Сополимеры n-винилпирролидона, кротоновой кислоты и @ - кротоноиламинофенола в качестве полимерной основы синтетического антигена, синтетический антиген на основе сополимеров n-винилпирролидона, кротоновой кислоты и @ - кротоноиламинофенола и способ получения синтетического антигена

 

Использование: при иммунологическом определении маркера онкологического риска - бензидин-белкового аддукта у людей. Сущность изобретения: сополимер формулы I - Сн2-сн сн-си сн-сн . -. нгсАс о снз Г n cl-Чн, он NH-O-он где m ««,5 моль%; п 7,6 моль%; 3,9 моль%. На основе сополимера I готовят антиген формулы II )m4CH-CH)n-fCH нгс к н.с H - - N N-fKrN N yf NH, f. -s -J.П / V-V I OH где m 88,5 моль°/0; n 6,6 моль%; I 3.9 моль%. Способ заключается в обработке 1 моля сополимера 1 2,0-2,2 молями сернокислого бензидиндиазония в водном растворе при 0-5°С при рН 4,2-4.6. Повторно обрабатывают при рН 9,0-9,4. 2 и 3 с.п. ф-лы, 1 табл. (Л

„„SU „„1812183 A l

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

< 115 С 08 F 226/10//(С 08 F 226: 10,220: 041

А 61 К 39/38 1Л65, 31Л9

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

""О- б г . в. )Д/., °

Изобретение относится к иммунохимии альбумину лошадиной сыворотки, сложным высокомолекулярных соединений, облада- смесям б лков, зритроцитам, бензидин в кающих антигенными характеристиками. честве гаптена, Изобретение может найти широкое ис- Способ получения такого антигена можпользование при иммунологическом опре- но представить совокупностью следующих делении бензидин-белковых аддуктов, оеакций. являющихся специфическими маркерами „„>,, - р-и, tHc ЯД,,д . .н, ц. онкологического риска у лиц, имеющих контакт с бензидином и/или веществами, co-, Д +2У, и -Я © 4г7R держащими его в структуре молекулы,. вй.-с6.- -к+ - г <=

НаПрИМЕр, С аНИЛИНОВЫМИ КраСИтЕЛяМИ.. Х= 1- Q-<Р-411г

Известен антиген, содержащий кова- Й.- г Ь- лентно присоединенный к овальбумину, Ы ! а

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4744299/05 (22) 16.08,89 (46) 30.04.93, Бюл. ¹ 16 (71) Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. M,Н.Петрова и Институт высокомолекулярных соединений АН СССР (72) Т.А.Коростелева, Е,Ф.Панарин, M.В.СОловский, О.В.Назарова, А.T,Áåëîõâîñòîâà и

Л.С.Потапенкова (56) Кэбот Е. и др, Экспериментальная иммунохимия. M.: Медицина, 1968, с, 533 — 536. (54) СОПОЛИМЕРЫ N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА, КРОТОНОВОЙ КИСЛОТЫ И и-KPQT0H0NJlAMNНОФЕНОЛА В КАЧЕСТВЕ

ПОЛИМЕРНОЙ ОСНОВЫ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА, СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ

N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА, КРОТОНОВОЙ

КИСЛОТЫ И и-КРОТОНОИЛАМИНОФЕНОЛА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИН ГЕТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА (57) Использование: при иммунологическом определении маркера онкологического риска — бензидин-белкового аддукта у людей.

Сущность изобретения: сополимер формулы I (CI-I,-СН );„-(- CI-I- СН Д СН- СН Р

2 2 де гп =- 88,5 моль%; и = 7,6 моль 1 = 3 9 моль%, На Основе сополимеРа I Готовят а тиген формулы II

+ C1-1> СН -) — - Сн -CH )- $ CHrn 1 1 Й

Сн С=0 Снз

1 1

Н. С вЂ” С Н ОН

2 — сн -)1

С=О

NH р -Д-(N N- - - Д « 2

ОН где m -= 88,5 моль%; и = 6,6 моль%; I = 3,9 молb%. Способ заключается в обработке 1 моля сополимера (1j 2,0-2,2 молями сернокислого бензидиндиазония в водном растворе при 0-5 С при рН 4,2-4.6. Повторно обрабатывают при рН 9,0 — 9,4. 2 и 3 c,ï. ф-лы, 1 табл. ОО

1812183 где Q — остаток протеина, например, овальбумина, альбумина.

Недостатком известного комплексного решения, направленного на получение синтетическбго антигена, содержащего ковалентно присоединенный бензидин в качестве гаптена, является необходимость использования белков сыворотки крови с

MM 68000, имеющих общевидовые с человеком антигены.

Иммунизация антигенами, содержащими бенэидиновый остаток, присоединенный к белку, неизбежно индуцирует антитела к общевидовым антигенам, что затрудняет качественную и.количественную интерпретацию конечных результатов определения бензидин-белковых антигенов, образующихся в организме.

Цель изобретения: — повйшенйе специфичности антигена и возможность качественного и количественного иммунологического определения образовавшихся в организме бензидин-белковых аддуктов.

Указанная цель достигается, во-первых, сополимерами N-винилнирролидонов, кротоновой кислоты и и-кротоноиламинофенола общей структурой формулы 1 где в = 88,5 MQRb%; и = 5,7-10,3 моль%;! =

1,2 — 5,8 моль7;; ММ 1100- 1.8 000; сополимер является макромолекулярным носителем гаптена в синтетическом.,антигене.

Указанная цель достигается, Во-вторых, синтетическим антигерои на основе. сополимеров Й-винилпирролидона, кротоновой кислоты и кротоноиламинофенола, в качестве гаптена содержащего ковалентно присоединенный бензидин, общей. структурной формулы И +сн -сн+ -(сн-сн сн-., 2, . т сН с=о снэ н сг с . 3 н с — сн . Он ! — сн-)-; с=о

NH

Hã -Q -N=NWm- )О Ъ

ОН

1 где m = 88,5 моль,, n = 5,7-10,3 моль ; I

1,2-5,8 моль7; MM =.11 000 — 18 000.

Указанная цель достигается, в-третьих, способом получения этого антигена, Способ реализуется следующей совокупностью специфических признаков.

Аминогруппы бензидина диазотируют с получением сернокислой соли диазония бензидина и проводят реакцию азосочетания сополимеров N-винилпирролидона, кротоно5 вой кислоты и и-кротоноиламинофенола с сернокислым бензидиндиазонием в водном растворе при Оо-+5ОС сначала в кислой (рН

4,2-4,6), а затем в щелочной (pH 9,0 — 9,4) среде. При этом молярные количества тер10 полимера (в расчете на кротоноиламинофенольную. группу) и сернокислой соли бензидина диазония составляют 1;2,0-2,2, Строение-терполимеров I доказано тит рованием карбоксильных групп 0,1 н.рас15 твором ИаОН, а также УФ-спектрами. В

УФ-.спектрах водных растворов терполимеров! имеется полоса поглощения с при 249 нм (я 14.000), характерная для и-замещенной фенольной группы и отсутствующая

20" в УФ-спектре исходных сополимеров винилпирролидона с кротоновой кислотой.

Строенйе антигенов It подтверждено .тйтрованием аминогрупп 0,1 н.раствором

НО, а также методом компенсационной

УФ-спектроскопии, В компенсационном спектре водных растворов антигенов II наблюдается интенсивная полоса поглощения с Я,„при 370 нм, характерная для q",оматических соединений, содержащих аэогруп30 Для лучшего понимания сущности изобретения приведены примеры его конкретной реализации.

Примеры на приготовление терполиме35 ров t, Пример 1. К раствору 0,015 кг сополимера N-винилпирролидона (ВП) с кротоновой кйслотой (КК), содержащему 11,5 мол.,4 КК, с молекулярной массой (MM)

40 11.000. в 0,052 л диметилформамида (ДМФА) добавляют при перемешивании раствор 1,25 "10 кг (0,38 М. на 1 М звена . КК) N,N -дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в 0,015 л ДМФА, Полученный раствор ох45 лаждают до 0-5ОС.в бане со льдом, затем к нему добавляют раствор 0,66. 10 кг(0,38

M на 1 М звена КК) п-аминофенола в 0,005 л

ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при 0-5 С 6,5 ч..Выпавшую дициклогексило

50 мочевину отфильтровывают на фильтре

Шотта, Фильтрат по каплям вливают при перемешивании в 3 л диэтилового эфира.

Выпавший полимер собирают на воронке

Бюхнера, промывают эфиром и высушивают

55 в вакууме. Выход: 14,8 10 зкг (98;1® терпо- лимера I (m - 88,5 моль. ф I - 1,2 моль, и

10,3 моль ).

П р. и м е р 2. В условиях примера 1 иа

0,015 кг сополимера ВП-КК с MM 18000, 1,46 о

1812183

10 кг (0,44 М на 1 М звена КК) ДЦК и 0,77

10 кг(0,44 на 1 м звена КК) и-аминофенола получают 0,0147 кг (96,3%) терполимера I (m

= 88,5 мол,%; n = 9,0 моль%; I = 2,5 моль%).

Пример 3. В условиях примера 1 из

0,015 кг сополимера ВП-КК, 1,64 10 кг (0,5 м на 1 м звена КК) ДЦК и 0,87 . 10 э кг (0,5 м на 1 м звена КК) и-аминофенола получают 0,0152 кг (95,2%) терполимера I (m =

88,5 моль%; и = 7,6 моль%; 1=.3,9 моль%).

Пример 4, В условиях примера из

0,015 кг сополимера ВП-КК, 0,0018 кг(0,55 м на 1 м звена КК) ДДК и 0 95 10 кг(0 55 м на 1 звена КК) и-аминофенола получают

0,0145 кг (94,5%) терполимера I (m = 88,5 моль%; n = 6,8 моль%; I = 4,7 моль%), Пример 5. В условиях примера 1 из

0,015 кг сополимера ВП-КК, 1,95 10 кг (0,6 м на 1 м звена КК) ДЦК и 1,03 10 кг (0,6 м на 1 м звена КК) и-аминофенола получают 0,0151 кг (96,4%) терполимера I (m =

88,5 моль%; n = 5,7 мольj; = 5,8 моль%).

Пример 6. В условиях примера 1 иэ

0,015 кг сополимера ВП-КК, 2,09 10 кг (0,64 м на 1 звена КК) ДЦК и 1,11 10 кг (0,64 м íà I м звена КК) и-аминофенола получают 14,9 10 кг (94,9%) терполимера (m = 88,5 моль%; n = 5 моль%; = 6,5 моль%), Пример 7, В условиях примера 1 из

0,015 кг сополимера ВП-44, 1,11 10 кг (034 мна 1мэвена КК)ДЦКи 058 10 кг (0,34 м на 1 м звена КК и-аминофенола получают 0,0145 кг (96,9%) терполимера (m =

88,5 моль%; n = 10,6 моль%; = 0,5 моль%).

К охлажденной до 0-5 С суспензии 1,74

10 кг бензидинсульфата в растворе 0,6 .

10 кг хлорида натрия в смеси 0,002 л концентрированной серной кислоты и 0,004 л дистиллированной воды по каплям при перемешивании добавляют охлажденный раствор 1,3 10 нитрита натрия в 0,015 л воды. Реакционную массу перемешивают 1 ч и получают прозрачный раствор соли диазония.лимонного цвета.

Пример ы по синтезу антигенов Ii.

Пример 8. 5,3 10 кг терполимера !, полученного по примеру 1, растворяют в

0,053 л дистиллированной воды. Раствор охлаждают до 0 С в бане со льдом и добавляют 0,005 л водного раствора сернокислого банзидиндиазония, приготовленного по описанной методике и содержащего 0,4 10 кг соли диазония. При помощи 40%-ного раствора Na0H рН реакционной массы доводят до значения 4,4. При этом значении . pH реакционный раствор перемешивают 1 ч при 0 С, затем добавлением 40%-ного раствора NaQH рН раствора доводятдо зна чения 9,2. Реакционную массу перемешивают при рН 9,2 2,5 ч при 0ОС, Продукт реакции, не выделяя из раствора, подвергают очистке диализом против воды в течение суток, Получают 0,25 л темно-вишневого водного раствора антигена II с концентрацией 0,0148 кг/л, т,е. получают 0,0037 кг (67,1% антигена Il (m = 88,5 моль%; n = 10,3 моль%; =1,2 моль%), который содержит3,7 мас.% бензидина, 5 агара Дифко, Для постановки РСК используДля иммунизации используют беспо10 родных кроликов-самцов разводки Рапполовского питомника весом 1,5-2,0 кг.

Кроликов иммунизируют водным раствором полученного антигена Il по следующей схеме:

40 консервируют борной кислотой и используютдля постановки реакций встречной иммунодиффузии в агаре и реакции связывания компонента (РСК).

Для постановки реакции преципитации в агаре используют 1% -ный водный раствор

45 ют готову,о гемолитическую сыворотку против зритроцитов барана и сухой комплемент. В качестве антигенов приме50 няют водные растворы антигена ll и гетерологичных азопротеинов, содержащих бенэидин, присоединенный к белкам человеческой сыворотки крови, Титрование антигенов проводят перед постановкой каждого опыта. Связывание комплемента проводят при объеме 0,5 10-5 л в платах, РСК ставят на холоду при+4 С(18 ч). Результаты испытаний, иммунсыворотки приведены в таблице. В графе А таблицы указаны один раэ в неделю внутрикожно в 10 точек вдоль спинного хребта на расстоянии

1,5 — 2 см от него в обе стороны (по 5 точек с каждой стороны) вводят 0,5 10 Э л водного

20 раствора антигена II вместе с 0,5 10 э л адьюванта Фрейнда; через неделю повторяют внутрикожное введение антигена II в той же дозе также в

10 точек спины;

25 через 2 недели вводят раствор антигена

II под обе лопатки подкожно и внутрибоюшинно в общей дозе 1,5 10 л; через 1,5 мес вводят раствор антигена !! по 0,5 IO л внутривенно через день три

30 раза в неделю. Кровь берут на 9-in день после последней инъекции. В дальнейшем кроликов реиммуниэируют через 3-4 мес, используя только внутривенное введение ан,тигена.

35 На следующий день посл взятия крови сыворотку отделяют от сгустка центрифугированием в течение 10 мин при 4009. Сыворотку концентрируют в 2 раза в целлофановых трубках под вентилятором, 1812183 содержания (моль%) антигена II в последних разведениях, дающих видимую реакцию преципитации в агаре с сыворотками крови интактных (контроль) и иммунизированных антигеном II кроликов, В графе Б таблицы указаны титры антител против бензидина в PCK.

Пример 9. В условиях примера 8 из

0,0053 кг терполимера 1 полученного но примеру 2, и 0,84 10 кг сернокислого бензидиндиазония получают 0,0036 кг (64%) антигена Ii (m = 88,5 моль%; и —; 9,0 моль%;

1 = 2,5 моль%) содержащего 7,3 мас.% бензидина.

По схеме, описанной в примере 8, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против бензидина приведены в таблице, Пример 10. В условиях примера 8 из

0,0053 кг терполимера 1, полученного по примеру 3, и 0,0013 кг сернокислого бензидиндиазония получают 0,0042 кг (70%) антигена II (m = 88,5 моль%, n = 7,6 моль%; i = 3,9 моль%), содержащего 10,9 мас.% бензидина, По схеме, описанной в примере 8, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном, Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против бензидина приведены в таблице.

Пример 11. В условиях примера 8 из

0,0053 кг терполимера 1, полученного по примеру 4, и 0,0014 кг сернокислого бензидиндиазония получают 0,0039 кг (65%) антигена И (m = 88,5 моль%; и = 6,8 моль%; 1= 4,7 моль%), содержащего 12,6 мас.% бензидина.

По схеме, описанной в примере 8, про водят иммунизацию кроликов полученным антигеном, Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против бензидина приведены в таб. лице.

ll р и м е р 12. В условиях примера 8 из .0,0053 кг терполимера I, полученного по примеру 5, и 1,6 10 кг сернокислого бензидиндиазония получают 0,0045 кг (72%) антигена II (m = 88,5 моль%; и = 5,7 моль%;

1- 5,8 моль®, содержащего 15 мас.% бензидина.

По схеме, описанной в примере 8, проводят иммунизацию кроликов пол,ченным антигеном. Результаты испытаний полученной иммунсыворотки на наличие и уровень антител против бензидина приведвны в таблице.

Пример 13 (контрольный). В условиях примера 8 из 0,0053 кг терполимера I, полученного по примеру 6, и 0,0018 кг сернокислого бензидиндиазония получают 0,0041 кг

5 (64%) интигена И (m = 88,5 моль%; n = 5 моль%; 1 = 6,5 моль%), содержащего 0,0164

° кг бензидина. Полученный антиген в воде не растворяется, поэтому иммунизацию кроликов этим антигеном не проводили.

10 Пример 14 (контрольный). В условиях примера 8 из 0,0053 кг термополимера 1, полученного по примеру 7, и 015 10 кг сернокислого бензидиндиазония получают

0,0032 кг (59%) антигена И (т = 88,5 моль%;

15 n = 10,6 моль%; I = 0,5 моль%), содержащего

0,0016 мас.% бензидина, По схеме, описанной в примере 8, проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Результаты испытаний получен20 ной иммунсыворотки показали, что в ней отсутствуют антитела против бензидина.

Как видно из данных таблицы, результаты испытаний иммунсывороток как в РСК, так и в реакции встречной иммундиффузии

25 в агаре, свидетельствуют о том, что иммуни- . зации кроликов антигенами И, полученными по примерам 8 — 12, может быть получена иммунсыворотка, содержащая антитела против бензидина как гаптена, Наиболее

30 высокий титр антител обнаружен в иммунсыворотке, полученной при иммунизации животных антигеном II (пример 10). Эта иммунсыворотка была использована как тестсистема при определении бензидина как

35 гаптена в сыворотке крови рабочих резиновой промышленности, в которой возможна экспозиция бензидином. При обследовании

130 рабочих наличие бензидин-белковых антигенов было обнаружено при помощи этой

40 сыворотки в крови 27 человек, Формула изобретения

1. Сополимер N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и п-кротоноиламинофенола формулы

< сн>-c H% 4cн- сн „(сн-сн - «Н

50 2 где m =88,5 мол,%„.

n = 5,7-10,3 мол.%;

1 " 1,2-5,8 мол.%

55 с мол.м 11000-18000, в качестве полимер-, ной основы синтетического антигена.

2. Синтетический антиген на основе сополимеров N-винилпирролидона, кротоно1812183

Антиген Н, моль ь

Результаты испытаний иммунсиво отрк

Содержание бензи-. дина м мас. g, А

Методом имнодифу зии в ага е

Метод

PCK

10,3

9,0

7,6

6,8

5,7

5,0

10,6

1,2

2,5

3,9

4,7

5,8

6,5

0,5

88i5

88.5

88,5

88,5

88,5

88,5

88,5

10,3

9,0

7,6

6,8

5,7 .

5,0

1,2

2,5

3,9

4,7

5,8

6,5

1:64

1: 128

1:32768

1: 512

1: 256

11,2 10

93 10

21,2 10в

22,4 105

23,1 10

Не опре3,1

7,3

10,9

12,6

15,0

16,4

88,5

88,5

88,5

88,5

88,5

88,5 деле но,т.к. антиген не растворим в воде

Нет анител против бензиина

88,5

1,6

Нет антител против бензиина

0,5

t0;6 (контрольный вой кислоты и и-кротоноиламинофенола фор у -,-с + сн-снрс.H ciNicyo сн c=o cH3 н2с — сн1 Он — сн-)с=о . ! нн н н-() ()-N N+i =Щ 1 -NH 3

QH где m = 88;5 мол.%;

n = 5,7 — 10,3 мол.%;

I = 1,2 — 5,8 мол. ь, с мол,м 13000 †200;

3, Способ получения синтетического антигена, включающий азосочетание полимера с солью бензидин-диазония в водном растворе, отл и ча ю щи йся тем,что,с целью повышения специфичности антигена и

Пример Терполимер 1, моль

2

4

6

7 .8, 9

11

12

13 (конт- рольный) возможности определения образовавшихся в организме аддуктов, в качестве сополимера используют сополимер N-винилпирролидона, кротоновой кислоты и п-кротоноиламинофе5 нола формулы