Способ выделения амилазы из препарата амилоризин

 

Использование: медицина и фармацевтическая промышленность для получения чистых препаратов. Сущность изобретения: змилоризин растворяют в 0,05 М универсальном буфере с рН 3,5. Из раствора удаляют протеазы биоспецифической очисткой. Для этого вносят 30-40 мг/мл сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, инкубируют смесь 15-20 мин при 4-6°С. Затем проводят осаждение амилазы сульфатом аммония и ее очистку ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Удельная амилолитическая активность препарата 3615 едУмг белка выход по активности 92%.

союз сОВетских (ОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИК (5!)5 С 12 М 9/30

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4883636/13 (22) 03.10.90 (46) 07.04,93. Бюл. М 13 (71) Ташкентский государственный университет им. В.И.Ленина (?2) Ш.С.Ташмухамедова, Х.T.Õàñàíîâ и

M.Ì.Ðàõèì0â (56) Авторское свидетельство СССР

hh 1214755, кл. С t2 N 9/28, 1983. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АМИЛАЗЫ ИЗ

ПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН (57) Использование:медицина и фармацевтическая промышленность для получения

Изобретение относится к технической биохимии и биотехнологии, а именно к способам очистки ферментов, и может быть использовано в медицине и фармацевтической промыщленности для получения чистых препаратов.

Цель изобретения — ускорение и упрощение способа и повышение активности целевого продукта.

Изобретение заключается в том,.что амилазу перед осаждением сульфатом аммония центрифугируют, а затем подвергают иоспецифической очистке н сорбенте с инкубацией в буферном растворе.

Для биоспецифической очистки используют сорсилен импрегнированный сывороточным бычьим альбумином, биоспецифическую очистку проводят с использованием 0,05 M раствора универсального буфера с рН 3,5, инкубацию проводят в течение 20-30 мин при 4-6"С.

Новым в предлагаемом изобретении является применение биоспецифического раз„„5Q „„1807080 А1 чистых препаратов. Сущность изобретения: амилоризин растворяют в 0,05 M универсальном буфере с рН 3,5. Иэ раствора удаляют протеаэы биоспецифической очисткой, Для этого вносят 30-40 мг/мл сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, инкубируют смесь 15-20 мин при 4-6 С. Затем проводят осаждение амилазы сульфатом аммония и ее очистку ионообменной хроматографией на

ДЭАЭ-целлюлозе. Удельная амилолитическая активность препарата 3615 ед/мг белка выход по активности 92;ь. мчи деления в качестве первой стадии очистки, позволяющей полностью избавиться от примесей протеаз;

Существенные отличия способа заключаются в четырехстадийном получении амилазы (вместо пяти стадий).

° едем

Пример 1. Готовят 150 -ный раствор QO ферментного препарата амилазы О

Aspergittus oryzae из амилоризина Г10х в 0,1 с (M в универсальном буфере рН 3,5. Нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин и к супернатанту добавляют сорсилен, импрегнированный бычьим сывороточным альбумином {БСА) до конечной концентрации Мак

30-40 мг/мл. После 20 мин инкубации при mash

4-6 С смесь центрифугируют и отделяют супернатант. Затем ферментный раствор подвергают высаливанию 807, сульфатом аммония от насыщения и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлю- лозе. Сорсилен. импрегнируеи(ый альбумином, получают по известной мето1807080 аемый способ

Показатель

21,5 час

-15 — 20

10 час

90

300

3615,0

30,0

195,0 следы

0,065

92

1,0

82

3,2 дике, Степень очистки составляет 120 раэ.

Удельная амилазная активность 289220 ед,/t

Пример 2. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена - БСА составляет 10 мг/мл. Степень очистки составляет 40 раэ. Удельная амилаэная активность 96120 ед./r.

Пример 3. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена, импрегнированного БСА, составляет 20 мг/мл. Степень очистки составляет 80 раз, Удельная активность 192210 ед./г.

Пример 4. Все операции проводят, как в примере 1, но конечная концентрация сорсилена в импрегнированном БС А составляет 50 мг/мл. Степень очистки составляет 110 раэ. Удельная амилазная активность 264330 ед./r, Пример 5. Все операции проводят, как в примере 1. с использованием 0,03 M универсального буфера. Степень очистки составляет 100 раз, Удельная амилазная активность 240300 ед./г.

Пример 6. Все операции проводят, как в примере 1, но с использованием 0,1 M универсального буфера. Степень очистки составляет 110 раз. Удельная амилаэная активность 264330 ед./r.

Пример 7. Все операции проводят, как в примере 1, инкубацию в универсальном буфере проводят в течение 10 мин, Сте1. Длительность процесса

2. Число стадий

3. Температура проведения процесса, С

4, Содержание белка в целевом продукте, 5. Активность по ГОСТ

20264.4-74, ед/г

По Бернфельду, ед/мг

6, Остаточная протеолитическая активность

ГОСТ 20264, 2-74, ед/г по Ансону, ед/г

7. Выход: по активности, по белк, пень очистки составляет 100 раз. Удельная активность 240300 ед./c.

Иэ представленных выше примеров видно, что оптимальными условиями для

5 удаления протеиназ являются: инкубация с биосорбентом при концентрации последнего 30-40 мг/мл в буфере ионной силой 0,05

М в течение 15-20 мин.

В таблице представлены сравнительные характеристики полученной амилазы.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: сокращается число операций, повышается степень очистки, снижается протеазная ак15 тивность, Формула изобретения

Способ выделения амилазы иэ препарата амилоризин, предусматривающий растворение сырья, удаление протеолитиче20 ских ферментов из раствора, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и его очистку, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью ускорения и.упрощения способа и повышения активности целевого продукта, раство25 рение сырья ведут в 0,05 М универсальном буфере с р Н 3,5, удаление протеолитических ферментов иэ раствора осуществляют добавлением сорсилена, импрегнированного бычьим сывороточным альбумином, до кон30 центрации 30-40 мг/мл с последующим инкубированием смеси в течение 15-20 мин при температуре 4-6 "С, а очистку целевого продукта проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Способ по авт. св. N 1214755