеств судебных материалов. B свете этих данных, обвинения, выдвинутые против подозреваемого, были сняты прокурором.

П риме р4, Объединенные минисателлитные зонды, Чувствительность минисателлитов в процессах гибридизации по Саузерну позволяет объединить зонды с тем, чтобы их использовать с целью обнаружения вариабельных фрагментов из нескольких участков одновременно, как это было сделано для объединения из 5 зондов (р А g 3, 1 MS 1, 1 MS 8, А MS 31 и il MS 43), Теоретически количество фрагментов ДНК, которое можно обнаружить при помощи 5 зондов, равно

5 (1+ Н;), где Н; — гетерозиготность i-го зонда, Для этих 5 зондов в среднем может быть обнаружено 9,78 фрагментов на один индивид, На практике может быть разрешено 8,4+ 1,2 (ст. отклонение) полос > 2 т.п.о. (испытано 40 случайно выбранных индивидов). Такая потеря разрешаемых полос частично объясняется исключением малых (1,6 т.п.о.) и относительно распространенных р il g 3 аллелей (пример 1. средняя потеря на одного индивида = 0,33 полосы), но в основном это результат совместной миграции при электрофорезе различных минисателлитных аллелей.

Структуры пятен дот-гибридизации с несколькими участками дают высокую индивидуальную специфичность только с 18 ( (ср. отклонение+117;)ДНК-фрагментов, которые сочетаются у пар, случайно выбранных жителей Северной Европы (испытано

40 пар.).

15

25 или U, А может присутствовать или отсутст30

55

У троих отец/мать/ребенок все фрагменты потомства можно проследить. Каждый потомок содержит 3,4+0,5

ДНК-фрагментов, которые носят специфичное отцовское происхождение и равное количество специфичных для матери

ДНК-фрагментов (испытано 10 троек отец/мать/ребенок).

Формула изобретения

1. Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях, предусматривающий гибридизационный анализ геномной ДНК, который включает окрининг библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с пробой, и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей или части вставки, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения специфичности полинуклеотида, в качестве пробы используют последовательность 33,6 или

33,15, содержащую по меньшей мере 3 тандемных повтора, включая комплементарные последовательности; (А)

AGGGCTGGAGG, где Т представляет собой Т вовать, или AGA GGTGGGCAGGTGG, где Т представляет собой Т или U, причем она в среднем имеет по меньшей мере 70% гомологии между всеми тандемно повторяющимися последовательностями и выявляют полинуклеотид, способный гибридизироваться с ДНК-фрагментом, содержащим минисателлит, специфический к конкретному участку или локусу генома, при этом указанный участок имеет аллельную вариацию по меньшей мере 3 (100).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что минисателлит содержит любую одну последовательность, выбранную из: (3) AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGG

GCCAGGGAGPGGC (4) GTGGAYAGG (5)TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG (6) GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGA

СТСА (7) GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGG

TGTTGG (8) AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGA

GTAC (9) TGTGTGTAATGGGTATAGG CAGGG С

CCCGGGAAGGGGGTCTGGYX (где У обозначает С, Т или U, X обозначает

G или С, R обозначаетА или G и Т обозначает

Т или U), или ее тандемную дупликацию (дупликации) или последовательность, комплементарную ей, 26

1788970

25

35

45

Составитель Н.Кузенкова

Техред М.Моргентэл Корректор О.Юрковецкая

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 83 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5