Способ определения концентрации сульфидов в физических средах

 

Изобретение относится к ферментному анализу и может применяться в химическом анализе, химико-технологическом анализе, для контроля загрязнения природных вод, почвы и атмосферы. Целью изобретения является повышение точности определения. В экспериментальную ячейку вносят биокатализатор с моноаминооксидаэной активностью , растворенный в буфере с рН 7-9, добавляют тирамин или серотонин, выдерживают полученную смесь, определяют активность фермента, вносят анализируемую пробу в смесь и повторно определяют активность фермента. После этого рассчитывают соотношение полученных величин активностей фермента и определяют концентрацию сульфидов в пробе по калибровочному графику . ел с Поставленная цель достигается тем, что в качестве ферментного препарата используют бмокатализатор с моноаминоксидазной активностью, рН буферного раствора составляет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирамин или серотоник. Повышение точности определения предложенным способом оказалось воз00 I о ел

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК,, Ж,, 1814065 А1 (я)э G 01 N 33/18

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4689469/13 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТ(22) 03,05.89 РАЦИИ СУЛЬФИДОВ В ФИЗИЧЕСКИХ (46) 07.05.93. Бюл. йв 17, СРЕДАХ (71) Научно-производственное объединение (57) Изобретение о носится к ферментному

"Биолар", Латвийский государственный анализу и может применяться в химическом университет им. П. Стучки и Институт мик- анализе. химико-технологическом анализе, робиологии им. А; Кирхенштейна для контроля загрязнения природных вод, (72) Д.Ю. Балцере, Б.А. Гринбер, А.П. Грин- почвы и атмосферы. Целью изобретения явберг, Е.Б. Никольская и M.M, Дианова ляется повышение точностиопределения. В (56) 1, Химический анализ воздуха промыш- . экспериментальную ячейку вносят биокаталенных предприятий, Химия, Ленинград, лизатор с моноаминооксидаэной активно1973, с. 398, стью. растворенный в буфере с рН 7 — 9, 2. Гершкович Е.Э., Методы определения добавляют тирамин или серотонин, выдервредных веществ в воздухе. Под ред. проф. живают полученную смесь, определяют акПерегуд Е.А., Л., 1968, с. 95. тивность фермента, вносят анализируемую

3. Лакшминараянайах Н, Мембранные пробу в смесь и повторно определяют активэлектроды, Л.: Химия, 1979, с. 317.. ность ферменте. После этого рассчитывают . 4. Бебешко Г.И., Олешко О,Н„ЖАХ," соотношение полученных величин активно1982; 37 М 4, 640-644. стей фермента и определяют концентрацию

5. Горностаева T.Ä., Пронин В.А., Семе- сульфидов в пробе по калибровочному гранов В.Я., Заводская лаборатория, 1Р83. 49: фику.

Ф 7; с. 14 — 16.

6. Gulens l., Herrlston Н.О., Anal. Chem.

Acta, 1982, 138, р. 55-83.

7. Gullbault G.G., Enrymatlc methods of

analyses, Oxfor0, Pergamon Press, 1970, р.

362.

8. Gullbault G.G., Brignac Р., Zlmnuer М., Anal. Chem., 1968, 40, р. 190.

ОО ф, 0 (Ь (Л

Изобретение относится к ферментному анализу и может применяться в химическом анализе, химико-технологическом анализе, для контроля загрязнения природных вод, почвы и атмосферы.

Целью изобретения является повышение точности определения концентрации сульфидов.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве ферментного препарата используют биокаталиэатор с моноаминоксидазной активностью, рН буферного раствора составляет от 7 до 9, в в качестве субстрата использую тирамин или серотонин.

Повышение точности определения предложенным способом оказалось воэ1814065 можным с применением биокатализатора с

МАО активностью. Ингибирующее действие сульфидов на МАО оказалось сильнее, чем на другие ферменты, в том числе на пероксидазу. Уже при концентрации HzS и сульфидов 1 10 M их ингибирующее действие вызывает заметное изменение ферментативной активности МАО. Применение фермента в иммобилизованной форме позволяет определить ферментативную активность препарата при повышенной температуре, обеспечивающей проявления наименьших изменений ферментативной активности.

Среда буфера с рН 7,0 — 9,0 оказалась. оптимальной для взаимодействия сульфидов с MAO. Данная область рН также обеспечивает смещение равновесия в процессе диссоциации Н25 в сторону образования, иона сульфида. Последний является ингиби -"уоррм фермента МАО, Степень ингибированйф МАО зависит от концентрации иона сульфида, следовательно, и от концентрации сероводорода. О степени ингибирования МАО судят по изменейиюферментативной активности в реакции о к ислител ь його деза мин и рова ния моноаминов, например тирамина, серотойина.

Применение двух субстратов позволяет определить сульфиды при любой концентрации их в исследуемой среде, Это особенно важно для контроля высоких содержаний анализируемого вещества, например, в промышленных сточных водах, илах и т.д. МАО активность препарата можно измерять любым методом определения активности этого фермента(по Конвею, электродом с газовым зазором и др.).

Использование предложенного способа не требует предварительной обработки мутных или окрашенных сточных вод. Коллоидный состав анализируемой пробы не влияет на точность результата анализа. Отсутствие предварительной обработки анализируемой пробы исключает ошибку из-за возможного связывания присутствующего сул ьфида.

В случае измерения активности MAO c помощью электрода с газовым зазором ошибка составляет +. 1, В предлагаемом способе объем анализа не влияет на точность результата. В случае высоких концентраций Н23 анализируют меньший объем исследуемой пробы. Это особенно важно при анализе воздуха в зонах очистных сооружений, при метановом брожении активного ила и в биогазах при анаэробном сбраживании сельскохозяйственных отходов, где концентрация сероводорода может достигать 1.

Способ заключается в следующем.

Определяется MAO активность иммобилизованного препарата по субстрату тирамину или серотонину. Ферментный препарат инкубируется с пробой, содержащей HzS или растворенный сульфид при заданном рН 7,0-9,0 s буфере. После инкубации определяется остаточная активность иммобилизованной MAO тем же.спо"0 собом определения активности. Находят соотношейие ферментативных активностей

6>/9 и далее Ig 6 /9. По калибровочному графику соответствующего субстрата при данной температуре инкубации находят концентрацию сульфида в анализируемой пробе.

Пример 1.

Определение исходной МАО активности.

0.4 г биокатализатора с МАО активностью согласно авт. свид. М 1146322 помещают в ячейку, которую на 10 мин помещают в

001 М фосфатный буфер с рН 7,0. Затем ячейку с ферментным препаратом перено25 сят в.термостатируемый сосуд электрода с газовым зазором. Туда же заливают реакци. оннуЮ смесь: 0,1 M фосфатного буфера 3 мл (рН 7,0) и 1 мл субстрата — серотонина с концентрацией 4 10 М (концентрация в пробе 1.10 M). В течение 10 мин через раствор пропускают кислород при постоянном перемешивании. Далее поток перекрывают и герметически закрытый сосуд . выдерживают 50 мин при 20"С с интенсив35 ным перемешиванием. После инкубации . ферментсодержащую ячейку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г H CI. закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, íà поверхйость которого помещена капля 0,2%-ного

40. раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают 02 без COz и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 М NaOH (pH 12) для полного освобождения аммиака. После ус45 тановления постоянного потенциала(рН) на электроде (20 мин) записывают показания потен циометра (р Н-метра).

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом и определение остаточной

50 ферментной активности, . Ячейку с ферментным препаратом пере носят из буферного раствора в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора йаг$ с концентрацией 4,6.10 M и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7 0.

Инкубируют при перемешивании.

Затем ячейку с ферментом переносят в буфер для промывания и определяют остаточную МАО активность.

1814065

Для анализа используют тот же метод и те же условия, что для анализа исходной

МАО активности.

Находят соотношение показаний по- . тенциометра при анализе исходной и оста- 5 точной активности, что является величиной

6 /9, равной 1,33. Потом находят Ig 6 /6, равный 0,12. По калибровочной кривой в координатах Ig %/9 -l(t) с использованием серотонина в качестве субстрата находят 10 концентрацию сульфида 23.10 моль/л 10 мин. Разделением данной величины на 10 находят концентрацию сульфида в анализируемой пробе, т.е. 2,3 10 М, Пример 2.. 15

Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом.

Ячейку с 0,4 r ферментного препарата 20 переносят из буферного раствора с рН 8,0 в анализируемый раствор следующего соста- " ва: 5 мл раствора сульфида натрия с концентрацией4,6 10 Ми5мл0,01 Мфосфатного буфера с рН 8,0. Инкубируют при переме- 25 шивании.

"- Определение остаточной MAO активности аналогично исходной MAO активности.

Находят соотношение 6О/Й, равной 3,9, и далее 19 Оо/Й 0,59. 30

flo калибровочной кривой с использова-. йием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2,3 10 М.

Пример 3.

Определение исходной МАО активно-. сти аналогично примеру 1.

Взаимодействие ферментного препара- . та с сульфидом, Ячейку с 0,4 г ферментного препарата переносят из буферного раствора с рН 9,0 в 40 анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора йа23 с концентрацией

4,6 10 и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 9,0. Инкубируют в пробе йри перемешивании, Затем ячейку с ферментным препа- 45 ратом переносят в буфер для промывания и . определяют остаточную МАО активность аналогично определению исходной МАО активности. Находят соотношение 6 /@, равное 12,1, и далее Ig О„/о1, равный 1,08, 50

По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2,3 10 3 M.

Пример 4.

Определение исходной MAO активности аналогично примеру 1, Ячейку с ферментсодержащим препаратом переносят из буферного раствора с рН

9,0 в анализируемый состав: 5 мл раствора

NazS с концентрацией 4 10 M и 5 мл буфера с рН 9,0, Инкубируют с ферментным препаратом при перемешивании. Определяют остаточную МА0 активность и находят соотношение 4/9, равное 11,8, и далее определяют Ig 0

По калибровочной кривой с использованием-тирамина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2 10 М.

П ример 5.

Определение сульфидов в сточных водах.

--Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1, Анализируемый состав: 5 мл сточных вод, 5 мл буфера с рН 8,0. Инкубированйе с ферментным препаратом проводят при перемешивзнии в течение 60 мин при 20ОС, Соотношением/Й равно 1,1, Далее определяют 1о 6,/Й, равный 0,04.

По калибровочной кривой с использованием тирамина определяют концентрацию сульфидов, равную 1 10 5 М.

Формула изобретения

Способ определения концентрации сульфидов в физических средах. и редусматривающий отбор пробы среды, внесение ферментного препарата, растворенного в буфере в экспериментальную ячейку, добавление субстрата. выдерживание полученной смеси, определение активности ферментного препарата, последующее внесение ана-. лизируемой пробы в реакционную смесь и повторное определение активности ферментного препарата, расчет соотношения полученных величин активностей фермент-. ного препарата и определение концентрации сульфидов по калибровочному графику, о т л и ч а io шийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве ферментного препарата используют биокатализатор с моноаминооксидазной активностью. рН буферного раствора составляет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирамин или серотонин.