Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митогенного эндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК. Конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие фактор роста эндотелиальных клеток человека, трансформируют полученными ДНК штаммы реципиентов Е. coli, культивируют трансформанты в условиях, обеспечивающих экспрессию белка, и выделяют целевой продукт.

«-!A . <:

«- lEt:IA<1McTvI IE.<.ких

Рf < г<чг лик

Г<1<.УДЛЛСт E=EII«ai <1ЛтГI<»S

РГЛОмс:твО ci <".и (I r!< f1ATF-HT ссcÐI

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4203874/13 (86) РСТ/ <.< 5 87/00425 (02.03.87) (22) 02.11.87 (31) 835594 (32) 03.03.86 (33) US (46) 23.03.93. Бюл. N. 11 (71) Роджер Биотекнолоджи Инк. (IJS) (72) Майкл Джей, Вильсон Берджесс, Томас

Мейсиаг и Вилльям Дрохан (US) (56) Science, 1984, v. 225, р. 923-935.

J, Biol. Chem. 1985, вып. 26, р. 11389—

11392, Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митогенного эндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК.

Фактор роста эндотелиальных клеток (Ф РЭ К) является митогеном эндотелиальных клеток in vitro, ФРЭК выделяют путем осаждения сульфатом стрептомицина, гель — проникающей хроматографией, осаждения сульфатом аммония и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе.

Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем элюирования его линейным градиентом натрийхлорида из колонки на гепарин-сефарозе или обращенно-фаэовой высокожидкостной хрома. тографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида, обозначенные альфа- и бетаФРЭК, имеют мол,м. 17000 и 20000, Используя указанную методику, бычий ФРЭК, содержащийся в 8500 мл вытяжки из мозга быка (6,25 х 10 суммарных единиц). концен7 трируют с выходом в сумме 6 мл альфа. 50, 1804480 А3 (54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ МИТОГЕННОГО БЕЛКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА В ESCHERICHIA COLE (57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митогенного эндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК. Конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие фактор роста эндотелиальных клеток человека, трансформируют полученными

ДНК штаммы реципиентов Е. coli, культивируют трансформанты в условиях, обеспечивающих экспрессию белка. и выделяют целевой продукт, ФРЭК (3,0 х 10 единиц) и 3 мл бета-ФРЭК (5,2 х 10 единиц).

Сущность изобретения состоит в получении ФРЭК и его фрагментов, не содержащих других белков человеческого происхождения, ФРЭК получают в клетках-реципиентах, при этом конструируют векторы экспрессии, содержащие последовательность ДНК, кодирующую ФРЭК, трансформируют полученными рекомбинантами ДНК штаммы

Е. coli клеток хозяев, осуществляют культивирование трансформаторов в условиях, обеспечивающих экспрессию ФРЭК, и выделяют белок, Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получения дн-кДНК из мРНК ФРЭК и введения дн-кДНК в вектор. мРНК обогащают поли(А)содержащим мРНК материалом посредством хроматографии на олиго(Ф)целлюлозе или поли(н)сефарозе с последующим элюированием фракции мРНК, содержащей поли(А)последовательность.

Поли(А)содержащую мРНК используют для синтеза комплементарной кДНК (онкДНК), используя обратную трэнскриптазу.

1804480

В результате синтеза ДНК у 3 -конца ДНК образуется шпилечнэя петля, инициирующая синтез двунитевой ДНК, При соответствующих условиях эту шпилечную петлю используют для осуществления синтеза днкДНК в присутствии полимеразы и деоксирибонуклеотидтрифосфатов.

Вектор экспрессии обрабатывают с помощью эндонуклеазы рестрикции, которая образует по крайней мере два тупых или липких конца. Дн-кДНК встраивают в вектор.

Клоны, содержащие полные последовательности ФРЭК, идентифицируют, используя в качестве зонда вставку кДНК рекомбинантов ФРЭК, выделенных во время начального скриннинга библиотеки кДНК рекомбинантного фрагмента фага лямбда с олигонуклеотидами, специфическими к ФРЭК, Метод секвенирования нуклеотидов используют для определения последовательности аминокислот, кодированных фрагментами кДНК, Эту информацию можно использовать для определения клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной аминокислотой последовательностью аминоконца бычьего ФРЭК и пептида, выделенного в результате расщепления Ф РЭК бромидом цианогена.

J1 р и м е р. А, Получение тотальной РНК, Тотальную РНК (матричную, рибосомную и транспортную) экстрагируют из вытяжки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугирования гомогениэируют в 5 объемах раствора, содержащего 4М тиоцианата гаунидина и 25 мМ антивспенивателя

А. Гомогенат центрифугируют в роторе в течение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10 С, Надосэдочную жидкость доводят до рН 5,0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК, осажденной 0,75 объемами этанола при -20 С в течение 2 ч. PHK собирают центрифугировэнием и растворяют в 7,5 М гидрохлорида гуанидина, содержащего 2 мМ цитрата натрия и 5 мМ дитиотреитола, После двух дополнительных осаждений 0,5 объемами этанола оставшийся хлоргидрат гуанидина экстрагируют из преципитэтэ абсолютным этанолом. РНК растворяют в стерильной воде, центрифугированием удаляют нерастворимые вещества и осадок после центрифугирования повторно экстрагируют водой, PHK доводят до концентрации 0,2 M ацетата калия и осаждают при добавлении 2,5 объемов этанола в течение ночи при -20 С.

Б, Получение поли(А)содержащей РНК.

Преципитат тотальной РНК растворяют в 20 мМ Hepes-буфера (рН 7,2), содержащеro 10 мМ ЗДТА и 1 Р додецилсульфат-нэ трия, нагревают до 65"С в течение 10 мин затем быстро охлаждают до 25" С. Раствор

PHK затем разбавляют равным объемом воды и прибавляют NaCI äëÿ доведения конечной концентрации до 300 мМ NaCI.

Образцы, содержащие до 240 Агга единиц

РНК, хроматографируют íà поли(1/)сефэрозе. Поли(А)содержащую PHK злюируют 70 раствором формамида, состоящим из 1 мМ

Hepes-буфера (рН 7.2) и 2 мМ ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0,24 М

NaCI и полученную РНК осаждают 2,5 объемэми этанола при -20" С.

В. Конструирование клонов кДНК в фаге лямбда. мРНК (20 мкг) копируют в дн-кДНК с помощью трэнскриптазы и ДНК-полимеразы. дн-кДНК обессоливают на сефадексе G50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищают.на колонке в соответствии с инструкциями изготовителя. При инкубации с Sl-нуклеазой получают днкДНК с тупыми концами. Реакционную смесь, состоящую из 0,2 M цитратэ натрия (рН 4,5), 0,4 M хлорида натрия, 2,5 мМ ацетата цинка и 0,1 ед. Sl-нуклеазы на нг дннДНК, доводят до конечного реакционного объема 100 мкг, дн-дДНК инкубируют при

30 37 С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе G-50.

Дн-кДНК затем обрабатывают метилазой Е, coRI и фрагментом Кленова ДНК-пол35 имеразы 1. кДНК опять обессоливают на сефадексе G — 50. а затем лигируют с 0,5 мкг фосфорилированных линкеров Е. coRI, используя Т4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепляют эндонуклеазой рестрикции Е, 40 coRI и фракционируют в 87, акриламидном геле в трис-боратном буфере. ДНК размером более 1 кб элюируют из геля и извлекают при связывании с колонкой, элюируют 1

М NaCI, а затем собирают преципитэцией

45 этанолом.

Фрагменты ДНК затем вставляют в фрагмент gt11 фага лямбда, расщепленного рестриктэзой Е. coRI и обработанного фосфатазой, используя ДНК-лигазу Т4. Получа50 ют библиотеку, состоящую из 5,7 х 10 фагов, 65) которой составляют рекомбинантные фаги, Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42 С на штамме Е, coli У1088 (sup Е supF mtc В trp R

55 hsdR hsd M ton А 21 str А lac И 169 (proc::Òï5). К важным генетическим признакам указанного штамма относятся (1) sup F (необходимый для супрессии амбер-мутации фаза по S-гену), (2) hsd R lsd М, необходимые для предотвращения рестрикции

1804480

10

20

25 течение 2 ч в вакууме при 80 С.

Для скриннинга библиотеки кДНК ство- 30

40 чужеродной ДНК до модификации клеткихозяина и (3) 1ас И 169 (proc:: Тп 5), и (4) (pM C9) (Lac 1-несущее производное плазмиды pBR 322, которое подавляет в присутствии индуктора экспрессию чужеродных генов, которые могут разрушать фаг и/или подавлять клеточный рост.

Г. Идентификация клонов, содержащих

ФРЭ К-последовательности.

Для скриннинга библиотеки кДНК

ФРЭК, содержащей рекомбинантные фаги, клетки фагов с титром 1,5 х 10 высевают на

6 чашке на газон штамма E. coll У1090 (Л 1ас

И 169 pro А Ь ion ага D139 str А sup F (trp С

22:: Тп 10) (рМС 9) и инкубируют при 42 С в течение 6 ч. После охлаждения чашек в холодильнике в течение ночи их накрывают нитроцеллюлоэным фильтром. Положение фильтра маркируют иголкой. Через минуту фильтр удаляют и дают просохнуть при комнатной температуре. С каждой чашки получают двойной фильтр, кроме того, что фильтр оставляют в контакте с чашкой в течение 5 мин. Затем готовят все фильтры для гибридизации. Указанная методика включает денатурацию ДНК в 0,5 М NaOH с 1,5 М NaCI, нейтрализацию в буфере 1М трис-HCI, рН

7.5, и 1,5 M NaCI и нагревание фильтров в ла головного мозга человека для получения клонов, содержащих ФРЭК-вставки, конструируют специфический олигонуклеотид, Указанный олигонуклеотид базируется на анализе частичной аминокислотной последовательности концевых аминогрупп

ФРЭК, Бычий ФРЭК выделяют в виде двух форм, обозначенных как альфа- и бета-Ф РЭК, которые отличаются только аминокислотами, обнаруженными у соответствующих аминоконцов. Последовательность выводят из масс-спектрального анализа с быстрой атомной., бомбардировкой и определяют аминокислотный состав триптического пептида с концевой аминогруппой, По-видимому, аминоконцевая блокирующая группа ацетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином, то, как определено, вторая аминокислотная последовательность с аминоконцом, найденная в бета-, а не в альфа-ФРЭК, начинается с Phe Asn

Leu... Данная последовательность также обнаружена у концевой аминогруппы кислого фибробластного фактора роста, Концевая аминогруппа ФРЭК представляет Азп Туг

Lys ... и являбтся эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой элонгации.

Для конструирования олигонуклеотида выбирают последовательность аминокис45

55 лот Ile Leu Pro Азп Gly Ttu Val Авр Gly П1

Lys, соответствующую 19 29 включениям аминокислот альфа-c0P3K. Вместо создания смеси иэ олигонуклеотидов, охватывающих все возможные кодирующие последовательности (вследствие деградации генетического кода), конструируют длинный уникальный олигонуклеотид, Такие олигонуклеотид-затравки, как показано ранее, являются эффективными зондами при скриннинге комплекс-ДНК.

При конструировании ФРЭК-зонда используют три критерия: (1) исключают динуклеотидную пару CG. Данный подход основан на недостаточной встречаемости

CG-пар динуклеотида в ДНК прокариота, В тех случаях, когда возможно, используют данные о предпочтительной утилизации кодона. Когда оба эти подхода не информативны, возможно необычное связывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований G:Ò, I:Ò, I:А и I:С,. которое возникает при взаимодействии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК, Примерно 30 моль олигонуклеотида ра-. диоактивно метят путем инкубации с 32 ргамма-АРТ и Т4 полинуклеотид-киназой.

Полученные по методике, указанной выше, нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизуют при 42 С в 6 x SSPE-буфере (1 х SSPE = 0,18 M NaCI, 0 01 M (NaHPO4) (pH

7,2), 0,001 M ЭДТА), 2 х Денхардт-раствора (1 х Денхардт-раствора содержит по 0,02 фикола, поливинилпирролидона, бычьего сывороточного альбумина), 57, растворе сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Через 4 ч вводят 42 Р-меченый олигонуклеотид и гиб-. ридизацию продолжают в течение ночи при

42 С, Негибридизованный зонд удаляют в . результате последовательного промывания при 37 Св 2х SSPE-буфере и 0,17 . растворе

ДДС натрия (SDS).

Из скриннированных 1,5 х 10 клонов 2 клона дают положительные радиоавтографические сигналы после экспозиции в течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состояния повторными циклами Очистки, используя вышеуказанный олигонуклеотид в качестве гибридизационного зонда.

Два клона, которые выделены, клоны 1 и 29 ФРЭК, анализируют более детально.

При переваривании с Е. coRI в клонах 1 и 29 обнаруживают кДНК-вставки длиной 2,2 кб и 0,3 кб соответственно. При ник-трансляции клонированной кДНК и последующем ее испольэовании в качЕСтвв радиомеченого зонда в блот-гибридизации по Саузерну об1804480 наруживают, что клоны 1 и 29 представляют альфа-ФРЭК идентична аминокислотной собой связанные и перекрывающиеся кло- последовательности, выведенной из послены. довательности нуклеотидов клонов 1 и 29

Болеедетально клоны 1 и 29анализиру- лямбда ФРЭК, Полная гомология между ют по следующей методике, Конструируют 5 двумя указанными видами, как установлено, два дополнительных олигонуклеотида на составляет более 95, основе аминокислотной последователь- При Northern-блат-анализе устанавлиности бычьего ФРЭК, Указанные олиго- вают, что мРНК ФРЭК представляет вид нуклеотиды конструируют на основе единичной молекулы, которая мигрирует таких же подходов, которые используют 10 вместе с 28 S pPHK. С учетом допускаемой при конструировании олигонуклеотида, погрешности в расчетном размере 28 5 применяемогодля выделения клонов 1 и29. рРНК приблизительный размер мРНК

Эти два нуклеотида, а также олиго(бТ)щ ра- ФРЭК составляет 4,8 +1,4 кб. Последовадиоактивно метят в киназной реакции, как тельности, кодирующие зрелые формы как указано выше, и затем используют в качест- 15 альфа-, так и бета-ФРЭК, закодированы в ве гибридиэационных зондов в блот-анэли- пределах клонов 1 и 29 ФРЭК, которые вмезе по Сауэерну. Полученные данные этого сте имеют размер примерно 2,3 кб. Таким анализа показывают, что кДНК-вставка образом, указанные данные демонстриру0,3 кб клона 29 гибридизуется с I u II олиго- ют, что область 5 и фланкирующая последонуклеотидами ФРЭК, а не с III или олиго(бТ)1- 20 вательности, кодирующие ФРЭК. довольно

8-нуклеотидами; кДНК-вставка 2,2 кб клона протяженные (примерно 2,5 «-1,4 кб).

1 гибридизуется с I, II, 1!! олигонуклеотида- Из клонов 1 и 20 вырезают кДН К-вставми, а также с олиго(бТ)1э-нуклеотидом. ки посредством гидролиза Е coRI и субклоИз этих данных и последующего опре- нируют в pv08 у сайта Е coRI. Плазмиду, деления нуклеотидной последовательности 25 сконструированную из клона 1, обозначают клонов 1 и 29 видно, что 3 -конец клона 1 как pDH 13, а плазмиду, образованную из заканчивается поли(А)-хвостом, При гибри- клона 29, как pD Н14, Указанные плазмиды дизации клона 1 с олигонуклеотидом III депонируют в Американской коллекции тиФРЭК, которая происходитнаосновевыре- повых культур, 12301 Parklawn Drive, :-эания цианогенбромидом продукта бычьего 30 Rockvlll АТСС 20852. Плазмиде из клона 1, ФРЭК, а также с олиго (dT)te-нуклеотидом то есть pD Н15, присваивают номер ATCC указанный клон, как предполагают, включа- 53336, а плазмиде из клона 29, то есть pD ет оставшуюся кодирующую последователь- Н14; — ATCC 53335. ность для альфа- и. бета-форм ФРЭК, а Таким образом, указанный пример также длинную (более 1 кб) 3 -концевую 35 представляет экспериментальные методифланкирующую последовательность. ки, которые предусматривают получение

Из клонов 1 и 29 выделяют кДНК-встав- фактора роста эндотелиальных клеток челоки, субклонируют в М13 р18, а открытую века, не содержащих других белков человерамку считывания, кодирующую ФРЭК, и .ческого происхождения. .фланкирующиеся области секвенируют по 40 ФРЭК применяют для выращивания и методу терминации цепи. При анализе нук- амплификациии эндотелиальных клеток в леотидной последовательности обнаружи- культуре. В настоящее время ФРЭК, исвают открытую рамку считывания из 464 пользуемый для выращивания клеток, зкснуклеотидов, кодирующую ФРЭК человека. трагируют из бычьего мозга. Этот

Установлено, что 155 аминокислот ФРЭК 45 неочищенный бычий ФРЭК является миточеловека фланкированы кодонами блоки- геном эндотелия аллантоисной вены челоровки трансляции. Аминокислотой с конце- века. Использовайие гепарина с ФРЭК и вой ИН2-группой бета-ФРЭК человека, матрикса на основе фибропектина позвовыделенной из кДНК-последовательности, ляет получить стабильные клоны эндотелиявляется метионин, который, по всей веро- 50 альных клеток. Рекомендуемая концентрация ятности, выступает в качестве остатка ини- сырого бычьего ФРЭК для использования циации трансляции. На основе указайных в качестве митогена in vitro составляет данных, а также с негидрофобной приро- 150 мкг на мл питательной среды. дой первых 15 — 20 аминоконцевых остат- Рекомбинантный ФРЭК человека, полков высказывается предположение, что 55 ученный таким образом, пригоден в качестбета-ФРЭК человека синтезируют без сиг- ве замены бычьего неочищенного ФРЭК нального пептида с концевой NHz-группой. при культивировании in vitro зндотелиальАминокислотная последовательность с кон- ных клеток человека и других мезенхимных цевой аминогруппой бычьего бета-ФРЭК, клеток для научных исследований. Полагарасщепленная трипсином. а также бычьего

1004480

10 моноклональными антителами v>,>«>«. Doc»p инкубации и нескольких промывок прибавляют связанные пероксидазой IgG мыши с антителом из кролика. Реакционный продукт квантируют спектрофотометрически после конверсии 0-фенилендиамина в присутствии перекиси водорода. Аналогичный иммуноанализ можно использовать для установления дозировки ФРЭК в зависимости

РЭК-продукт пригоден в качестве стандартного реагента для количественного определения-,неизвестных образцов Ф РЭ К.

ФРЭК также может быть потенциальным средством при лечении поврежденных или для регенерации кровяных сосудов или

15 других строений организма с покровом эндотелиальных клеток.

Формула изобретения

Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в

Escherichia colI, заключающийся в том, что выделяют нРНК из вытяжки ствола мозга человека, получают из мРНК поли(А+)мРНК, 25 синтезируют кДНК с помощью указанной мРНК, колонируют кДНК в вектор лямбда gt

10 или лямбда gt 11, отбирают клоны кДНК, кодирующие митогенный белок эндотелиных клонов с олигонуклеотидной пробой, имеющей следующую нуклеотидную последовател ьность:

АТТ ТТТ СС! GAT GGI ACI GTI GAT GGI

ACI ААА, субклонируют кДНК из отобранных клонов в плазмиду pU С8, выделяют плазмидные

40

Составитель Н. Кузенкова

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор H. Гунько

Редактор

Заказ 1071 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при.ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент"; г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 ют, что активность ФРЭК человека в условиях роста эндотелиальных клеток такая же или превосходит активность бычьего ФРЭК вследствие высокой гомологии в аминокислотных последовательностях обоих белков.

Предполагаемый предел эффективной дозы для усиления клеточного деления и роста In

vItro составляет 5 — 10 нг очищенного ФРЭК на 1 мл питательной среды.

Рекомбинантный ФРЭК человека также пригоден для активации клеточного роста в протезном приспособлении, а не в склянке или колбе для культивирования тканей. Это приспособление может быть покрыто или не покрыто другими молекулами, которые должны способствовать прикреплению эндотелия к указанному устройству. Такие молекулы могут включать белки с внутриклеточным матриксом (например, фибронектин, ламинин или один из коллагенов), человеческий сывороточный альбумин гепарин или другие гликозамингликаны или инертные органические молекулы.. Эндотелиальные клетки культивируют на этих поверхностях с использованием эффективных доз ФРЭК в питательной среде. покрывая их монослоем эндотелия. В результате этого получают поверхность, предупреждающую образование тромбов в приспособлении для протезирования, тем самым уменьшая опасность возможных случаев закупорки тромбами, которые угрожают жизни, вследствие имплантации этих протезов, Так, разработан иммунологический анализ с помощью двойного антитела для бычьего ФРЭК. В этом анализе 96-луночные планшетки из поливинилхлорида покрывают антиФРЭК кролика и остающиеся участки связывания затем блокируют, используя

10 . стандартную сыворотку кролика. Далее образцы ФРЭК вводят в лунки и инкубируют. После промывки прибавляют ФРЭК с

10 от состояния болезни, которая воздействует на рост эндотелиальных клеток, Очищенный

30 альных клеток путем гибридизации указан,ЦНК pDH14 и pDH15,трансформируют полученными ДН К штамм-реципиент с последу- . ющим отбором трансформированных клонов и индукцией экспрессии целевого белка.