Способ радиометрического определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях

 

Использование: для определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биол|эгичёских тканях. .Сущность изобретения: дли определения содержания фосфорибозилпирофосфата проводят реакцию ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченного гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата , инозинмонофосфата осаждают в виде соли лантана, которую затем растворяют в 0,03 М соляной кислоте, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и измеряют скорость образования в ней импульсов. Изобретение позволяет повысить точность анализа фосфорибозилпирофосфата и сократить затраты времени на его выполнение за счет селективного выделения продукта реакции и определения его радиоактивности в гомогенной счетной системе.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G Ot N 33/60

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

С 100

Сст С

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4908818/14 (2 ) 07.02,91 (45) 15.03,93. Бюл. М 10 (71) Омский государственный медицинский институт им. М.И.Калинина (7 ) В.Д.Конвай, П.П,Золин и Г.Е,Вейцман (58) Aust. 3. Ехр, Biol. Med. Scl, 1984, ч. 62, РТ 3, р. 281 — 290. (51) СПОСОБ. ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФОРИБОЗИЛПИРОФОСФАТА В

БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ (57) Использование: для определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биол згических тканях..Сущность изобретения: для определения содержания фосфорибоИзобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в экспериментальной и практической медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.

Целью изобретения является повышение точности анализа и сокращение времени егО выполнения.

Способ осуществляется следующим образом.

Взвешивают порцию замороженной ткани 100 — 200 мг и быстро гомогенизируют в кипящем трис-HCI буфере (30 MM, pH 7,4), добавленном из расчета 1 мл на 100 мг ткани, Сразу же после этого две аликвоты гомогената по 0,5 мл переносят в пробирки, одна из которых содержит 0,5 мл 0,01 мМ водного раствора ФРПФ (служащего стандартом), а другая — 0,5 мл дистиллированной воды. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане в течение двух минут, после чего, немедленно охлаждают до 0 С, Охлажденные пробы центрифугируют при 0 — 40С и 1000g в течение 1 мин, после чего каждый иэ суперна„, Ы2„, 1802335А1 эилпирофосфата проводят реакцию ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченного гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, инозинмонофосфата осаждают в виде соли лантана, которую затем растворяют в 0 03 М соляной кислоте, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и измеряют скорость образования в ней импульсов.

Изобретение позволяет повысить точность анализа фосфорибозилпирофосфата и сократить затраты времени на его выполнение эа счет селективного выделения продукта реакции и определения его радиоактивности в гомогенной счетной системе.

Ф тантов смешивают с 1 мл 20 Мм раствора

Mg CI2, содержащего меченный гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубируют при

37 С в течение 90 мин. Реакцию останавливают охлаждением пробирок до О С и добавле- Ю нием охлажденных реактивов: К-фосфатного буфера(0,06 М, рН 7,4) — 1 мл трис-HO буфера (0 1 М, рН 7,4) — 6 мл, и 0 5 M водного раствора (1 азотнокислого лантана — 1 мл, Осаждают иноэинмонофосфат при О С 15 минут, после чего, центрифугируют в течение 10 минут при 00С и 30009. Полученные таким образом осадки растворяют в 2 мл 0,03 M HCi, отбирают от каждого раствора по 0,6 мл и смешивают с 10 мл сцинтилляционной жидкости Брея, Скорость образования импульсов измеряют на сцинтилляционном счетчике бета-частиц.

Содержание ФРПФ (в моль/г сырой ткани) рассчитывают по формуле

1802335 ной жидкостью Брея. Скорость образования импульса в каждой пробе измеряли в течение одной минуты на счетчике СБС-2.

Получили значения: для пробы содержащей стандарт Ф РПФ вЂ” 158294, импульса, для пробы без стандарта — 12337 импул ьсов, Подставив эти значения в формулу, получили

12337 100

158294 — 12337

Составитель П.Золин

Редактор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор M.Ñàìáîðñêàÿ

Заказ 847 Тираж : Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 где Сс> — счет пробы содержащей стандарт

ФРПФ;

С вЂ” счет пробы не содержащей стандарт

ФРПФ.

П р и и е р (определение содержания фосфорибозилпирофосфата в крысиной печени). .Взвешивали 150 мг замороженной в жидком азоте крысиной печени, быстро переносили в гомогенизатор и добавляли 1,5 мл трис-HQ буфера (30 мм, рН 7,4), предварительно нагретого до кипения, Гомогени-. зировали в течение 15 с. Две аликвоты гомогената по 0,5 мл немедленно переносили в стоящие на кипящей водяной бане пробирки, одна из которых содержала 0,5 мл

0,01 мМ водного раствора ФРПФ, а другая — 0,5 мл дистиллированной воды. После добавления гомогената обе пробирки кипятили в течение 2-х мин и немедленно помещали в 20 лед. Охлажденные пробы центрифугировали при 0 С и 1000 в течение одной минуты, после чего супернатанты сливали в отдельные пробирки, а осадки отбрасывали. К обоим супернатантам добавляли по 1 мл 20 MM оаствора

MgCb, содержащего С-гипоксантин в концентрации 0,025 мМ и инкубировали на водяной бане при 37ОС 90 минут. Затем, обе пробирки помещали в лед и в каждую из них добавляли по 1 мл 0,06 мМ К-фосфатного бу- 30 фера (рН-7,4), по 6 мл (0,1 М трис-НО) буфера (рН-7,4) и по 1 мл 0,5 М водного раствора азотнокислого лантана. Добавленные рас-.. творы были предварительно охлаждены до

0 С. Пробирки встряхивали и помещали в 35 лед на 15 минут, после чего центрифугировали 10 мин при 0 С и 30000. Супернатанты отбрасывали, а к осадкам добавляли по 2 мл

0,03 M раствора HCI и растворяли их при встряхивании. Из каждого раствора брали 40 по 0,5 мл и смешивали с сцинтилляционТаким образом, во взятом образце печени содержание ФРПФ составляет 8,45 нмоль/г сырой ткани.

Средняя продолжительность анализа по прототипному способу составляет 8 ч 45 мин, по предложенному способу- 2 ч 30 мин величина среднего квадратического отклонения — соответственно 0,458 и 0,255 нмоль/г.

Ф

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность анализа в 1,8 раза и сократить затраты времени на его выполнение в 3,5 раза.

Формула изобретения

Способ определения содержания фосфорибозилпирофосфата в биологических тканях, включающий проведение реакции ферментативного синтеза инозинмонофосфата из меченого гипоксантина в присутствии и отсутствии стандарта фосфорибозилпирофосфата, выделение меченого инозинмонофосфата и измерение его радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, иноэинмонофосфат, выделяют осаждением раствором азотнокислого лантана, осадок соллюбилизируют 0,03 М соляной кислотой, смешивают с сцинтилляционной жидкостью и затем измеряют в ней радиоактивность.