Способ консервирования эмбрионов млекопитающих

 

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - удлинение сроков хранения эмбрионов. Эмбрионы помещают в среду Дьюльбекко, содержащую 10%-ную сыворотку плодов коров и охлаждают до 5°С. Затем добавляют охлажденную до 5° фракцию эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика молекулярной массы 1- 10 кД до концентрации 0,12-0,20 г/л среды и хранят при 5°С трое суток. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

rsi)s А 01 и 1/02

ГОСУДАРСТВЕН ЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР фОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

И рации материал лиофилизировали и хранили в герметичных ампулах при -20 С.

Пример 1. Эмбрионы мышей на стадии морулы вымывали при комнатной температуре средой Дюьльбекко (4), содержащей 10 -ную эмбриональную сыворотку коров. На этой же среде готовили фракцию эпителия тонкого кишечника (ФЭ) зимоспящего суслика с добавлением эмбриональной сыворотки.

40 эмбрионов разделили на две группы по 20 эмбрионов в каждой. Эмбрионы каждой группы помещали в стеклянную ампулу, содержащую 0,5 мл среды Дюльбекко и 10 эмбриональной сыворотки. Ампулы с эмбрионами первой опытной группы охлаждали ступенчато от комнатной (+20 С) температуры+50С, понижая температуру на 5, и выдерживали при данной температуре в течение 5 мин. Аналогично охлаждали 0,5 мл фракции (1-10 кР), выделенной из эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика. рН ФЭ был в пределах рН среды Дюльбекко с добавкой 10 -ной эмбриональной

1 (21) 4947401/14 (22) 26.06.91 (46) 15.06.9З.Бюл. М 22 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) В.И;Грищенко, Н.А.Лучко, В.И.Загнойко, С.Г.Колаева и Л.И.Крамарова (66) Авторское свидетельство СССР

ht 1737783; кл. А 01 N 1/02, 1991. (54) СПОСаБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРЙОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Изобретение относится к криобиологии. и может быть исйользовано в экспериментальной репродуктологии.

Целью изобретения является удлинение сроков хранения эмбрионов.

Поставленная цель достигается тем, что среде консервирования вмято химического протектора. моноэтилового эфира глицерина используют биологический = низкомолекулярную (1-10 кД) фракцию.эпителия тонкого кишечника. зимоспящего суслика в концентрации 0,12-0,20 гр/л среды.

Выделение фракции производили по из-

: вестной, методике (3): на первом этапе ацетоновый: гомогенат: ткани цеюрифугировали в течение 30 мин при

3000g, осадок лиофилизировали в IM уксусной:кислоте и центрифугировали 1 час при

40009..Полученный центрифугат подвергали последовательно ультрафильтрации через фильтры Халипор.-4 (Эстония) и UM-2 (Amlcon-USA). Получали фракцию молекулярной массы 1-10 кО. После ультрафильт Ы2, 1821 I 18 А1 (57) Изобретение относится к криобиологии.

Цель изобретения — удлинение сроков хранения эмбрионов. Эмбрионы помещают в среду Дьюльбекко, содержащую 10 -ную сыворотку плодов коров и охлаждают до

5 С. Затем добавляют охлажденную до 5 фракцию эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика молекулярной массы 110 кД до концентрации 0,12-0;20 г/л среды и хранят при 5 С трое суток. 5 табл.

1821118 сыворотки, ФЗ капельно добавляли в соотношении 1:1 к охлажденным эмбрионам. Конечная концентрация ФЭ составляла 0,12, г/л. После герметизации ампулы хранили при 5 С в течение 24, 48 и 72 часов. К эмбрионам второй, контрольной группы добавляли при комнатной температуре среду

Дюльбекко, содер>кащую 10; -ную эмбриональную сыворотку, ступенчато охлаждали от комнатной температуры до 5 С, понижая температуру на 5 С и выдерживая при ней в течение 5 мин, После этого охлажденные эмбрионы-ступенчато отогревали на водяной бане, повышая температуру на 5 каждые 5 мин, Затем эмбрионы при комнатной температуре переносили в культуральную среду Виттена, где культивировали в течение 24 часов до выхода в бластоцисту (5), Сохранность эмбрионов контрольной группы составила 97,8 j .

Эмбрионы опытной группы после хранения в герметически закрытых ампулах ступенчато отогревали в водяной бане, повышая температуру на 5 и выдерживая при каждой по 5 мин. Ампулы вскрывали стерильно и отмывали от ФЭ трехступенчато, добавляя к одной капле исходного раствора

10 капель среды Дюльбекко с эмбриональной сывороткой через каждые 3 мин. После этого эмбрионы опытной группы выдерживали 10 мин в культуральной среде и проводили культивирование в среде Виттена в атмосфере тройного газа (5;ь С02, 90 $ Н2 и

5$ 02) при 37 С в течение 24 часов до выхода в бластоцисту. Эмбрионы опытной группы развивались подобно контрольной. В табл.1 представлена сохранность эмбрионое после различных сроков хранения, результаты в сравнении с прототипом.

Из таблЛ следует, что заявляемый.способ позволяет хранить эмбрионы на 1 сутки дольше без снижения их сохранности.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1. за исключением того, что среда хранения содержала различные концентрации ФЭ. Во всех случаях сохранность эмбрионов определяли по их развитию а культуре до стадии бластоцисты.

Результаты представлены в табл.2, Из табл, 2 видно, что наилучшие результаты достигаются при использовании ФЗ в концентрации 0,12-0,20 г/л среды.

Пример 3. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что среда хранения содержали ФЭ с различной молекулярной массой. Результаты представлены в табл.3.

Из табл.3 видно, что высокую сохранность эмбрионов обеспечивает ФЭ молекулярной массы 1-10 к0.

Пример 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в среде хранения испольэовали ФЗ сусликов Otellus undulatus не в период спячки, а в период бодрствования. Результаты представлены в табл.4.

Из табл.4 видно, что при использовании в среде ФЗ, полученной у сусликов в период бодрствования, сохранность резко снижа10 „,„.

Пример 5. Изучали влияние ФЭ молекулярной массы 1-10 кО на угнетение биосинтеэа белка при гипотермической хранении и степень его последующего восста.15 новления, Первую группу, содержащую 10 эмбри- онов, после вымывания помещали в среду

Дюльбекко с содержанием 10 g,-ной эмбриональной сыворотки и проводили изотоп20 ный анализ. Эта группа была контрольной.

Вторая группа; содержащая также 10 эмбрионов в среде Дюльбекко с эмбриональной сывороткой была контрольной по отношению к эмбрионам, хранившимся 24, 48 и 72

25 ч в среде, содержащей ФЭ.

Стеклянные ампулы заполняли 0,5 мл среды Дюльбекко с 10 -ной эмбриональной сывороткой, после чего вносили эмбрионы.

30 Ампулы с эмбрионами ступенчато охлаждали от комнатной температуры (+20 С) до +5 С с выдержкой при данной температуре в течение 5 мин. Охлаждение 0,5 мл ФЭ проводили аналогично, При +5 C в ампулу с

35 эмбрионами капельно в соотношении 1;1 . добавляли 0,25 мг/л ФЭ. После отогрева на водяной бане и удаления ФЭ осуществляли, изотопный анализ сразу и после дополнительного культивирования в среде Виттена

40 при 37 С в атмосфере тройного газа (57, СО2, 5$ 02, 90 Nz). Проведение анализа осуществляли следующим образом. Эмбрионы (10 шт) помещали в 0,5 мл среды BSM (5), содержащей 3H - лейцин (в дозе 10 мккИ, 45 радиоактивность 1 мКи, ЧССР) и инкубировали при 37 >С в течение 3 часов. Затем промывали холодной средой, содержащей лейцин. Разрушали эмбрионы путем 10кратного их замораживания и оттаивания. -0 Осаждение белков осуществляли при +4 С путем добавления 2 мл холодного ТХУ и последующего помещения на лед íà 15 мин.

Белки, осажденные на фильтрах, промывали 5 мл .холодного 70 -ного спирта. Для

55 окончательного высушивания фильтров их выдерживали 10 мин при 50 С. Активность биосинтеза определяли с помощью счетчи. ка, помещая фильтр в 14 мл жидкого сцинтиллятора. В табл.5 приведены результаты

onытов.

1821118

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Результаты, приведенные в табл. 5, свидетельствуют о полном восстановлении биосинтеза белка эмбрионов в культуре после гипотермического хранения в течение 24,48 и 72 часов.

Заявляемый способ консервирования позволяет хранить эмбрионы млекопитающих в течение 72 часов в среде, не содержащей химических агентов, что исключает генетическое изменение эмбрионов в процессе их развития.

Формула изобретения

Способ консервирования эмбрионов млекопитающих, включающий экспозицию их при 5ОС в среде Дюльбекко содержащей

5 эмбриональную сыворотку плодов коров и протектор, отличающийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения эмбрионов, в качестве протектора используют фракцию эпителия тонкого кишечника зи10 моспящего суслика мол.мас.1-10 кД в концентрации 0,12-0,20 г/л среды.

1821118

Таблица 4

Таблица 5

Составитель Л.Фоменко

Техред М.Моргентал Корректор М.Керецман

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 2074 Тираж,: Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям ври ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Рэушская наб.; 4/5