Способ получения рекомбинантной плазмидной днк рсдус 2.27, кодирующей гликопротеин межклеточной адгезии

 

Использование: получение гликопротеина межклеточной адгезии (JCAM-2). Сущность изобретения: из стимулированных эндотелиальных клеток пупочной вены выделяют ДНК, клонируют ее в векторе CDM8, трансфецируют в клетки COS, клетки отбирают на пластинках, покрытых антителом с лимфоцитарной функцией в присутствии JCAM-1-антитела, из отобранных клеток выделяют целевую плазмиду pCDIC 2.27.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/06

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

О

О

СО (лЭ

1 (21) 4743552/13 (22) 07.03.90 (46) 15,04,93. Бюл. N 14 (31) 321238 (32) 09.03.89 (33) US (71) Сентер фор Блад Рисерч Инк. (US) (72) Тимоти Алан Спрингер, Майкл Лоран

Дастин и Дональд Стэунтон (US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pCDJC 2.27,-КОНастоящее изобретение относится к способу получения новых веществ, имеющих большое значение в качестве биологически активных веществ (либо функционального, либо структурного типа), в частности, производного гликопротеина или его функционального производного, которое представляет собой молекулу межклеточной адгезии (обозначаемого в дальнейшем

"J САМ-2"), Молекулы межклеточной адгезии участвуют в процессе, в соответствии с которым происходит распознавание популяций лимфоцитов и адгезии к клеточным субстратам" таким образом, что они могут мигрировать к центрам раздражения и взаимодействовать с клетками в процессе реакции раздражения. Для этого, чтобы они могли действовать, необходимо наличие указанных рецепторов — молекул межклеточной адгезии на поверхности клеток лимфоцитов, Указанные рецепторы обладают способностью осуществлять адгезию лимфоцитов к

„„ЫЛ„„1809837 АЗ

ДИРУЮЩЕЙ ГЛИКОПРОТЕИН МЕЖКЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ (57) Использование: получение гликопротеина межклеточной адгезии (JCAM-2), Сущность изобретения: из стимулированных эндотелиальных клеток пупочной вены выделяют ДНК, клонируют ее в векторе CDM8, трансфецируют в клетки COS, клетки отбирают на пластинках, покрытых антителом с лимфоцитарной функцией в присутствии

JCAM-1-антителэ, из отобранных клеток выделяют целевую плазмиду pCDIC 2,27, 1 другим лейкоцитам или к эндотелиальным и прочим клетками несосудистого характера, Молекулы межклеточной адгезии представляют собой лиганд природного типа, связанный с молекулами рецептора, например, молекулами семейства гетеродимера ЛФА1 (связанный с лимфоцитарной функцией антиген-1).

Способ получения молекул рекомбинантной ДН К, кодирующей J CAM-2, состоит в получении библиотеки, кодирующей ДНК

JCAM-2, с использованием плазмидного вектора CDM8. Полученную библиотеку используют для трансфакции клеток COS, которые обычно не экспрессируют JCAM-2.

Трансфецированные клетки вводят в контакт с пластинками, покрытыми связанным с лимфоцитарной функцией антигеном 1 (ЛФА-1) в присутствии антитела типа антиJCAM-1, клетки, адгезированные нэ ЛФА-1, удаляют и культивируют, после чего выделяют плазмиду pCDJC 2.27.

1809837

Указанную плазмиду используют для продуцирования JCAM-2 или его функционального производного, или его части согласно любому известному способу, JCAM-2, его функциональное производное или его часть предпочтительно используют в качестве противовоспалительных средств, Функциональные производные JCAM-2 представляют собой соединения, обладающие биологической активностью (функциональной или структурной), практически аналогичной биологической активности

J CAM-2.

Пример 1, Клонирование ДНК, кодирующей J САМ-2.

ЛФА-1 получают очисткой из лизата

SKW-3 с использованием метода- иммуноаффинной хроматографии на сефарозе TS2/4-ЛФА-1 моноклональное антитело, элюирование осуществляют при рН-11,5 в присутствии 2 мМ хлористого магния и 1о октилглюкозида. Л ФА — 1 (10 мкг/200 мкл/6 см пластинку) наносят на бактериологические чашки Петри посредством разбавления октилглюкозида до 0,1 в фосфатно-солевом буферном растворе с 2 мМ хлористого магния и инкубирования при

4ОС в течение ночи. Пластинки блокируют посредством 1% бычьего сывороточного альбумина и хранят в смеси фосфатного буфера (2 MM хлористого магния, 0,2 бычьего сывороточного альбумина, 0,025 азида, 50 мкг/мл гентамицина), Синтез библиотеки, кодирующей ДН К из стимулированных липополисахаридами эндотелиальных клеток пупочной вены, осуществляют. в соответствии с известными методиками. После синтеза второй спирали кодирующую ДН К связывают с Bst X1-адапторами и выделяют ДНК, содержащую более 600 пар оснований с использованием метода электрофореза на агаровом геле при низкой температуре плавления, Затем ДНК связывают с СОМ8, вводят в используемый в качестве хозяина Е. Coll MC-1061/P3 и наносят на пластинки, получая 5 х 10 колоний, Колонии переводят в суспензию в LB. среде, объединяют и получают плазмиду с использованием обычного метода щелочного растворения (лизиса). Пластинки с клетками COS подвергают трансфекции плазмидной ДНК с использованием смеси

ДЭАЭ-декстрана. JCAM-2 является рези- стентным по отношению к трипсину на эндотелиальных клетках и клетках SKW-З.

Клетки COS спустя 3 суток после трансфекции суспендируют посредством обработки

0,025 трипсина, 1 мМ ЭДТА, HBSS и помещают на покрытые ЛФА-1 пластинки в соответствии с известным методом меченых

51

Cr клеток COS. Адгезированные клетки высвобождают посредством доведения концентрации ЭДТА до 10 MM.

Плазмиду выделяют из адгезированных

5 популяций клеток COS с использованием среды Хирта, Полученной плазмидой трансформируют штамм Е. coll MC-1061/РЗ. колонии на пластинках суспендируют в

LB-среде, объединяют и выделяют плазми"0 ду посредством щелочного лизиса. Селекцию связывающихся с Л ФА-1 трансфецированных клеток COS и выделе ние плазмиды повторяют в ходе еще двух циклов, Объединенные колонии, получен15 ные после третьего цикла, выращивают до насыщения в 100 мл среды с 18 мкг/мл тетрациклина и 20 мкг/мл ампициллина, Плазмиду получают, фракционируют путем гель-электрофореза с 1 -ной LMP- aãàðîçîé

20 и трансформируют в штамм МС-1061/P3 отдельно каждую плазмиду из 9 фракций различного размера, Индивидуальные плазмиды из фракции с наибольшей активностью в отношении адгезии клеток COS к

ЛФА-1 исследуют на предмет размера вставки путем расщепления Xba1 и тестируют на адгезионную способность, В результате получают плазмиду со вставкой. кодирующей ДНК JCAM-2 размером1,1 тыс.

30 оснований (pCDJC 2.27), Плазмиду JCAM-2 типа pCDJC 2.27 или конструкцию JCAM-1, содержащую фрагмент Sall-Крп1 размером 1,8 тыс, оснований в CDM 8 (2 мгк/10 см пластинку) вводят в клетки СО$, используя смесь ДЭАЭ-Декстран. Клетки COS суспендируют в смеси

0,025% трипсина, 1 MM ЭДТА через 3-ое суток после тоансфекции и метят Cr, При5 мерно 2 х 10 клеток COS, меченых 5" Cr в 2

40 мл фосфатного буфера, содержащего 5 сыворотки плода коровы, 2 мМ хлористого магния, 0,025% азида (буфер) с 5 мкг/мл моноклональных антител, инкубируют на покрытых ЛФА-1 пластинках размером 6 см

45 в течение 1 часа при 25 С. Несвязавшиеся клетки удаляют посредством осторожного покачивания и траекторной промывки буфером, Связавшиеся клетки элюируют, добавляя ЭДТА до концентрации 10 мМ, и

50 определяют радиоактивность.

J CAM-1 экспрессируют 25 трансфецированных клеток COS. После промывки несвязанные клетки обеднены клетками

JCAM-1+, тогда как адгезированные клетки, г5 высвобождаемые из покрытого ЛФА-1 пластика, практически полностью представляют собой разновидность JCAM-1+, Адгезия клеток JCAM-1+ к покрытому ЛФА-1 пластику ингибируется моноклональными антителами RR 1-1 JCAM-1. Покрытые ЛФА-1 слои

1809837 чашек Петри стабильны после более чем 5 циклов адгезии клеток COS и их элюирования посредством ЭДТА, пластинки хранят до использования при 4 С в присутствии ионов Мц +, 5

Для клонирования JCAM-2 получают из эндотелиальных клеток библиотеку плазмидного вектора CDM 8, она демонстрирует наличие как зависимых от JCAM-1, так и независимых от JCAM-1 компонентов адге- 10 зии, зависящей от ЛФА-1. Трансфецированные клетки COS инкубируют в покрытых

ЛФА-1 чашках Петри при наличии моноклональных антител JCAM-1 для предотвращения выделения кодирующей ДНК JCAM-1. 15

Адгезированные клетки элюируют ЭДТА, а плазмиды выделяют и амплифицируют. После трех циклов трансфекции, адгезии, выделения плаэмиды и фракционирования по размерам, 30 плазмид анализируют с ис- 20 пользованием рестрикционной эндонуклеазы. Из трех плазмид со вставкой более 1,0 тыс. пар оснований (т.п,о,) одна, введенная в клетки COS посредством трансфекции, обуславливает адгезию по отношению к,25

Л ФА-1.

Пример 2. Характеристика последовательностии, кодирующей ДН К J САМ-2.

Последовательность кодирующей ДНК

JCAM-2 размером 1052 пар оснований (п.о,) ЗО содержит нетренслированные зоны 5 (62 пары оснований) и 3 (167 пар оснований).

Сигнал полиаденилирования ААТАСА в положении 1019 продолжается в положении

1058 пар оснований поли(А)-концом. Самая 35 длинная зона открытой рамки считывания начинается с первой последовательности

ATG в положении 63 и заканчивается последовательностью кодона терминации TAG в положении 885, 40.

Последовательность содержит от 1-й аминокислоты до 201-й внеклеточный домен, за которым следует 26 остатков, составляющих гидрофобный трансмембранный домен, и 26 остатков, составляющих 45 циклоплазматический домен. Альфа-спиральный трансмембранный сегмент содержит остатки треонина и серина, остающиеся по одну сторону, что позволяет предполагать возможность самоассоциа- 50 ции или ассоциации с другими мембранными белками в плоскости мембраны, Цитоплазматический домен носит основной характер. в среднем гидрофобного характера. Масса зрелого полипептида равна 28 55

176 дальтонов, что, в случае, если используется N-связанных сайтов гликозелирования, должно привести к гликопротеину

JCAM-2 массой примерно 46 килодальтонов.

Пример 3. Анализ гибридизации ДНК и PHK.

Для блотинга используют 6 мкг (поли (А) РНК, которую денатурируют, подвергают электрофорезу в 1 -ном агарозном геле с формальдегидом, переносят на нейлоновую мембрану, Полнота переноса подтверждается просвечиванием геля

УФ-излучением и флуоресцентным фотографированием блата.

Геномные ДН К гидролизуют с пятикратными по сравнению с рекомендациями изготовителя количествами эндонуклеаз

EcoR1 и Hindlll. После электрофореза в

0,8 -ном агарозном геле ДНК анализируют, Блоты РНК и ДНК предгибридизируют и гибридизируют в соответствии со стандартными методиками, используя кодирующие

ДН К J CAM-2 или J CAM-1, меченые (РlбХТР, ДНК, кодирующая JCAM-2 размером 1,1 т,п.о, гибридизируется с поли(А) мРНК размером 1,4 т.о. и слабо- с мРНК размером 3 тыс, оснований, в отличие от мРНК JCAM-1 размером 3,3 и 2,4 тыс. оснований. мРНК

JCAM-1 четко индуцируется в эндотелиальных клетках липополисахаридами, Напротив, MPHK JCAM-2 дает сильную базальную экспрессию в эндотелиальных клетках и более не индуцируется липополисахаридами. мРНК JCAM-2 содержится в широком круге разновидностей клеток, включая линии клеток лимфобластоидов Рамос и

BBNB, моноцитов U-937, и лимфобластоидов SKW3; о чем свидетельствует средняя или большая продолжительность выдержки на автодиаграмме. Из числа перечисленных выше видов клеток SKWÇ, U-937 и ВВNВ проявляют зависимую от ЛФА-1, независимую от JCAM-1 адгезию к клеткам ЛФА-1+, и к пластине, покрытой ЛФА-1. Линия клеток эпителия Hela, которая проявляет только наличие зависимого от J CAM-1 компонента адгезии, не обйаруживает мРНК J CAM-2 даже после продолжительной экспозиции авторадиограммы, Расп ределение клеток JCAM-2 таким образом соответствует независимому от J CAM-1 компоненту адгезии.

Блоттинг геномной ДНК, гибридизованной с ДНК, кодирующей JCAM-2, обнаруживает единственный доминантный фрагмент

EcoR I размером 8,2 т,п.о. и фрагмент Hind

ill размером 14 т,п.о., предполагая наличие единичного гена с большей частью кодовой информации в пределах 8 т.п,о.

Пример 4. Сравнение последовательностей аминокислот JCAM-1 и.iCAM-2.

Вследствие их функциональной близости как лигандов ЛФА-1. последовт-ельно1809837 сов. которые вызывают 50 обычных простуд. JCAM-2 может также функционировать в качестве рецептора риновирусов или других пиконавирусов. Таким образом его можно испольэовать в терапевтических целях для подавления инфекции, вызываемой указанными вирусами

Формула изобретения

Способ, получения рекомбинантной плазмидной ДН К р С 03 G 2,27, кодирующей гликопротеин межклеточной адгезии, заключающийся в том, что из стимулированных эндотелиальных клеток пупочной вены выделяют ДНК, клонируют ее в векторе

CDM8, трансфецируют в клетки COS, отбирают их на пластинках, покрытых антителом с лимфоцитарной функцией в присутствии анти-JCAM-1-антитела, из отобранных клеток выделяют целевую плаэмиду pCDJC

2.27.

Составитель Т.Забойкина

Редактор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор Т,Вашкович

Заказ 1296 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 сти аминокислот JCAM-1 и JCAM-2 имеют более общие черты. JCAM-1 является членом семейства иммуноглобулина, и его внеклеточный домен полностью состоит из пяти С-аналогичных доменов. Внеклеточный домен JCAM-2 иэ 201 аминокислоты состоит из двух иммуноглобулиновых С-аналогичных доменов с предполагаемыми связанными дисульфидными связями цистеинами, отстоящими на 43 и 56 остатков, и с предсказанной структурой бета-спирали, Два иммунослобулиноподобных домена JCAM-2 идентичны на 34 в отношении последовательностей аминокислот с двумя наиболее N-терминальными доменами JCAM-1 при определенном по программе ALIGN среднеквадратичном отклонении от среднего, равном 15,.и на 27 идентичны доменам 3 и 4 J CAM-1 при определенном по программе АООМ среднеквадратичном. отклонении от среднего значения, равном 3.

Поиск с использованием запрограммированных без данных выявляет лишь частичную гомологию. доменов с прочими членами семейства иммуноглобулинов.

LCAM-2 на 17 и 19 идентичен двум йтерминальным доменам молекул адгезии

JCAM соответственно,,тогда как в случае

JCAM-1 идентичность составляет соответственно 19 и 20, JCAM-2 определяют с использованием селекции функциональной кодирующей

ДНК, которая не требует предварительной идентификации белков посредством биохимических или иммунологических методик.

Выделение ДНК, кодирующей JCAM-2, подтверждает существование альтернативного лиганда ЛФА-1. Распределение мРНК в случае JCAM-2 на ограниченном количестве клеток, которые характеризуются как зависимые по 1САМ-1 и независимые по

JCAM-1 в отношении ЛФА-1 адгезии, предполагает, что JCAM-2 соответствует всем наблюдаемым случаям независимой по

JCAM-1 и зависимой по ЛФА-1 адгезии.

Установлено. что JCAM-1 является рецептором для большой группы риновируСемейство лигандов ЛФА-1 подчеркивает важность этого направления распознавания, которое может служить механизмом для сообщения высокой специфичности и функциональных различий. На экспрессию

JCAM-2 не влияет цитокинез на клетках.

Трансфецированные JCAM-2 клетки COS свободно отходят от покрытого ЛФА-1 пластика. Это может быть обусловлено малыми размером JCAM-2, что делает его менее доступным для ЛФА-1 на искусственном субстрате, или различиями в последовательности. которые могут вести к различиям в аффин ности.

Отчетливые цитоплазменные домены

JCAM-1 и JCAM-2 могут передавать различные сигналы или могут вызывать различную локализацию на поверхности клетки, аналогичным образом, сигнализация или взаимодействие с цитоскелетом посредством

ЛФА-1, могут различаться в зависимости от того, связывается ли JCAM-1 или JCAM-2, Таким образом, JCAM-1 и второй контррецептор ЛФА-1, JCAM-2 представляют собой подсемейство иммуноглобулина (19).