Способ получения реагента эрилида для проведения коагулогических тестов

 

Использование: в медицине и медицинской промышленности для диагностики нарушений в системе гемостаза и тестирования активности гемостатических препаратов. Сущность изобретения: эритроцитарную массу отмывают гипертоническим раствором, содержащим 0,22 М хлористого натрия и 0,05 М фосфорнокислого натрия. Отмытые эритроциты подвергают гемолизу в 0,007 М гипотоническом фосфатном буфере с рН 7,4. Затем промывают в фосфатном буфере на фильтрационной установке с тангенциальным потоком жидкости при поэтапном снижении концентрации буфера от 0,007 М до 0,001 М. Полученную суспензию отмытых мембран эритроцитов экстрагируют смесью изопропанола и хлороформа в течение 15-18 ч при 4-5°С. Органическую фазу отделяют центрифугированием . Осадок высушивают, экстрагируют эфиром, осаждают ацетоном, высушивают, эмульгируют сухой осадок в воде, добавляют стабилизатор и высушивают лиофильно. 1 табл. &

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

О

О ф (21) 4898389/13 (22) 29.12.90 (46) 23.01,93. Бюл, N 3 (71) Всесоюзный гематологический научный центр (72) А.А.Козлов, А.Л.Берковский, В.Н.Бовенко, Н. Е, Пичугина, Т.М.Простакова и

Ю.А. Константинов (73) А.А,Козлов (56) Патент US

¹ 3179567, кл. 167 — 84.5, 1965, Патент EP ¹ 0107383, кл. С 12 Q 1/56, 1984, Авторское свидетельство СССР № 251766, кл. А 61 о, 1969. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ЭРИЛИДА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОАГУЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ (57) Использование: в медицине и медицинской промышленности для диагностики нарушений в системе гемостаза и

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к лабораторным методам диагностики нару- шений в системе гемостаза и тестирования активности гемостатических препаратов (например, криопреципитата, концентрата фактора VIII и IX).

Во многих коагуля ционных тестах (активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), кефалиновое время, каолиновое время, определения активности

Vill u IX факторов свертывания крови) для стандартизации фосфолипидной активации применяются реагенты фосфолипидной природы, выделенные из различных тканей

„,. Ы„1790604 А3

Органическую фазу отделяют центрифуги- ф рованием. Осадок высушивают, экстрагируют эфиром, осаждают ацетоном, высушивают, эмульгируют сухой осадок в воде, добавляют стабилизатор и высушивают лиофильно. 1 табл. человека и животных и из некоторых растений.

Известны способы получения фосфолипидов (кефалинов) для проведения коагуляционных тестов — из мозга кроликов, лецитина сои, ткани легкого, нервной ткани экстракцией в ацетоне и диэтиловом эфире, Однако отечественные препараты кефалинов нередко содержат остатки тканевого тромбопластина и не дают стандартных результатов, а импортные кефалины оказываются недоступными из-за высокой стоимости.

Известен способ получения фосфолипида из эритроцитов-эритрофосфатида, Спо1790604 соб состоит в промывании эритроцитарной массы изотоническим 0,15 М раствором натрия хлористого, экстрагирования целевого продукта в этиловом спирте в течение 35 ч, отстаивания, выпаривания в вакууме при

40-42 С, повторной экстракции полученного осадка в диэтиловом эфире, растворения в ацетоне и высушивании в вакууме при

42 С.

Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков: 3-кратное промывание в 0,15 М изотоническом растворе натрия хлористого недостаточно для полного отделения плазмы и других клеток крови (лейкоцитов, тромбоцитов), экстракция эритроцитарной массы без предварительного удаления содержимого эритроцитов (гемоглобина, ферментов и других ингредиентов цитозоля) не позволяет полностью удалить эти компоненты из конечного продукта; это приводит к повышению степени окисленности фосфолипидов и, как следствие, к снижению стабильности, нестандартности и низкой специфической активности эритрофосфатида; экстракция в этиловом спирте не является оптимальной для извлечения фосфолипидов и не позволяет получить достаточно большой выход целевого продукта; целевой продукт не подвергают лиофильному высушиванию со стабилизатором, что делает его восприимчивым к внешним воздействиям и требует хранения в запаянных ампулах из темного стекла, Целью изобретения является разработка способа получения высокоочищенного стандартного реагента с высоким выходом активного вещества, Способ получения реагента, названного эрилидом (авторское название) осуществляется следующим способом. Для более полного отделения примеси плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов, эритроцитарную массу 4-кратно промывают гипертоническим солевым раствором, содержащим

0,22 М натрия хлористого и 0,05 М натрия фосфорнокислого (режим центрифугирования 8 мин при 4000 g). Для более полного отделения фосфолипидных мембран от гемоглобина и других ингредиентов цитозоля проводят осмотический гемолиз отмытых эритроцитов в гипотоническом 0,007 М фосфатном буфере с рН 7,4, Дополнительное отмывание мембран эритроцитов от веществ цитозоля проводят на фильтрационной установке с тангенциальныM потоком фосфатным буфером с рН 7,4, причем для лучшего отделения примесей концентрацию буфера 2 раза снижают; с 0,007 М до 0,003-0,004 M и с 0,003 — 0,004 М до 0,001 М. Окончание

55 отмывания устанавливают визуально до приобретения суспензии молочно-белого цвета.

Затем, чтобы получить максимальный выход целевого продукта, отмытые мембраны эритроцитов экстрагируют в смеси изопропанола и хлороформа 2:1 в течение

15 — 18 ч при 4 — 5 С.

После завершения экстракции проводят центрифугирование смеси в течение

30 мин при 4000 — 5000 g, надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают и дополнительно экстрагируют в диэтиловом эфире, осаждают в ацетоне и образовавшийся осадок сушат при комнатной температуре, С целью предохранения от деградации и удлинения срока хранения целевого продукта сухой остаток снова эмульгируют в воде, добавляют стабилизатор и подвергают лиофильному в,ысушиванию, В качестве стабилизатора может быть использован ряд соединений, обычно применяемых для этих целей.

Получение эрилида сер. 010290, 750 мл эритроцитарной массы промывают 4 раза 0,22 М раствором натрия хлористого, содержащего 0,05 М натрия фосфорнокислого, Режим центрифугирования: 8 мин, 4000 g.

К 500 мл отмытых эритроцитов добавляют 5 л 0,007 M фосфатного буфера рН 7,4 и гемолизированные эритроциты отмывают на фильтрационной установке с тангенциальным потоком. Площадь поверхности фильтрации 1 м, скорость пог тока 300 мл/мин, поры фильтра с диаметром

0,22 мкм. При отмывании молярность промывной жидкости понижается с 0,007 до

0,004 и до 0,001 M. Отмывание проводят до белого цвета суспензии.

Полученные 250 мл суспензии отмытых мембран эритроцитов экстрагируют смесью 500 мл изопропанола и 250 мл хлороформа в течение 18 ч при 4 С, центрифугируют 30 мин при 5000 g, надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают при температуре 37 С, растворяют в 100 мл диэтилового эфира, переносят раствор в 400 мл ацетона, образовавшийся осадок сушат на воздухе.

B результате выход целевого продукта составил 0,9161 г, содержание фосфолипидов 70 /, белок отсутствует, индекс окисленности 0,07, Затем для лиофильного высушивания сухой осадок эмульгируют в воде до концентрации 5/, затем разводят водой до 0,1 /, добавляют в качестве стабилизатора глюкозу до конечной концентрации 3 /, разлива1790604

Основные ха акте истики

Э илид

Э ит о ос ати

Содержание фосфолипидов по данным тонкослойной хроматографии, мас. ь

Содержание белка по Лоури, мас. Д

Содержание холестерина по данным TQHKocлойной хроматографии, мас. <

Выход целевого продукта из 1 л эритромассы, г

Индекс окисленности (спектрофотометрически)

Специфическая активность в тесте АПТВ, с

Коэффициент вариации по донорам, 75» 5

Отсутствует

60 "-5

2+0,5

25» 5

0,9-1,0

0,07

35-45

35» 5

0,3

0,1 1

0-65

Составитель T.Ïðoñòàêîâà

Редактор Н,Мельникова Техред М,Моргентал Корректор Л.Пилипенко

Заказ 367 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ют в флаконы и подвергают лиофильному высушиванию, Проверяют качество полученного продукта; специфическая активность в тесте

АПТВ 36 с, Сравнительная характеристика предлагаемого реагента эрилида и прототипаэритрофосфатида (по 10 серий каждого) отражена в таблице, Таким образом, разработанный способ позволяет получить выход целевого продукта более чем в 3 раза превосходящий прототип, специфическую активность в тесте

АПТВ, соответствующую международным стандартам, продукт, полностью очищенный от белка, гемоглобина и других примесей, влияющих на стандартность коагуляционных тестов. А также коэффициент вариации при проведении теста на здоpoBblx донорах в 4 раза ниже прототипа.

Способ также позволяет получить высокоочищенный фосфолипидный реагент с содержанием активного вещества 75»+ 5/.

Формула изобретения

Способ получения реагента эрилида для проведения коагулогических тестов, включающий отмывание эритроцитарной массы солевым раствором с последующей экстракцией органическими растворителями и высушиванием целевого продукта, о т л и ч а5 ю шийся тем, что, с целью увеличения содержания активного вещества в целевом продукте, в качестве солевого раствора используют гипертонический раствор, содержащий 0,22 М хлористого натрия и 0,05 M

10 фосфорнокислого натрия, перед экстракцией эритроцитарную массу подвергают гемолизу в 0,007 М гипотоническом фосфатном буфере с рН 7,4, промывают в фосфатном буфере на фильтрационной установке с

15 тангенциальным потоком жидкости при поэтапном снижении концентрации буфера от

0,007 М до 0,001 М, а экстракцию целевого продукта проводят в смеси изопропанолхлороформ в течение 15 — 1S ч при 4 — 5 С, 20 затем органическую фазу отделяют центрифугированием, полученный осадок высушивают, дополнительно экстрагируют диэтиловым эфиром, осаждают ацетоном, высушивают, эмульгируют сухой осадок в

25 воде, добавляют стабилизатор и высушивают лиофильно,