Штамм гриба aspergillus аwамоri - продуцент внеклеточной @ - глюкозидазы

 

Использование: биотехнология, может быть использовано в фармацевтической и эфиромэсличной промышленности. Сущность изобретения: штамм Aspergillus awamorl 18 выращивают в пробирках со скошенным сусло-агаром в течение 5 сут при температуре 30°С и 7 сут при комнатной температуре. Полученным споровым материалом засевают питательную ферментационную среду следующего состава, %: жом 30; солодовые ростки 1,0; ( 0,7; MgS04 0,05; КНаРО 0,1, рН среды естественный . Культивирование микроорганизмов производят в колбах емкостью 750 мл на круговой качалке - 180 об/мин при температуре 30°С в течение 3 сут. Активность /3-глюкозидазы 5,0 ед/мл культуральной жидкости, Активность в сухом препарате 3600 ед/ч (на п-нитрофенил-гликозиде). 1 табл.

СОЮЗ СОВЕ ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (эцио С 12 N 9/42, 1/14

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

leo

С о ! э аеЬ

О (21) 4954980/13 (22) 07,06.91 (46) 30.03.93, Бюл, fU 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Р.В,Зуева, Н M.Ïàâëîâà, Г.Н.Румянцева, P,Í.Ãðåi;:,u ова, В.П.Кременцова, Н.В,Слуянова и J!.М.Дем. Нв (73) Научно-производствен ое оГ». единение

"Биотехнология" (56) Васильева Н,В, и др, Характери...ика целлюлозного и гемицеллюлозного комплекса Geotrichum candldum шт. Çc и мутантного штамма Geotrichum candidum Зс106. Прикладная биохимия и микробиология, т, 23, вып. 3, 1987, с 349- 359, (54) LLI TAMM ГPI4EA ASP ERG ILLUS

AWAMORI — ПРОДУЦЕHT ЬНЕКЛЕТОЧНОИ .ф-ГЛ ЮКО3ИДА3 Ц

Изобретение относится к биотехнологии, Способность синтезироватьР-глюкозидазу наблюдается у многих микроскопических грибов.

Цель изобретения — получение более активного по сравнению с прототипом штамма,В-глюкоэидазы, катализирующего гидролиэ Р-гликозидных связей в структуре гликозидов — предшественников лекарст венных веществ. В нашей стране до настоящего времени иэ-за отсутствия продуценга нет промышленного производства этого фермента.

Штамм был получен путем индуцированной селекции штамма Aspergillus

awamori 16- продуцента пектинаэы в поверхностных условиях, содержащего в незначи„„533„„ 1806194 АЗ (57) Использование: биотехнология, может быть использовано в фармацевтической и зфиромасличной промышленности. Сущность изобретения: штамм Asperglllus

awam0rI 18 выращивают в пробирках со скошенным сусло-агаром в течение 5 сут при температуре 30 С и 7 сут при комнатной температуре. Полученным споровым материалом засевают питательную ферментационную среду следующего состава, ь: жом

3 0; солодовые ростки 1,0; (NH4QSO4 О,?;

Mg5O4 0,05; КН РО4 0,1, рН среды естественный, Культивирование микроорганизмов производят в колбах емкостью 750 мл на круговой качалке — 180 об/мин при температуре 30 С в течение 3 сут. Активность

Р-глюкоэидазы 5,0 ед/мл культуральной жидкости, Активность в сухом препарате 3600 ед/ч (на и-нитрофенил-гликозиде). 1 табл. те:.ь:x количествах, /" глюкозидаэу.

Прсдл;.> " мый штамм А. р av аглог ВКГ1М

i=-590 отличается от иэве:;тн . п одуцен ов

Высокой продуктивностью P глюкозидаэа

Штамм кул тивируют в глубинных условиях на жидкой итательной среде. Активность

-глюкоэидаэы определяют на сгандар ном субстрате л-нитрофенил P-D-глюкопиранозиде с молекуляр ий массой 301,3. Модификация метода предложена ВНИИ

"Биотехноло, я .

За единицу ак гивности принято количество высвобадившеися глюкозы в мкмолях. в те«ение 1 мич. при оптимальных условиях гидроли.-.: (рН 4.7, температуры 40 С).

Культуоальнь е признаки, На су ло-arape на 5-е сутки роста при

30 С диаметр колоний 7,0-7,5 см. Колония

1806194 круглая, с правильными ровными краями.

Различаются 2 ярко выраженные зоны: широкая эона серого цвета и примыкающая к ней узкая зона белого цвета, В центре колоний наблюдается небольшой бугорок, усеянный конидиями коричневого цвета, На обратной стороне колонии наблюдается радиальная civiàä÷àòoñòü, особенно в центре колонии, На эгаризованной среде Чапека диа- "0 метр колонии на 7-е сутки роста 2,5 — 3,0 см, Колония с неровными краями, поверхность колонии пушистая, в центре коричневого цвета, а по краям колония окантована бело-желтой полосой, Наблюдается крупная складчатость радиусом, На обратной стороне колонии ярко выраженная складчатость.

На агэриэованной среде Ваксмана колония размером 5,0-6,0 см, пушистая, в цен- 20 тре коричневого цвета. Периферическая часть колонии бело-желтого цвета, Складчатость отсутствует на обеих сторонах поверхности, Края колонии неправильной формы.

Морфологические признаки. 25

Мицелий сильно раэветвлен, извилист, имеет вид тонких сепарированных гиф, Клетки короткие, толстые. Диаметр конидиеносцев 7 — 17 мк, Морковный агар; колония светлого цве- 30 та, с ровными краями, с сильной радиаль ной складчатостью. Диаметр колонии 4,06,0 см.

Синтетическая агаризованная среда: небольшие колонии светлого цвета, Диа- 35 метр колонии 2,0-3,0 см. Складчатость отсутствует.

Нитраты восстанавливает.

Температурные границы развития: при 20 С вЂ”; 40 при 30 С вЂ” рост хороший; при 40 С вЂ” рост слабый; при 50 С вЂ” рост очень слабый.

Физиолого-биохимические признаки.

Рост на молоке: молоко пептонизирует. 45

Желатину разжижает.

Рост на ломтиках картофеля. обильный, с хорошим спороношением. Декстрины, крахмал, сахэрозу, лактозу, мальтозу, глюкозу, маннит, глицерин потребляет, Пример 1. Штамм Asp. awamorl ВКПМ

F-590 выращивают в пробирках со скошенным сусло-агаром в течение 5 сут. при тем-. пературе 30 С и 7 сут. при комнатной, температуре, Полученным споровым материалом засевают питательную ферментативную среду следующего состава,,: жом

3,0; солодовые ростки 1,0; (NKn)zSOn 0,7;

MgS0n 0,05; KHzPOn 0,1, рН среды естественный, Культивирование микроорганизмов проводят в колбах емкостью 750 мл на круговой качалке — 180 об/мин. при температуре 30" С в течение 3 сут. Активность

Р-гл ю козидазы 5,0 ед/мл культу рэл ь ной жидкости.

В таблице приведена сравни1ельная характеристика ферментативной активности предлагаемого штамма Asp. awamori ВКПМ

F-590 и известного, Установлено, что штамм

Asp. awamori ВКПМ F-590 обладает большой продуктивностью и его использование рентабельно для промышленности, Пример 2. Культуральную жидкость получают, как описано в примере l. Из культуральной жидкости методом спиртоосэждения получают фермен1ный препарат

-глюкозидазы. Нэ 1 объем культуральной жидкости расходуется 3,5 обьема спирта (96%) Препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре. Выход сухого ферментного препарата — 0,6%. Активность в сухом препарате 3600 ед/г (на п-нитрофенил-гликозиде), Раствор ферментного препарата готовят из расчета 5 мгlмл, Пример 3, То же, что в примере 2, но в качестве субстрата используют ланэтоэид

А, полученный из наперстянки (дезацетилированная форма), — отходы производства целанида. Концентрация раствора субстрата — 1 мгlмл, Гидролиз проводят при рН 4,7, температуре 40 С. Длительность гидролиэа — 22 ч. Определение активности проводили глюкоэооксидантным методом. За единицу активности приняли количество ферментного препарата, необходимого для получения 1 мкМ глюкозы за 1 мин. при указанных параметрах гидролизэ. Активность на данном субстрате 0,40 ед/г.

Продукты гидролиза, обладающие фармацевтическим действием (агликоны), определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol (ф. Kavalier, Czechoslovakia), Гидролиз дезацетилированного лэнэтозида А прошел полностью до конечных продуктов: дигитоксина, дигоксина и гитоксина, которые после соответствующей очистки представляют собой лекарственные препараты — сердечные гликоэиды, Формула изобретения

Штамм гриба Asperglllus awamori ВКПМ

F-590 — продуцент внеклеточной /3-глюкозидаэы, 1806194

Штамм

ПМ F-590

Мир зс(п эототигф

Составитель P. Зуева

Техред М.Моргентал Корректор М, Керецман

Редактор

Производственно-иэдагельский комбинат "Патент". г. Ужгород, yn,Гагарина, 101

Закаэ 965 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5